Das Verfahren und die Verwendung von Tierkörpern wurden vom Nationalen Institut für Gesundheit für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt. Dieses Protokoll ist speziell für die Tests der mittleren Zerebralen Arterienverschluss/-reperfusion (MCAO/R) und der sensorimotorischen Funktion angepasst.
1. Experimentelles Design und Gruppierung
- Verwenden Sie ein Mratten-MCAO/R-Modell, um eine ischämische Methode des Rattengehirns mit schwereren Hirnverletzungen und einem höheren Modellerfolgsverhältnis mithilfe von Longas Punktzahl und TTC-Färbung zu überprüfen.
- Führen Sie das Experiment an männlichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 260 bis 330 g durch, die 7 bis 9 Wochen alt sind. Das reale Rattengewicht beträgt 275 x 15 g für 275 g, 300 x 10 g für 300 g und 320 x 10 g für 320 g.
- Verwenden Sie die folgenden sieben Gruppierungen (Gewicht, Gewindeschraubentyp, Infarktzeit): Gruppe 1 mit 15 Ratten (275 g, 2636, 2 h); Gruppe 2 mit 15 Ratten (275 g, 2636, 3 h); Gruppe 3 mit 15 Ratten (275 g, 2838, 2 h); Gruppe 4 mit 15 Ratten (275 g, 2838, 3 h); Gruppe 5 mit 13 Ratten (300 g, 3040, 3 h); Gruppe 6 mit 10 Ratten (320 g, 3040, 3 h); Gruppe 7 mit 13 Ratten (300 g, 3043, 3 h).
- Untersuchen Sie den Erholungsstatus des Gehirns durch TTC-Färbung und verwenden Sie geeignete sensorimotorische Funktionstests, um die langfristigen funktionellen Defizite durch den bilateralen Asymmetrietest, den Grid-Walking-Test, den Rotarod-Test und den Hebeseiltest nach 1, 35, 60, 90 Tagen MCAO/R anzuzeigen.
- Verwenden Sie männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 300 x 10 g, die 8 bis 9 Wochen alt sind.
- Verwenden Sie die folgenden fünf Gruppierungen: eine Kontrollgruppe (normale) Gruppe mit 20 Ratten; eine 1-Tages-Gruppe mit 16 Ratten; eine 35-Tage-Gruppe mit 16 Ratten; eine 60-Tage-Gruppe mit 17 Ratten; und eine 90-Tage-Gruppe mit 19 Ratten.
- Nach der Longa-Punktzahl in Schritt 1.1 oder sensorimotorischen Funktionstests in Schritt 1.2 alle Ratten für die TTC-Färbung zu beanstanden und zu enthaupten.
2. Einführung eines einseitigen MCAO/R-Modells bei Ratten9
HINWEIS: Verwenden Sie während der Operation die Mikrozange vorsichtig, um einen Bruch des Blutgefäßes zu verhindern. Vermeiden Sie Schäden an den Nerven und anderen Blutgefäßen im Hals der Ratte, wenn das Gefäß isoliert ist. Es muss darauf geachtet werden, dass für alle chirurgischen Überlebensoperationen eine geeignete aseptische Technik vorliegt. Die später im Video dargestellte Technik sollte während des gesamten Verfahrens geübt werden.
- Während der gesamten Operation die Körpertemperatur der Ratten in einem Kleintierthermostat bei 37,0 °C bei 0,5 °C halten. Bereiten Sie vier 6 cm 5-0 Nähte.
- Stellen Sie die Sauerstoffdurchflussrate einer Kleintieranästhesiemaschine (mit einer Abgasbehandlungsvorrichtung) auf 0,4,6 l/min und die Konzentration von Isofluran auf 5 % fest. Legen Sie die Ratte in die Anästhesiemaschine.
- Nachdem das Tier ohnmächtig geworden ist, legen Sie die Ratte auf einen chirurgischen Fixiertisch. Verbinden Sie den Mund der Ratte mit der Maske der Anästhesiemaschine (die Sauerstoffdurchflussrate bleibt unverändert; stellen Sie die Konzentration von Isofluran auf 3%) ein. Bestätigen Sie, dass das Tier in tiefe Anästhesie eingetreten ist, indem es einen Mangel an Extremitätsspannung, Hornhautreflexen und Schmerzen beobachtet hat.
- Befestigen Sie die Gliedmaßen, um mit Papierverbänden (oder anderen Werkzeugen) auf dem Operationstisch zu liegen.
