Hier stellen wir ein Protokoll zur Sammlung konfokaler Raman-Spektren von menschlichen Probanden in klinischen Studien in Kombination mit chemometrischen Ansätzen zur Spektralausreißerentfernung und der anschließenden Extraktion von Schlüsselmerkmalen vor.
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Methodenartikel
Auflösen von Wasser, Proteinen und Lipiden aus In Vivo konfokale Raman Spectra von Stratum Corneum durch einen chemometrischen Ansatz
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Entwicklung dieser in vivo konfokalen Raman spektroskopischen Methode ermöglicht die direkte Messung von Wasser, Proteinen und Lipiden mit Tiefenauflösung bei menschlichen Probanden. Diese Informationen sind sehr wichtig für hautbedingte Erkrankungen und die Charakterisierung der Leistung von Hautpflegeprodukten. Dieses Protokoll veranschaulicht eine Methode zur konfokalen Raman-Spektrensammlung und die anschließende Analyse des Spektraldatensatzes unter Nutzung von Chemometrie. Ziel dieser Methode ist es, ein Standardprotokoll für die Datenerfassung zu erstellen und allgemeine Anleitungen für die Datenanalyse bereitzustellen. Die Vorverarbeitung (z. B. Entfernung von Ausreißerspektren) ist ein entscheidender Schritt bei der Verarbeitung großer Datensätze aus klinischen Studien. Als Beispiel bieten wir Anleitungen, die auf Vorkenntnissen eines Datasets basieren, um die Arten von Ausreißern zu identifizieren und spezifische Strategien zu ihrer Entfernung zu entwickeln. Es wird eine Hauptkomponentenanalyse durchgeführt, und die Belastungsspektren werden mit Spektren aus Referenzmaterialien verglichen, um die Anzahl der Komponenten auszuwählen, die bei der abschließenden Multivariaten-Kurvenauflösungsanalyse (MCR) verwendet werden. Dieser Ansatz ist erfolgreich, um aussagekräftige Informationen aus einem großen Spektraldatensatz zu extrahieren.
Einleitung
In klinischen Studien hat die konfokale Raman-Spektroskopie in vivo ihre einzigartige Fähigkeit zur Bestimmung der Dicke des Stratum corneum und des Wassergehalts1,2,3,4, und die Verfolgung der Penetration von aktive Materialien topisch auf die Haut aufgetragen5,6. Als nichtinvasiver Ansatz erkennt die konfokale Raman-Spektroskopie molekulare Signale basierend auf Schwingungsmodi. Daher ist eine Kennzeichnung nicht erforderlich7. Die konfokale Raman-Spektroskopie in vivo liefert chemische Informationen mit Tiefenauflösung, die auf der konfokalen Natur der Technik basieren. Diese tiefenabhängigen Informationen sind sehr nützlich bei der Untersuchung der Auswirkungen von Hautpflegeprodukten4,8, Alterung9,10, saisonale Veränderungen3, sowie Hautbarriere Funktionskrankheiten, wie atopische Dermatitis11,12. Es gibt viele Informationen im hochfrequenten Bereich der konfokalen Raman-Spektroskopie (2.500–4.000 cm-1), wo Wasser in der Region zwischen 3.250–3.550 cm-1unterschiedliche Spitzen erzeugt. Die Raman-Spitzen von Proteinen und Lipiden, die zwischen ca. 2.800–3.000 cm-1zentriert sind, überlappen sich jedoch, da die Signale hauptsächlich aus Methylen (-CH2-) und Methyl (-CH3) Gruppen13 . Diese überlappenden Informationen stellen eine technische Herausforderung dar, wenn relativ viele einzelne molekulare Arten erhalten werden. Peak Fitting14,15 und selektive Spitzenposition12,16 Ansätze wurden verwendet, um diese Herausforderung zu lösen. Für diese auf einzelnen Spitzen basierenden Methoden ist es jedoch schwierig, reine Komponenteninformationen zu extrahieren, da mehrere Raman-Spitzen aus derselben Komponente gleichzeitig ändern17. In unserer jüngsten Veröffentlichung18wurde ein MCR-Ansatz vorgeschlagen, um die reinen Komponenteninformationen aufzuklären. Mit diesem Ansatz wurden drei Komponenten (Wasser, Proteine und Lipide) aus einem großen in vivo konfokalen Raman spektroskopischen Datensatz extrahiert.
