Um die Wirkung eines Chemokins auf die Makrophagenrekrutierung in vivo zu testen, wurde die gesamte Mount-in-situ-Hybridisierung verwendet, um die ektopische Expression des Chemokins zu erkennen, und Immunstaining wurde verwendet, um Makrophagen zu kennzeichnen. Live-Bildgebung wurde für die Echtzeitbeobachtung der Makrophagenmigration verwendet.
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Methodenartikel
Ein ektopisches Chemokin-Expressionsmodell zum Testen der Makrophagenrekrutierung in Vivo
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zebrafische sind weit verbreitet in der Grundlagen- und biomedizinischen Forschung verwendet. Viele transgene Zebrafische sind derzeit verfügbar, um verschiedene Arten von Zellen zu kennzeichnen. Aufgrund des transparenten embryonalen Körpers von Zebrafischen ist es für uns bequem, die Wirkung eines Chemokins auf das Verhalten einer bestimmten Art von Zellen in vivo zu untersuchen. Hier haben wir einen Workflow zur Untersuchung der Funktion eines Chemokins zur Makrophagenmigration in vivo bereitgestellt. Wir konstruierten ein gewebespezifisches Überexpressionsplasmid, um IL-34 zu überexpressen und injizierten das Plasmid in transgene Fischembryonen im Einzellstadium, deren Makrophagen speziell durch ein fluoreszierendes Protein gekennzeichnet wurden. Wir verwendeten dann ganze Mount-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung und Immunostaining, um das Muster der Chemokin-Expression und die Anzahl oder Position von Makrophagen zu erkennen. Die injizierten WT-Embryonen wurden erhöht, um eine stabile transgene Linie zu erzeugen. Schließlich verwendeten wir konfokale Live-Bildgebung, um das Makrophagenverhalten in den stabilen transgenen Fischen direkt zu beobachten, um die Funktion von IL-34 auf Makrophagen in vivo zu untersuchen.
Einleitung
Zebrafisch ist ein kleiner tropischer Süßwasserfisch aus Indien. In Bezug auf die Generhaltung haben Zebrafische eine Ähnlichkeit von 87% mit dem Menschlichen1. Es kann uns Einblicke zu verwandten Themen des Menschen geben, indem es die Genregulation, Proteinfunktion und Zellverhalten wie Migration, Proliferation et.al in Zebrafischen untersucht. Zebrafisch-Embryo kann verwendet werden, um die Entwicklung von frühen Embryonen in verschiedenen Stadien nach der Hemmung des Pigments zu beobachten. Inzwischen dauert es nur drei Monate, bis sich Zebrafische zu einer Geschlechtsreife entwickeln, dann kann der Zebrafisch alle 4 Tage Hunderte von Eiern....
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Protokoll
HINWEIS: Alle Proben wurden mit Phenylthiourea (PTU) Eiwasser behandelt, um Pigment zu hemmen.
1. Erzeugung von Tg (fabp10a:il34) Transgene Konstrukte und Fischinjektion
- Klonen Sie den 2.8 kb fabp10a-Promotor 8 und die IL-34-Kodierungsbereiche (ENSDART00000126460.3) von Zebrafischen in den pTol2-Vektor, um das fabp10a-il34-Konstrukt zu erzeugen. Injizieren Sie die Konstrukte in einZellstadium Tg (mpeg1: GFP) und WT-Fischembryonen zusammen mit der Transposase mRNA. Erhöhen Sie die fabp10a-il34 injizierten WT-Embryonen auf Erwachsene
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Ergebnisse
Die Schritte im Protokoll der Zebrafische sind in Abbildung 2dargestellt. Zuerst haben wir das pBLK-fabp10a-il34-sv40 Konstrukt generiert, in dem il34 vom promotorium enwerter Bauart "fabp10a" angetrieben wurde (Abbildung 2). Das Konstrukt wurde mikroinjiziert in ein-Zell-Stadium Tg (mpeg1: GFP) Zebrafisch-Embryonen, die Makrophagen mit GFP- und WT-Embryonen kennzeichnen können, die zu Erwachse.......
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Diskussion
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es uns, die Funktion eines Chemokins auf das Verhalten von Macrophagein vivo zu untersuchen, und das Verfahren erfordert einige technische Servierkenntnisse. Zusammenfassend gibt es mehrere kritische Schritte, um Komplikationen im Protokoll zu vermeiden: 1) Wählen Sie eine geeignete transgene Linie, die spezifisches und starkes transgenes Signal zeigt, um die Zelle von Interesse zu kennzeichnen; 2) wählen Sie ein geeignetes Gewebe, das für die Bildgebung und transgene Genüberexp.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken Dr. Jingrong Peng für die gemeinsame Nutzung der transgenen Tg-Linie (fabp10a: DsRed); Dr. Zilong Wen für die gemeinsame Nutzung der transgenen Tg(mpeg1: GFP) Dr. Koichi Kawakami für die Bereitstellung des pTol2-Vektors. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31771594), Guangdong Science and Technology Plan Projects (2019A030317001) und den Fundamental Research Funds for the Central Universities (D2191450) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Antikörper | |||
| Alexa 488-Anti-Goat Antikörper | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | Perkinelmer | NEF832001EA | |
| Ziegen-Anti-GFP-Antikörper | Abcam | ab6658 | |
| Reagenz | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanin 3 Plus Amplifikationsreagenz | Perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 Lösung | 15 mM NaCl +0,5 mM KCl +1,0 mM MgSO4+150 µ M KH2PO4 + 50 µ M Na2HPO4 +1,0 mM CaCl2 + 0,7 mM NaHCO3 | ||
| Fötales Rinderserum (FBS) | Life | 10099-133 | |
| Formamid-Diamant | A100314 | ||
| Glycerin | Sigma | V900860 | |
| Heparin-Natrium | Sigma | H3149 | |
| Hybridisierungspuffer (HB) | 50% Formamid + 5-fach; SSC+9 mM Natriumcitrat+50 μ g/ml Heparin-Natrium+ 500 μ g/mL tRNA+ 0,1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Niedrigschmelzende Agarose | Sigma | A9414 | |
| Methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| Methylenblau | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma | 158127 | Suspendieren Sie 16 g PFA in 400 ml 1x PBS, erhitzen Sie bei 60 μg; C zum Auflösen ca. 30 min. Diese Lösung kann im Voraus zubereitet und bei -4 °C gelagert werden. Achtung. Mit Maske bearbeiten. |
| 10 mal; PBS | 14,2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2,4 g KH2PO4 in 1L ddH2 | ||
| O Phenylthiharnstoff (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1&fach; Plus Amplifikationsverdünnungsmittel | Perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20&fach; Salzhaltiges Natriumcitrat (SSC) | g NaCl+ 88,2 g Natriumcitrat in 1 L ddH2O, PH 7,0 | ||
| Natriumcitrat | Sigma | A5040 | |
| Tricain | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | Für Tg (fab10a:il34) transgene Liniengenerierung | ||
| pBSK-il34 | Für il34Sondenvorbereitung | ||
| Fisch | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Markierung von Makrophagen mit GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Markierung von Leberzellen mit DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Überexpression von IL-34 in Leberzellen |
Referenzen
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the....
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Nachdrucke und Genehmigungen
