Summary
We beschrijven het gebruik van een nieuwe, frequentie-domein luminescentie Lifetime camera voor het in kaart brengen van 2D O2 -distributies met optische sensor folies. Het camerasysteem en beeldanalyse procedures worden beschreven samen met de voorbereiding, kalibratie en toepassing van sensor folies voor het visualiseren van de O2 micro-omgeving in de rizosfeer van waterplanten.
Abstract
We beschrijven een methode voor het beeld opgeloste zuurstof (O2), in 2D bij hoge ruimtelijke (< 50-100 μm) en temporale (< 10 s) resolutie. De methode maakt gebruik van O2 gevoelige lichtgevende sensor folies (planaire optodes) in combinatie met een gespecialiseerd camerasysteem voor Imaging luminescentie levensduur in het frequentiedomein. Planaire optodes worden bereid door het oplossen van de O2-gevoelige indicatorkleur stof in een polymeer en het verspreiden van het mengsel op een solide ondersteuning in een gedefinieerde dikte via mes coating. Na verdamping van het oplosmiddel wordt de planaire optode in nauw contact gebracht met het monster van de belangstelling-hier gedemonstreerd met de wortels van de aquatische plant Littorella uniflora. De O2 -concentratieafhankelijke verandering in de luminescentie levensduur van de indicator kleurstof binnen de planaire optode wordt via de achterzijde van de doorzichtige draagfolie en de aquarium wand met behulp van een speciale camera afgebeeld. Deze camera meet de luminescentie levensduur (μs) via een verschuiving in fasehoek tussen een gemoduleerd excitatie signaal en een emissie signaal. Deze methode is superieur aan beeldvormingsmethoden voor luminescentie intensiteit, omdat het signaal onafhankelijk is van de kleurstof concentratie of-intensiteit van de excitatie bron, en uitsluitend afhankelijk is van de luminescentie vervaltijd, wat een intrinsiek gerefereerde parameter is. Bijgevolg is een aanvullende referentie kleurstof of andere wijzen van verwijzing niet nodig. We demonstreren het gebruik van het systeem voor macroscopische O2 -Imaging van plant rhizospheres, maar het camerasysteem kan ook gemakkelijk aan een microscoop worden gekoppeld.
Introduction
De verdeling en dynamiek van opgeloste gassen en ionen in sedimenten en bodems bieden belangrijke informatie over biogeochemische processen zoals microbiële ademhaling1,2of radiaal zuurstof verlies uit de wortels van de plant3,4,5en de chemische micro omgeving van microben6,7, plant rhizospheres5,8,9 en dierlijke Burrows10, 11,12. Biologische en chemische activiteit in dergelijke diffusie-beperkte omgevingen kunnen steile hellingen van chemische substraten of producten van biogeochemische processen te creëren. In het bijzonder, O2 beschikbaarheid heeft een enorme impact op biogeochemische processen en dus de biologie en ecologie van een systeem13. Daarom is het analyseren van O2 concentraties bij hoge ruimtelijke en temporele resolutie van primordiaal belang in aquatische en terrestrische wetenschappen. Eerst werden elektrochemische en optische micro sensoren14,15 ontwikkeld om deze belangrijke analyt te meten. Later werd 2 dimensionale (2D) beeldvorming van o2 met planaire optodes geïntroduceerd12,16,17,18,19, die de visualisatie en kwantificering van de heterogene O2 verdeling in bodems en sedimenten mogelijk maakte.