Die Durchführung großer klinischer Studien kann für Personen, die spektroskopische Daten in vivo sammeln, anspruchsvoll sein. In einigen Fällen kann die spektrale Erfassung Eine Betriebsausrüstung für viele Stunden an einem Tag erfordern und die Studie kann sich bis zu Wochen oder Monate erstrecken. Unter diesen Bedingungen können spektroskopische Daten von Gerätebetreibern generiert werden, denen das technische Know-how fehlt, um alle Quellen spektroskopischer Artefakte zu identifizieren, auszuschließen und zu korrigieren. Der resultierende Datensatz kann einen kleinen Bruchteil spektroskopischer Ausreißer enthalten, die vor der Analyse identifiziert und aus den Daten ausgeschlossen werden müssen. Dieses Papier veranschaulicht detailliert einen chemometrischen Analyseprozess, um ein klinisches Raman-Dataset zu "bereinigen", bevor die Daten mit MCR analysiert werden. Um die Ausreißer erfolgreich zu entfernen, müssen die Arten von Ausreißern und die mögliche Ursache für die Erzeugung der Ausreißerspektren identifiziert werden. Dann kann ein spezifischer Ansatz entwickelt werden, um die gezielten Ausreißer zu entfernen. Dies erfordert Vorkenntnisse des Datensatzes, einschließlich eines detaillierten Verständnisses des Datengenerierungsprozesses und des Studiendesigns. In diesem Datensatz sind die meisten Ausreißer niedrige Signal-Rausch-Spektren und stammen hauptsächlich aus 1) Spektren, die über der Hautoberfläche gesammelt wurden (6.208 von 30.862), und 2) starkem Beitrag zum Spektrum von fluoreszierendem Raumlicht (67 von 30.862). Spektren, die über der Hautoberfläche gesammelt werden, erzeugen eine schwache Raman-Reaktion, da sich der Laserfokus der Hautoberfläche nähert und sich meist im Instrumentenfenster unter der Haut befindet. Spektren mit einem starken Beitrag von fluoreszierendem Raumlicht werden entweder durch Fehler des Gerätebedieners oder durch Subjektbewegung erzeugt, wodurch ein Zustand entsteht, in dem das konfokale Raman-Sammelfenster nicht vollständig von der Körperseite des Motivs abgedeckt ist. Obwohl diese Arten von Spektralartefakten während der spektralen Erfassung durch einen spektroskopischen Sachverständigen zum Zeitpunkt der Datenerfassung identifiziert und behoben werden konnten, wurden die in dieser Studie verwendeten geschulten Instrumentenbetreiber angewiesen, alle Daten zu sammeln, es sei denn, katastrophales Versagen beobachtet wurde. Die Aufgabe, Ausreißer zu identifizieren und auszuschließen, wird in das Datenanalyseprotokoll integriert. Das vorgelegte Protokoll wurde entwickelt, um diese Herausforderung zu lösen. Um die schwachen Signal-Rausch-Spektren über der Hautoberfläche zu adressieren, muss zuerst die Lage der Hautoberfläche bestimmt werden, um die Entfernung von Spektren zu ermöglichen, die über der Hautoberfläche gesammelt wurden. Die Lage der Hautoberfläche ist definiert als die Tiefe, in der der Raman-Laserfokusdierpunkt zur Hälfte in der Haut und zur Hälfte aus der Haut heraus ist, wie in Der Ergänzungsfigur 1dargestellt. Nach dem Entfernen von schwachen Signal-Rausch-Spektren wird eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) implementiert, um den Faktor zu extrahieren, der von fluoreszierenden Raumlichtspitzen dominiert wird. Diese Ausreißer werden basierend auf dem Score-Wert des entsprechenden Faktors entfernt.
Dieses Protokoll enthält detaillierte Informationen darüber, wie sechs Hauptkomponenten im MCR-Prozess bestimmt werden. Dies geschieht durch eine PCA-Analyse, gefolgt von einem spektralen Formvergleich zwischen den Belastungen für Modelle, die mit einer anderen Anzahl von Hauptkomponenten generiert wurden. Auch das experimentelle Verfahren zur Datenerfassung von Referenzmaterialien sowie den menschlichen Probanden wird ausführlich erläutert.
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Protokoll
Diese Studie wurde vom institutionellen Überprüfungsausschuss des Pekinger Kinderkrankenhauses in Übereinstimmung mit den ethischen Leitlinien der Erklärung von Helsinki von 1975 genehmigt. Es wurde nach DEN ICH-Richtlinien für Gute Klinische Praxis durchgeführt. Die Studie fand von Mai bis Juli 2015 statt.
1. Sammlung von konfokalen Raman-Spektren in vivo von menschlichen Probanden mit atopischer Dermatitis
- Beziehen Sie Themen ein, die den folgenden Kriterien entsprechen.