- Entfernen Sie den Nackenmantel mit einem elektrischen Rasierer und sterilisieren Sie mit 75% Alkohol (Iodophor ist besser). Fixieren Sie den Mund der Ratte mit einem Haken.
- Mit einer Augenschere 2 x 3 cm entlang der zentralen Längsform des Halses schneiden.
- Trennen Sie die gemeinsame Halsschlagader. Trennen Sie den subkutanen Muskel mit ophthalmologischen Zangen. Verwenden Sie hausgemachte Retraktor, um das Feld der Vision vollständig zu entlarven. Nach der Trennung des vorderen Muskels der Luftröhre mit ophthalmologischen Zangen, trennen Sie entlang der rechten sternocleidomastoiden Sehne, bis die gemeinsame Karotisarterie sichtbar ist.
- Isolieren Sie die gemeinsame Halsschlagader, die äußere Halsschlagader und die innere Halsschlagader mit ophthalmologischen Zangen. Ligate die gemeinsame Halsschlagader (harter Knoten), externe Halsschlagader weit vom Herzende (harter Knoten) und innere Halsschlagader (lockerer Knoten) mit 5-0 Nähten. Die äußere Halsschlagader in der Nähe des Herzendes mit 5:0 Nähten aussanlassen.
- Legen Sie eine Gewindeschraube ein. Schneiden Sie eine kleine Öffnung in der äußeren Halsschlagader mit einer Augenschere und legen Sie vorsichtig eine Gewindeschraube ein. Ligate die Naht der äußeren Halsschlagader, die in losem Knoten gewesen ist und schneiden Sie die äußere Halsschlagader.
- Lösen Sie den losen Knoten der inneren Halsschlagader und setzen Sie den Fadenbolzen am Anfang der mittleren Hirnarterie (Nähte markiert) ein. Schneiden Sie dann die freiliegende Gewindeschraube ab.
- Nachdem die ischämische Zeit erreicht ist (2-3 h), fixieren Sie den Bruch der äußeren Halsschlagader mit einem Mikrozange, und ziehen Sie den Fadenbolzen vorsichtig mit einem anderen Mikrozange heraus. Wenn das vordere Ende der Gewindeschraube vollständig aus der inneren Halsschlagader entfernt wird, ligate die externe Halsschlagader, die mit 5-0 Nähten ausgekleidet war, und ziehen Sie dann die Gewindeschraube vollständig heraus.
- Lösen Sie die gemeinsame Halsschlagader, und daub 50.000 U Penicillin Natriumpulver auf der Oberfläche der Wunde, um eine Infektion zu verhindern. Suture subkutane Muskeln und Haut mit 4 Nähten.
- Geben Sie der Ratte mit einer 1 ml Spritze (SQ-PEN-Injektion ist besser) 0,2 ml sterile Salzine, um postoperative Wasserknappheit zu verhindern, nachdem sie die Ratte wieder in den Käfig gebracht hat.
- Wählen Sie die Tiere nach 24 Stunden Reperfusion nach der Longa-Punktzahl10. Wählen Sie Tiere mit einer Longa-Punktzahl von 1-3 für die nächste TTC-Färbung in Schritt 1.1 und Tiere mit einer Longa-Punktzahl von 2 x 3 für die 1, 35, 60, 90-Tage-Studie in Schritt 1.2 aus.
HINWEIS: Longas Punktzahl10: 0 Punktzahl, kein neurologisches Defizit; 1 Punktzahl, Nichtverlängerung links foreclaw; 2 Partitur, kreist nach links; 3 Punktzahl, fallen deiner seite, nach links; 4 Punktzahl, kann nicht spontan gehen und hat ein deprimiertes Bewusstsein.
- Analysieren Sie die Longa-Punktzahl per one-way ANOVA. Die dargestellten Werte sind mittelwert s.D. P < 0,05 geben die Differenz an.
3. TTC Färbung
HINWEIS: Die Mratten-Gehirnscheibe Form und Klinge muss in einem -20 °C Kühlschrank vor dem Gebrauch vorgekühlt werden, um Haftung durch einen großen Temperaturunterschied verursacht zu verhindern. Während der Färbung, verhindern Haftung zwischen den Gehirnscheiben und der Kulturplatte, die zu unzureichender Färbung führen kann.
- Anästhesisieren Sie die Ratte durch intraperitoneale Injektion von 400 mg/kg Chlorhydrat nach dem Longa-Score in Schritt 1.1 oder sensorimotorischen Funktionstests in Schritt 1.2.