Planar O2 optodes bestaan uit een O2-gevoelige indicatorkleur stof20, die wordt opgelost in een geschikt polymeer21. De indicatorkleur stof is enthousiast over specifieke optische golflengten en zendt rood-verschoven licht bij ontspanning in de vorm van luminescentie. In aanwezigheid van O2, de opgewonden indicatorkleur stof kan zijn energie overbrengen naar de O2 molecuul op botsing, die wordt aangeduid als botsing gebaseerde luminescentie afschrikken22. Daarom worden de luminescentie intensiteit en de levensduur van de luminescentie verlaagd met een toenemende O2 -concentratie23. In een ideaal geval volgt de verandering in intensiteit en levensduur de Stern-Volmer-vergelijking (vergelijking 1) met behulp van de luminescentie intensiteit of de levensduur bij afwezigheid (I0; τ0) of aanwezigheid (i, τ) van O2 bij een bepaalde concentratie [Q]. De Stern-Volmer constante (KSV) is een maat voor de gevoeligheid van de optode in de richting van O2; KSV is afhankelijk van omgevingsvariabelen zoals temperatuur en druk.
1
Het opnemen van dergelijke veranderingen in luminescentie over een vlakke sensor folie met een camerasysteem kan worden gebruikt om de overeenkomstige veranderingen in de distributie van O2 te visualiseren. In eerste instantie werd een eenvoudige luminescentie-intensiteit van O2 gebruikt18. Deze methodologie is echter zeer gevoelig voor externe interferenties, die de betrouwbaarheid van de resultaten in gevaar brengen als gevolg van heterogene verlichting, schommelingen in de excitatie bron of camera, evenals een ongelijke verdeling van de indicator kleurstof binnen de planaire optode.
Sommige van deze beperkingen kunnen worden verlicht door gebruik te maken van planaire optodes voor ratiometrische beeldvorming17,24, waarbij de o2-gevoelige indicatorkleur stof wordt geïmmobiliseerd in de polymeer laag van de planaire optode met een ongevoelige referentie kleurstof die in een ander spectrum bereik dan de o2-indicator wordt uitgestald. Op basis van emissie beelden die in twee spectrale vensters zijn verworven, wordt het O2-gevoelige emissie signaal gedeeld door het referentiesignaal, waardoor een ratio afbeelding wordt gegenereerd die minder gevoelig is voor de bovengenoemde interferenties5,17. De methode vereist het gebruik van een tweede kleurstof, die idealiter kan worden opgewonden door dezelfde excitatie bron, maar zendt op een andere golflengte (zonder significante spectrale overlapping), in een ander spectrale venster van de camera (bijvoorbeeld in een ander kleurkanaal van een RGB-camera).
Als alternatief kan O2 -beeldvorming worden gebaseerd op het kwantificeren van de o2-afhankelijke verandering in de luminescentie levensduur van de indicator kleurstof, die niet wordt beïnvloed door ongelijke belichting of heterogeneities in de indicator concentratie25. De eerste luminescentie-levensduur-gebaseerde O2 -beeldvormingssystemen waren gebaseerd op tijdsdomein metingen met een Gate-able-camerasysteem met opgeladen apparaat (CCD)26, waar een gepulseerde excitatie bron wordt gebruikt en luminescentie beelden worden genomen over gedefinieerde tijdsintervallen binnen de excitatie of emissie van de indicator8,23,27. Uit dergelijke beelden kan de luminescentie levensduur worden bepaald en gecorreleerd met de overeenkomstige O2 -concentratie in een kalibratie. Vervolgens kunnen luminescentie levensduur beelden voor een gegeven monster dat tegen de planaire optode wordt gedrukt, worden omgezet in afbeeldingen van de overeenkomstige 2D-verdeling van O2 -concentratie. Dit systeem is gebruikt in vele toepassingen zowel in het laboratorium als in situ16,28, maar de essentiële poort-able CCD camera is niet langer commercieel beschikbaar.
Onlangs werd een ander luminescentie Lifetime camerasysteem uitgebracht, dat beelden verwerft in de frequentie-domein8. Het systeem is gebaseerd op een continu gemoduleerde lichtbron voor excitatie. Dit kan een sinusvormige of vierkante Golf in plaats van een gepulseerde excitatie, die wordt gebruikt voor het verzamelen van afbeeldingen in de tijd-domein. Deze modulatie resulteert in een gemoduleerde luminescentie-emissie van de O2 indicator kleurstof, die geleidelijk wordt verschoven door een hoek, φ, die afhankelijk is van de luminescentie levensduur van de indicator kleurstof (τ) (Zie vergelijking 2).