- Berücksichtigen Sie Themen im Alter von 4 bis 18 Jahren.
- Berücksichtigen Sie Probanden mit leichter bis mittelschwerer atopischer Dermatitis (Score von 2 oder 3 nach der globalen Beurteilung des Arztes) mit aktiven Krankheitssymptomen auf 5%–30% der Körperoberfläche, mit mindestens zwei Läsionen an den Armen.
- Berücksichtigen Sie Probanden, die bei guter Gesundheit sind, mit Ausnahme von Symptomen, die direkt mit der AD-Krankheit zusammenhängen.
- Schließen Sie Themen ein, die eine schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage erteilen.
- Schließen Sie Probanden ein, deren ITA-Wert (Individual Topology Angle) höher als 40 am Testort ist.
- Schließen Sie Themen aus, die eines der folgenden Kriterien erfüllen.
- Auszuschließen Probanden aus, die entweder derzeit an einer klinischen Studie in einer Testeinrichtung in den letzten 4 Wochen teilgenommen haben oder zuvor teilgenommen haben.
- Auszuschließen Patienten mit Krebs oder die innerhalb von 5 Jahren vor der Studie diagnostiziert oder behandelt wurden.
- Diabetiker ausschließen.
- Auszuschließen Patienten mit einer immunologischen oder infektiösen Erkrankung aus, die das Thema gefährden oder die Genauigkeit der Studienergebnisse beeinträchtigen könnten (z. B. Hepatitis, Tuberkulose, HIV, AIDS, Lupus oder rheumatoide Arthritis).
- Auszuschließen Probanden aus, die Hauterkrankungen haben, die instrumentelle Messungen stören könnten oder die klare Beurteilung der Haut nur bei atopischer Dermatitis verhindern. Beispiele sind extrem trockene Haut, geschädigte Haut, Schnitte, Kratzer, Sonnenbrand, Geburtszeichen, Tätowierungen, ausgedehnte Narbenbildung, Hautausschläge, übermäßiges Haarwachstum oder Akne.
- Auszuschließen Probanden aus, die orale immunsuppressive Medikamente, Antibiotika oder andere systemische Therapien innerhalb des letzten Monats verwenden, mit Ausnahme von kleineren Beruhigungsmitteln.
- Auszuschließen Sie Personen mit anderen Erkrankungen aus, die sie nach Ansicht des Prüfers von der Studienteilnahme ausschließen.
- Auszuschließen Probanden mit höherer Pigmentierung im Testbereich aus.
- Beschriften Sie den Läsionsbereich des atopischen Dermatitis-Studienteilnehmers und markieren Sie mit einer Fläche von 3 cm x 4 cm auf oder in der Nähe der Läsionsstelle, wie in Abbildung 1Adargestellt.
- Beschriften Sie den Nicht-Läsionsbereich mit demselben Marker in der Gegenkörperstelle (z. B. linker Unterarm vs. rechter Unterarm), wie in Abbildung 1Bdargestellt.
- Stellen Sie die markierte Körperstelle in engem Kontakt mit dem Fenster des in vivo konfokalen Raman-Instruments, wie in Abbildung 2A und Abbildung 2Bdargestellt. Bedecken Sie das gesamte Fenster, um die Auswirkungen von Raumlicht auf die Körperseite zu vermeiden.
- Führen Sie die Raman-Datensammlung aus.
HINWEIS: Das Gerät hat eine Spektralauflösung von 2 cm-1 und 50x Mikroskopieobjektiv (NA = 0,9 Öleintauchen), mit einem 671 nm Laser mit einer Leistung von 17 mW. Die Wellenlänge wird mit dem Spektrum einer eingebauten Neon-Argon-Lampe kalibriert. Die Intensitätskalibrierung erfolgt durch Messung des Spektrums eines NIST (National Institute of Standards) Glaskalibrierungsstandards.- Bewegen Sie den Fokus so lange, bis ein Spektrum wie in Abbildung 2C dargestellt beobachtet wird, und bewegen Sie den Fokus dann von der Hautoberfläche 10 m weg.
- Starten Sie die Datenerfassung für 26 Schritte mit einer Schrittgröße von 2 m im Frequenzbereich 2.510 cm-1–4.000 cm-1. Verwenden Sie eine Belichtungszeit von 1 s und messen Sie acht Replikationen für jeden Bereich, der insgesamt 10 bis 15 min lang ist.