- Enthaupten Sie die Ratte mit einer chirurgischen Schere oder mit einem Rattenenthauptungsapparat. Entfernen Sie das Gehirn mit chirurgischer Schere und hämostatischen Zangen.
- Legen Sie das Gehirn bei -20 °C für 30 min in den Kühlschrank, um das Schneiden zu erleichtern.
- Entfernen Sie das Gehirn aus dem Kühlschrank und legen Sie es in vorgekühlte Ratte Gehirn Scheibe Schimmel. Schneiden Sie das Gehirn in sechs 2-mm-dicke aufeinanderfolgende Abschnitte mit einer vorgekühlten Klinge.
- Die Abschnitte mit 2% 5-Triphenyl-2H-Tetrazoliumchlorid (TTC) in einer 6-Well-Kulturplatte färben.
- Die Abschnitte für 30 bis 60 min bei 37 °C in einem Schüttelbett beskulturen. Drehen Sie die Abschnitte alle 10 min, bis der Gehirn Ischämiebereich und der normale Bereich sind deutlich weiß und rot.
- Line das Gehirn schneidet vertikal in der Reihenfolge von hinten nach vorne des Gehirns. Verwenden Sie ein Lineal, um sicherzustellen, dass die Gesamtlänge jeder Zeile gleich ist. Nehmen Sie Bilder mit Digitalkamera.
- Analysieren Sie das Infarktvolumen.
- Vorbehandlung des Fotos mit Photoshop-Software
- Importieren Sie das Foto mit Photoshop CS6. 00:00-00:14
- Klicken Sie auf Auswählen, um die Gehirn-Slices auszuwählen, klicken Sie auf Auswählen | Inverse. 00:15-00:36
- Klicken Sie auf Vordergrund, um Schwarz auszuwählen, und klicken Sie auf OK. 00:37-00:42
- Drücken Sie Alt +Löschen, um die Hintergrundfarbe auszufüllen, und STRG +D, um die Auswahl aufzuheben. 00:43-00:46
- Klicken Sie auf Datei | Auf dem Desktop speichern. 00:47-01:08
- Vorbehandlung des Fotos mit DerImage Pro Plus Software.
- Öffnen Sie die Image Pro Plus 6.0-Software und importieren Sie das Foto. 01:09-01:24
- Passen Sie die Helligkeit für die Änderung von Fehlern mit dem Werkzeug Kontrastverbesserung an, sodass der Hintergrund schwarz ist. 01:25-01:37
- Verwenden Sie das Werkzeug Median im Filter, um die Hervorhebungen zu entfernen. 01:38-01:46
- Berechnen Sie den linken (normalen) Hirnbereich mit der Image Pro Plus Software
- Wählen Sie Farbe mit Segmentierung aus, und passen Sie den Wert von H/S/Ian, sodass die Gehirnscheiben vom schwarzen Hintergrund getrennt werden. 01:47-02:12
- Zurück zur Anzahl | Größe. 02:13-02:16
- Klicken Sie auf Zählen | Teilen Sie Objekte in Bearbeiten, um das Gehirn von der Mittellinie zu trennen. Die Software unterscheidet automatisch den linken und rechten Hirnbereich. 02:17-02:49
- Berechnen Sie den richtigen Infarkt-Hirnbereich mit der Image Pro Plus-Software
- Implementieren Sie Schritt 3.8.1-3.8.2. 02:50-03:14
- Wählen Sie Anzahl | Größe. 03:15-03:21
- Klicken Sie auf Zeichnen | Werkzeug "Objekte zusammenführen" in Bearbeiten. Wählen Sie manuell den ischämischen Bereich aus und klicken Sie auf Zählen, um das ischämische Gebiet zu berechnen. 03:16-05:31
- Berechnen Sie den Gesundheits-Gehirnbereich mit Image Pro Plus Software
- Implementieren Sie Schritt 3.8.1-3.8.2. 05:32-06:44
- Wählen Sie Farbe mit Segmentierung aus, und passen Sie den Wert von H/S/Ian, sodass der normale Teil der Gehirnscheiben vom schwarzen Hintergrund getrennt wird. 06:45-07:10
- Zurück zur Anzahl | Größe und klicken Sie auf Zählen, um diesen Bereich zu berechnen. 07:11-07:21
- Klicken Sie in Bearbeiten auf Objekte teilen, um das Gehirn von der Mittellinie zu trennen. Die Software unterscheidet automatisch den linken und rechten Hirnbereich. 07:22-08:08
- Berechnen des Infarktvolumens (%) infarkt und verkleinert Volumen (%):
Infarktvolumen (%) = [rechter Infarktbereich/(2 x linker Hirnbereich)] x 100.