2
De verandering tussen excitatie en emissie amplitude (d.w.z. de zogenaamde modulatie-index of diepte (amplitude gedeeld door het constante luminescentie gedeelte) is ook afhankelijk van de luminescentie levensduur. Door het instellen van een bekende modulatie frequentie kan de speciale CMOS-beeldsensor in de camera de luminescentie levensduur in het NS-naar-μs-bereik meten, zoals beschreven in detail elders 8,29,30. Een algemene leidraad over het werkingsprincipe kan worden gevonden (via de volgende link https://www.YouTube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).
In het volgende protocol demonstreren we het gebruik van het nieuwe camerasysteem voorbeeld vorming van de verdeling van de O2 -concentratie rond de wortels van de aquatische zoet water plant Littorella uniflora in 2D9,31. Wij willen benadrukken dat deze methode geenszins beperkt is tot deze toepassing. Zuurstof gevoelige optodes of sensor deeltjes27 in combinatie met verschillende beeldvormingsmethoden zijn gebruikt in medisch onderzoek32, in bioprinten33, voor drukgevoelige verven34,35, of om fotosynthetische systemen2,36,37te bestuderen, om maar een paar andere toepassingsgebieden te noemen.
Protocol
1. fabricage van Planar O2 optode
- Los 1,5 mg van de lichtgevende O2 indicatorkleur stof platina (II)-5 op, 10, 15, 20-Tetrakis-(2, 3, 4, 5, 6-pentafluorfenyl)-porphyrine (PtTFPP) en 100 mg polystyreen (PS) in 1 g chloroform om de zogenaamde ' sensor cocktail ' te krijgen.
Let op: de cocktail kan in een gesloten, gasdichte glazen injectieflacon voor een paar uur in de koelkast en duisternis worden bewaard tot verder gebruik. - Een schoon, stofvrij polyethyleentereftalaat (PET) folie (grootte afhankelijk van de toepassing) op een gereinigde glasplaat repareren met behulp van een water of ethanol (70%) film (Figuur 1A).
- Plaats de gereinigde mescoating (120 μm) op de folie en breng een lijn van de cocktail van de sensor aan voor het apparaat met behulp van een glazen pipet (Figuur 1B). Sleep vervolgens het mes-coating apparaat langzaam en gelijkmatig over de PET-folie om de cocktail gelijkmatig te verdelen.
Opmerking: alle materialen en gereedschappen moeten grondig worden gereinigd en de fabricage moet worden uitgevoerd in een stofvrije omgeving, zoals een rook afzuigkap, flow Bank of onder een punt zuiginrichting. Om heterogeneities in de uiteindelijke sensor folie te voorkomen, moeten de stappen die volgen op de toepassing van de cocktail van de sensor op de folie snel worden gedaan, omdat de chloroform snel verdampt. - Droog de afgewerkte planaire O2-gevoelige optode in de omgevingslucht gedurende 1 uur en vervolgens over de nacht in een verwarmings kast bij 50-60 °c, resulterend in een uiteindelijke laagdikte na het verdampen van het oplosmiddel van ~ 12 μm. Bewaar de geproduceerde optodes in duisternis (bijv. in een papieren envelop) tot verder gebruik (Figuur 1C).
NB: Planar O2 optodes kunnen gedurende enkele maanden tot jaren voorafgaand aan het gebruik droog en in duisternis worden bewaard. Een laatste laagdikte variërend van 1-20 μm heeft bewezen goede resultaten te leveren, met voldoende luminescentie signaal en adequate responstijden.
2. rhizo-sandwich kamer
- Reinig twee glazen platen (24,5 x 14 cm2, dikte: 4 mm) met 96% ethanol.