2. Sammlung konfokaler Raman-Spektren aus Referenzmaterialien
- Legen Sie die Referenzmaterialien, die Hauptbestandteile in der menschlichen Haut stratum corneum19, auf das Fenster des konfokalen Raman-Instruments (siehe Tabelle der Materialien: Rinderserum Albumin (BSA), deionisiertes Wasser (DI-Wasser), Ceramid, Cholesterin, frei Fettsäure und Squalen).
- Sammeln Sie die Raman-Spektren der Referenzmaterialien nacheinander von der Außenseite des Materials zum Materialzentrum unter Verwendung der oben beschriebenen Sammlungsparameter.
- Integrieren Sie den Bereich unter jedem Raman-Spektren zwischen 2.510–4.000 cm-1 und identifizieren Sie die drei wichtigsten Maximalwertpunkte in diesen 26 Messungen. Durchschnittlich die Raman-Spektren aus diesen drei Punkten, um das endgültige Referenzmaterial-Spektren zu erhalten.
3. Entfernung der Ausreißerspektren durch Chemometrieanalyse
- Bestimmen Sie die Hautoberfläche und entfernen Sie die Out-of-Skin-Spektren.
- Ändern Sie die Dateierweiterung von '.ric' in '.mat' und laden Sie die .mat-Datei auf die MATLAB-Softwareplattform.
- Korrigieren Sie die Baseline mit Baseline (Automatic Weighted Least Squares), indem Sie mit der rechten Maustaste auf das importierte Dataset unter Analysieren | Andere Werkzeuge | Vorverarbeitung in der Software PLS_Toolbox mit Standardeinstellung.
- Fassen Sie die Werte zwischen 2.910–2.965 cm-1 zusammen, um die Intensitätswerte unter jedem Raman-Spektrum aus der 26 aufeinanderfolgenden Schrittmessung zu erhalten, wie in Abbildung 3A über die Summenfunktion in MATLAB dargestellt.
- Interpolieren Sie den Instrumentenversatzwert (Wert in der X-Achse in Abbildung 3B) von 26–260 mit der linspace-Funktion in MATLAB.
- Interpolieren Sie den Intensitätswert von 26 bis 260 mithilfe der Spline-Methode in MATLAB, indem Sie die neu generierten 260 Positionswerte nutzen.
- Verwenden Sie die Polyfit- und Polyval-Funktionen von MATLAB, um den neuen Satz von Intensitätswerten mit 260 Punkten zu erhalten. Verwenden Sie zunächst die Positions- und Intensitätswerte 260 als X- bzw. Y-Eingänge für die Polyfit-Funktion. Legen Sie den Gradwert auf 20 fest. Verwenden Sie dann die Ausgabekoeffizienten und die 260 erweiterten Positionswerte als Eingabe für Polyval, um die endgültigen 260 Intensitätswerte zu erhalten.
- Verwenden Sie die Max- und min-Funktionen von MATLAB, um die maximalen und minimalen Punkte aus den neu interpolierten 260-Intensitätswerten zu identifizieren.
- Berechnen Sie den Mittelwert der Intensität, indem Sie die Summe des maximalen und des minimalen Intensitätswerts durch zwei dividieren.
- Identifizieren Sie den Intensitätswert aus den 260 Intensitätswerten (berechnet aus Schritt 3.1.6), der dem mittleren Intensitätswert am nächsten liegt, und legen Sie den entsprechenden Positionswert als Hautoberfläche fest. Legen Sie diesen Positionswert als Nullpunkt in der X-Achse fest, wie in Abbildung 3Bdargestellt.
- Ändern Sie alle anderen Positionswerte entsprechend dem Nullpunkt und der bekannten Schrittgröße von 2 m.
- Entfernen Sie alle Spektren, die über der Hautoberfläche gesammelt wurden, entsprechend ihrem Positionswert.
- Importieren Sie die restlichen Daten in PLS_Toolbox, um ein Dataset zu erstellen und es in "RamanData.mat" umzubenennen.
- Entfernen Sie die Ausreißerspektren mit dem Raumlichteffekt.
- Laden Sie das Raman-Spektren-Dataset (RamanData.mat) nach dem Entfernen der Out-of-Skin-Spektren und implementieren Sie die PCA-Analyse.
- Laden Sie das Dataset in die SOFTWARE PLS_Toolbox unter der MATLAB-Plattform, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Dataset, um Analysieren | PCA.
- Wählen Sie Normalisieren als Vorverarbeitungsansatz und Für die Kreuzvalidierung keine option.
- Verwenden Sie die drei Komponenten für die PCA-Zersetzungsanalyse, wie in Ergänzender Abbildung 2dargestellt.