Infarkt- und Schrumpfvolumen (%) = [(linker Hirnbereich - rechter Gesundheitshirnbereich) / (2 x linker Hirnbereich)] x 100.
HINWEIS: Das rechte Gehirn ist der verletzte Teil. Die Daten wurden von der einwegigen ANOVA analysiert. Die dargestellten Werte sind mittelwert s.D. P < 0,05 geben die Differenz an.
4. Bewertung der sensorimotorischen Funktion
HINWEIS: Ratten (300 g, 3040 Gewindebolzen, 3 h Hirninfarktzeit) mit einem Longa-Score von 2 bis 3 wurden ausgewählt, um die sensorimotorischen Funktionsexperimente von 1-90 Tagen durchzuführen. Schweigen und die Tiere während dieser Studienzeit nicht stören. Die Daten wurden von zweiseitigen ANOVA analysiert. Die dargestellten Werte sind mittelwert s.D. P < 0,05 geben die Differenz an.
- Bilateraler Asymmetrietest11
- Papierband (5 cm lang, 0,8 cm breit) dreimal mit gleichem Druck auf den saftigen Teil jedes Foreclaw einer Ratte wickeln.
- Zeichnen Sie für jede Ratte auf, wie oft jeder Foreclaw kontaktiert und das Band in 5 min mit der Kamera entfernt wird, einschließlich nicht beeinflusster Pfotenzeiten und betroffener Pfotenzeiten.
- Nach 30 min wiederholen Sie die Schritte 4.1.1 und 4.1.2 erneut.
- Berechnen Sie den Durchschnittswert der sensorimotorischen Verzerrung (%):
Sensorimotorische Verzerrung (%) = (unbeeinflusste Pfotenzeiten - betroffene Pfotenzeiten)/(unbeeinflusste Pfotenzeiten + betroffene Pfotenzeiten) x 100
- Grid-Walking-Test
- Legen Sie die Ratte in der Mitte einer erhöhten Gitterfläche (Fläche: 1 m2; Höhe: 90 cm) mit Gitteröffnungen von 2,5 cm2.
- Drücken Sie die Hüften der Ratte leicht, um die Ratte zu ermutigen, die Gitteroberfläche zu durchqueren.
- Zeichnen Sie die Anzahl der Fußfehler auf, die von den nicht betroffenen (rechts) und betroffenen (linken) Gliedmaßen und der Gesamtzahl der Schrittzahlen in 1 min mit der Kamera gemacht wurden.
- Berechnen Sie die Fehlerzeiten:
Fehlerzeiten (%) = [unbeeinflusste (rechte) Gliedmaße - betroffene (linke) Gliedmaße]/Gesamtschrittnummer x 100.
HINWEIS: Die Gesamtzahl der Schritte unter 20-Schritte-Daten wurde entfernt.
- Rotarod-Test12,13
- Richten Sie das Rattendrehstab-Ermüdungsgerät (Durchmesser 90 mm) von Ratten mit der unterstützenden Software auf eine Geschwindigkeit von 13 Umdrehungen pro Minute über einen Zeitraum von 5 min am Computer ein.
- Starten Sie die Computerprogramme und legen Sie die Ratte gleichzeitig auf die Rotarod-Sprossen.
- Beenden Sie eine Studie, wenn die Ratte von der Sprosse fällt oder 5 min weiterläuft und die rotierende Zeit aufzeichnet.
- Lassen Sie die Ratte 30 min ruhen.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.3.2-4.3.4 zweimal und wählen Sie den maximalwert aus, der die letzte Drehzeit sein soll.
- Hebeseilprüfung14
- Legen Sie das Hebeseilinstrument (70 cm hoch; das Seil hat einen Durchmesser von 0,2 cm und 40 cm lang) auf den Schreibtisch.
- Lassen Sie die Ratte das Seil mit ihren Vorderbeinen greifen und hängen Sie die Ratte auf.
- Zeichnen Sie die Zeit des Aufhängens auf und berechnen Sie die Partituren.
ANMERKUNG: Eine Punktzahl von 3: 0 x 2 s am Seil; Eine Punktzahl von 2: 3 x 4 s am Seil; Eine Punktzahl von 1: 5-6 s am Seil; Eine Punktzahl von 0: mehr als 7 s am Seil.