- Gebruik lichtuikbare, op acryl gebaseerde Instant Adhesive (Zie tabel met materialen) om Microscoop-dia's (76 x 26 mm2, dikte: 1 mm) te lijmen langs de randen van de eerste glasplaat (d.w.z. de achterste kamer zijde), terwijl er één lange rand open is. Gebruik een glasscutter om zo nodig Microscoop-dia's te verkorten.
Let op: snij glas kan scherpe randen veroorzaken en moet voorzichtig worden behandeld.
Opmerking: de Microscoop-dia's fungeren als afstandhouders tussen de voor-en achterzijde, en afhankelijk van de dikte van de wortels en de plantgrootte, kunnen meerdere lagen Microscoop dia's op elkaar worden gelijmd. - Snijd de planaire optode in de gewenste vorm en grootte om in de ruimte tussen de gelijmde Microscoop glaasjes te passen. Plaats het aan de binnenzijde van de glasplaat met de gecoate zijde naar boven, om contact met het monster van belang te geven wanneer er tegen wordt gedrukt.
- Plak een rand van de optode folie op de glasplaat en voeg een paar druppels kraanwater toe tussen de glasplaat en de optode folie (Figuur 2a). Verlaag de folie langzaam op deze waterdruppels, zodat het zichzelf op het glazen oppervlak kan rechttrekken.
- Verwijder voorzichtig luchtbellen tussen de planaire optode en de glasplaat met behulp van een zacht weefsel, terwijl het krassen van de sensor coating wordt vermeden. Veeg de glasplaat droog en plak de resterende randen van de optode folie op de glasplaat (Figuur 2B).
Opmerking: er moet een tape met een geschikte hechting onder water worden gekozen. - Zeef het sediment met een maaswijdte van 0,5 mm. plaats een lepel NAT sediment op de eerste glasplaat (Figuur 2C).
Opmerking: de maaswijdte mag niet groter zijn dan de helft van de dikte van de afstandhouder. - Verdeel het sediment gelijkmatig en stel het in op dezelfde dikte als de Microscoop-schuif spacers met een vlakke glasplaat. Reinig het bovenste oppervlak van de Microscoop glaasjes zorgvuldig om ervoor te zorgen dat de tweede glasplaat de kamer goed verzegelt.
- Breng silicium vet aan op het Microscoop-schuif oppervlak. Bedek het sediment met een dunne water film, terwijl de vorming van luchtbellen zorgvuldig wordt vermeden.
- Was voorzichtig een enkele shoot van Littorella uniflora en leg het op het sediment, met de planten bladeren steken uit de bovenste open kant (Figuur 2D).
- Plaats de tweede glasplaat, met de optode eraan bevestigd, op het sediment en breng zachte druk aan om de optode in nauw contact te brengen met de planten wortels en het omringende sediment.
Opmerking: luchtbellen die in het sediment zitten, kunnen worden verwijderd door de glasplaten te kantelen en ze samen te brengen. - Bevestig de glasplaten aan elkaar met behulp van klemmen (Figuur 2E). Droog de buitenste randen met tissuepapier. Houd de bladeren gehydrateerd gedurende de hele assemblage van de rhizo-sandwich (bijv. door frequente toevoeging van een paar druppels water).
- Draai de rhizo-sandwich kamer vast met behulp van vinyl elektrische tape. Verzegel de randen met modelleer klei en plak ze bovendien met vinyl tape (Figuur 2F).
Opmerking: als er veel luchtbellen in het sediment zijn, of sediment korrels tussen de Microscoop-dia's en de tweede glasplaat, moet de kamer opnieuw worden geassembleerd omdat porie water eruit kan lekken (Herhaal stappen 2,4-2,8). - Gebruik een dekkend plastic om de rhizo-sandwich te bedekken, maar laat een spleet in de folie voor de planten bladeren om uit te steken. Snijd een venster in de plastic folie, zodat het kan worden geopend voor de experimenten door te ontvouwen. Sluit het venster tijdens acclimatisatie tijden met behulp van elastiekjes (Figuur 2G) om de optode te beschermen tegen foto bleken terwijl de plant wordt geïnineerd.