- Entfernen Sie die Abdeckung auf dem Sammelfenster des in vivo Raman-Instruments und erfassen Sie die Raumlichtspektren im Hochfrequenzbereich mit den gleichen Parametern, die für die Datensammlung der Referenzmaterialien verwendet werden.
- Identifizieren Sie den Raumlichteffektfaktor durch Vergleich mit den Raumlichthintergrundspektren, wie in Ergänzender Abbildung 3dargestellt.
- Entfernen Sie die Spektren mit einem deutlich höheren entsprechenden Score-Wert als normal (Mehr als 99,8 % der Score-Werte des gesamten Datensatzes, was in dieser Studie 0,16 entspricht).
4. Auswahl der Anzahl der Komponenten in der MCR-Zersetzungsanalyse
- Korrigieren Sie die Raman-Spektren-Baseline mit dem oben beschriebenen Ansatz (Abschnitt 3.1.2).
- Führen Sie die PCA-Analyse für das vorverarbeitete Dataset wie oben beschrieben (Abschnitt 3.2) mit Ausnahme der Auswahl von "PQN" – "Mean Center" anstelle von "Normalisieren" durch und zeichnen Sie die Eigenwerte in logarithmischer Skala zusammen mit der Anzahl der Komponenten (20) als Standardnummer in die Zerlegungsanalyse, indem Sie auf die Schaltfläche Komponenten auswählen klicken und log(eigenvalues) als Y-Wert auswählen. Wählen Sie drei bis acht als Anzahl der Komponenten aus, die für die MCR-Analyse verwendet werden.
- Führen Sie eine MCR-Analyse durch.
- Laden Sie das Dataset über die Schaltfläche Datenauswahl in die MCR_main-Software20.
- Wählen Sie die Anzahl der Komponenten (drei bis acht), indem Sie auf die Schaltfläche Bestimmen der Anzahl der Komponenten klicken.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Rein unter der Registerkarte Erste Schätzung, wählen Sie Konzentration unter der Registerkarte Richtung der Variablenauswahl aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Tun.
- Klicken Sie auf ok und dann auf die Schaltfläche Weiter zur nächsten Seite.
- Klicken Sie auf der nächsten Seite auf Weiter und wählen Sie dann fnnls und 6 unter den Registerkarten Implementierung und Nr. von Arten mit Nicht-Negativitätsprofilen aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter.
- Wählen Sie die gleichen Parameter wie Abschnitt 4.3.5 für diese Seite aus, und klicken Sie auf Weiter.
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Ergebnisse
In dieser klinischen Studie wurden in vivo konfokale Raman-Spektren von 28 Probanden im Alter von 4 bis 18 Jahren gesammelt. Insgesamt wurden 30.862 Raman-Spektren mit dem oben erwähnten Datenerfassungsprotokoll gesammelt. Dieser große Spektraldatensatz enthält 20 % Spektralausreißer, wie in Abbildung 4Adargestellt. Die schwachen Signal-Rausch-Ausreißerspektren wurden nach der Bestimmung der Hautoberfläche entfernt, gefolgt vom PCA, um die Spektren mit Raumlichtmerkmalen zu identifiziere...
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Diskussion
Während der Datenerfassung, wie in Abschnitt 2 und 3 des Protokolls beschrieben, wurde jedes Tiefenprofil in einem Bereich mit Kontakt zwischen dem Instrumentenfenster und der Haut gesammelt, indem die dunkleren Bereiche aus den mikroskopischen Bildern gefunden wurden, die in den roten Kreisen in Abbildung 2C. Sobald diese Bereiche lokalisiert wurden, war es wichtig, das Tiefenprofil über der Hautoberfläche zu starten, um die Position der Hautoberfläche für das Datenanalyse...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch die Corporate Function Analytical and Personal Cleansing Care Abteilung sehr. Wir möchten uns bei den analytischen Beisitzerinnen Frau Jasmine Wang und Dr. Robb Gardner für ihre Beratung und Unterstützung und Frau Li Yang für ihre Hilfe bei der Datenerhebung bedanken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterin 3-sulfat Natrium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosin | Sigma-Aldrich | ||
| DI Wasser | gereinigt mit Milipore (18,2M & Omega;) | ||
| Gen2-SCA-Hautanalysator | River Diagnostics, Rotterdam, Niederlande | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-Behenoyl-D-erythro-sphingosin | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganin(Ceramid) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Ölsäure | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitinsäure | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleinsäure | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox Version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, Niederlande | Version 3.2 | |
| Squalen | Sigma-Aldrich | ||
| Stearinsäure | Sigma-Aldrich |
Referenzen
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