Dieses Protokoll beschreibt einen Test für die Charakterisierung der Lipidtröpfchenbildung (LD) bei menschlichen Darmorganoiden bei Stimulation mit Fettsäuren. Wir diskutieren, wie dieser Assay für die Quantifizierung der LD-Bildung verwendet wird, und wie er für ein Hochdurchsatz-Screening für Medikamente verwendet werden kann, die die LD-Bildung beeinflussen.
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Methodenartikel
Ein fluoreszenzbasierter Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung der Lipidtropfenbildung bei menschlichen Darmorganoiden
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Diätetische Lipide werden vom Darmepithel als freie Fettsäuren (FAs) aufgenommen. Diese FAs werden intrazellulär in Triglyceridmoleküle (TG) umgewandelt, bevor sie in Chylomikron für den Transport zur Lymphe oder in zytosolische Lipidtröpfchen (LDs) zur intrazellulären Lagerung verpackt werden. Ein entscheidender Schritt für die Bildung von LDs ist die katalytische Aktivität von Diacylglycerol-Acyltransferasen (DGAT) im letzten Schritt der TG-Synthese. LDs sind wichtig, um toxische Lipidarten zu puffern und den Zellstoffwechsel in verschiedenen Zelltypen zu regulieren. Da das menschliche Darmepithel regelmäßig mit hohen Lipidkonzentrationen konfrontiert wird, ist die LD-Bildung von großer Bedeutung, um die Homöostase zu regulieren. Hier beschreiben wir einen einfachen Test zur Charakterisierung und Quantifizierung der LD-Bildung (LDF) bei Stimulation mit der häufigsten ungesättigten Fettsäure, Ölsäure, bei menschlichen Darmorganoiden. Der LDF-Test basiert auf dem LD-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff LD540, der die Quantifizierung von LDs durch konfokale Mikroskopie, Fluoreszenzplattenleser oder Durchflusszytometrie ermöglicht. Der LDF-Assay kann verwendet werden, um die LD-Bildung in menschlichen Darmepithelzellen zu charakterisieren oder menschliche (genetische) Störungen zu untersuchen, die den LD-Stoffwechsel beeinflussen, wie DGAT1-Mangel. Darüber hinaus kann dieser Assay auch in einer Hochdurchsatz-Pipeline verwendet werden, um neuartige therapeutische Verbindungen zu testen, die Defekte in der LD-Bildung bei Darm- oder anderen Organoiden wiederherstellen.
Einleitung
Lipide sind ein entscheidender Bestandteil der menschlichen Ernährung und spielen eine wichtige Rolle bei der systemischen Energiespeicherung und dem Stoffwechsel. Bei der Aufnahme werden diätetische Lipide durch Bauchspeicheldrüsenlipasen zu freien Fettsäuren (FFAs) und Monoglyceriden (MGs) abgebaut. Diese Substrate werden dann von den Enterozyten des Darmepithels aufgenommen, wo sie zunächst durch Monoglycerid-Acyltransferasen (MGAT)-Enzyme zu Diglyceriden (DG) und anschließend zu Triglyceriden (TG) durch Diacylglycerin reesterifiziert werden. Acyltransferase 1 (DGAT1)1. Schließlich sind diese TGs entweder in Chylomicrons für den Export in da....
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Protokoll
Alle Hierbeschriebenen mit menschlichen Geweben wurden von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Utrecht (UMCU) genehmigt. Die informierte Zustimmung zur Gewebeentnahme, -erzeugung, -speicherung und -verwendung der Organoide wurde von Patienten der Wilhelmina-Kinderklinik (WKZ)-UMCU eingeholt.
1. Vorbereitung von Kulturmedien
HINWEIS: Dieses Protokoll sollte in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Die Organoide sollten nach Standard-Zellkulturrichtlinien behandelt werden.
- Bereiten Sie Basalkultur Medium.
HINWEIS: Kulturmedium ohne Wachstumsfaktore....
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Ergebnisse
Für eine ordnungsgemäße Analyse der LD-Bildung sollten die Organoide vor der Stimulation mit OA und anschließender Färbung nicht zu dicht gesät werden. Dies ist besonders wichtig für die Konfokal- und Plattenleser-Auslesung, da überlappende Organoide die Fluoreszenz stören könnten. Ein Beispiel für die richtige organoide Saatdichte (Abbildung 1A) und eine Kultur mit überlappenden Organoiden wird gezeigt (Abbildung 1
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Diskussion
Hier stellen wir ein Protokoll zur Bestimmung der LD-Bildung bei menschlichen Darmorganoiden bei der Inkubation mit Ölsäure zur Verfügung. Diese Methode basiert auf dem LD-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff LD54018, der eine Charakterisierung und Quantifizierung des Gesamtvolumens von Lipidtröpfchen innerhalb einer organoiden Kultur ermöglicht. Die Verfahren zur Etablierung und Erhaltung menschlicher Darmorganoidkulturen wurden vor13veröffentlicht, und ein visueller Leitfade.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken B. Spee für die großzügige Bereitstellung von LD540. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) an S.M.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 Ergänzung | Gibco | 17504-044 | |
| Basalmembran-Matrix (Matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1-Inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fettsäurefrei BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyd | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100x) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | Leica | SP8X | |
| LD540 | freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. B. Spee, Universität Utrecht | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin-produzierende Zellen (HEK293-mNoggin-Fc-Zellen) | MTA mit J. den Hertog, Hubrecht | ||
| Institute Ölsäure | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK-Inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS ohne Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5.000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-Spondin-produzierende Zellen (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Zellen) | R& D systems | 3710-001-01 | |
| TC-behandelte 24-Well-Platten | Greiner-One | 662160 | |
| TC-behandelte schwarze 96-Well-Platten mit klarem Boden | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb Typ I Rezeptor-Inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A-produzierende Zellen (L-Wnt-3A-Zellen) | MTA mit J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 Dihydrochlorid (Rho-Kinase-Inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
Referenzen
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V.
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Nachdrucke und Genehmigungen