Opmerking: als algengroei potentieel kan interfereren met O2 concentraties gemeten, raden we aan om het te minimaliseren, door gefilterd water te gebruiken, voorgereinigde experimentele apparatuur en algen te verwijderen bij de vorming.
3. rhizo-sandwich kamer incubatie
- Plaats de rhizo-sandwich kamer in een waterreservoir (32 x 7 x 28 cm3) in een licht gekantelde positie om de wortelgroei tegen de planaire optode aan te moedigen.
- Vul het waterreservoir met voldoende water om de planten bladeren volledig te onderdompelen.
- Stel een 14 h licht, 10 h donkere cyclus voor acclimatisering van de plant met behulp van een tijdgestuurde lamp. Plaats een lucht-steen of een waterpomp in de tank om de beluchting en het mengen van het water te garanderen (Figuur 2H).
4. Imaging
- Imaging Setup
- Verwijder de plastic folie die de planaire optode in de rhizo-sandwich kamer bedekt. Plaats de kamer met de glazen wand met de optode rechtop tegen de aquarium wand. Gebruik een afstandhouder om de rhizo-sandwich kamer tegen de aquarium wand te drukken.
Opmerking: de totale dikte van de aquarium wand plus de rhizo-sandwich kamer muur mag niet te dik worden, maar glas diktes voor aquaria wanden voor luminescentie beeldvorming worden aanbevolen met > 1 cm, om ruimtelijke Kruis Talk te verminderen door de demping van het verstrooide licht te verhogen. Het is belangrijk om hetzelfde materiaal te gebruiken voor beide glazen wanden (dezelfde vuurvaste index), om lichtverstrooiing bij de materiaal interface te minimaliseren; omdat dit zou leiden tot een wazig beeld ook12. - Plaats de op frequentie-domein gebaseerde luminescentie levensduur camera uitgerust met een objectief (Zie tabel van de materialen) voor het aquarium en het interessegebied (wortels van de aquatische plant Littorella uniflora, die in direct contact staan met de planaire Optode) (Figuur 3).
Opmerking: de camera kan op een laboratoriumstandaard worden geplaatst, zodat de camera gemakkelijk in hoogte kan worden aangepast. De positie van de Lab-standaard moet worden gemarkeerd en vast worden gehouden. Bovendien kan de camera worden geplakt naar de Lab-standaard om onbedoelde beweging van de camera tijdens het experiment te voorkomen. - Schroef een geschikte emissie filter voor Imaging PtTFPP als indicatorkleur stof (Zie tabel van de materialen) op de camera doelstelling, om gevolgtrekkingen van de excitatie bron te verwijderen.
Opmerking: schroef filters zijn ideaal, maar vierkante filters kunnen ook worden gebruikt met een geschikte adapter of door ze voorzichtig aan het doel te koppelen. - Sluit een LED-excitatie bron (Zie tabel met materialen) aan op de modulatie en de darkgate-uitgang van de camera.
Opmerking: de eerstgenoemde levert het modulatie signaal voor de lichtbron, terwijl de laatste het licht uitschakelt tijdens het uitlezen van de beeldsensor. Sluit de LED-excitatie bron en de camera aan op een computer. Achtergrondlicht moet worden geminimaliseerd tijdens het uitlezen van de afbeelding, door de hele ruimte donkerder te maken of door een dichte, zwarte doek over de hele set-up te plaatsen. In het laatste geval is het belangrijk om voldoende ventilatie te garanderen om de verwarming van de camera te voorkomen. - Bevestig de lichtgeleider in de LED-excitatie bron en plaats deze om de planaire optode folie gelijkmatig te belichten die het interessegebied beslaat.
Opmerking: in de gebruikte LED-excitatie bron is het mogelijk om te schakelen tussen 3 verschillende Led's (460 nm, 528 nm, 625 nm), waarvan de intensiteit kan worden aangepast via de besturingssoftware.
- Verwijder de plastic folie die de planaire optode in de rhizo-sandwich kamer bedekt. Plaats de kamer met de glazen wand met de optode rechtop tegen de aquarium wand. Gebruik een afstandhouder om de rhizo-sandwich kamer tegen de aquarium wand te drukken.
- Instellingen en camerabediening
Opmerking: voor de beschreven experimenten hebben we een levenslange camera op basis van een frequentiedomein gebruikt in combinatie met een speciale module voor Lifetime imaging in een commercieel beschikbaar softwarepakket (Zie tabel met materialen).- Selecteer de camera in de gekozen software voordat u deze gebruikt.
Opmerking: de software-en camera drivers moeten voorafgaand aan Imaging worden geïnstalleerd volgens de richtlijnen van de fabrikant. - Open de LED-besturingssoftware (opnieuw geïnstalleerd voorafgaand aan het starten van het experiment) en kies de geschikte LED (hier: 528 nm) door de standby-stand af te tikken. Stel de LED-intensiteit zo nodig in (hier tot 30%). Zorg ervoor dat de LED wordt geactiveerd door de externe TTL; Dit wordt gedaan door het tikken analoog en Sync voor de LED.
Opmerking: de LED-intensiteit moet individueel worden aangepast, omdat een te hoog Laser vermogen kan leiden tot versnelde foto bleken van de indicator of referentie kleurstof. - Richt de camera op en pas het diafragma van het objectief handmatig aan (in de huidige studie gebruik f = 2,8).
Let op: het is belangrijk om de camera op de planaire optode te concentreren en niet op het aquarium glas; Dit kan worden verzekerd door het nemen van een afbeelding met een liniaal voor schaal, en gericht op de schaduw van de liniaal op de optode, in plaats van op de werkelijke liniaal. - Stel de volgende parameters in het camera-bedieningspaneel van de software in: interne modulatiebron; sinusgolf voor de output Waveform; aanvullende fase bemonstering (Ja); 8 fase monsters, fasevolgorde tegenovergestelde, tap A + B uitlezen; 5 kHz modulatie frequentie.
Opmerking: deze parameters zijn van invloed op de beeldkwaliteit en kunnen indien nodig worden gewijzigd. De fabrikant van de camera geeft richtlijnen over de afzonderlijke parameters (de camerafabrikant publiceert richtlijnen en updates wanneer de software wordt bijgewerkt). - Neem een referentie-afbeelding voorafgaand aan experimenten.
Opmerking: dit kan worden gedaan door een kalibratie standaard (een lichtgevende kleurstof met een bekende levensduur (NS of μs)) of door het gereflecteerde licht van de LED te gebruiken. In het laatste geval moet de emissie lange doorlaat filter worden verwijderd uit de doelstelling en de bekende levensduur kan worden ingesteld op 1 ns. - Pas de belichtingstijd in het kalibratie gedeelte van de specifieke beeldvormings software aan tot de ROI Statistics uitlezen (onder aan dit paneel) voor de genormaliseerde luminescentie intensiteit in het bereik van 0,68-0,72.
Opmerking: nu wordt de referentie levensduur (bijv. 1 NS) gegeven als input voor de software. - Druk op Capture Reference om de acquisitie van een referentie meetreeks te starten.
Opmerking: als u klaar bent, worden de referentiegegevens opgeslagen en kunnen enkelvoudige of timelapse-metingen worden uitgevoerd op samples.
- Selecteer de camera in de gekozen software voordat u deze gebruikt.
- Kalibratie van de O2 optode
- Plaats een stukje Planar O2-gevoelige optode in een (klein) glazen aquarium. Bevestig de planaire optode op de glazen wand van de kalibratie kamer zoals eerder beschreven (zie punt 2,3). Plaats het kalibratie aquarium voor de camera. Zorgen voor gelijkmatige verlichting door de LED, evenals dat de optode vult het gehele gezichtsveld.
Opmerking: de planaire optode moet afkomstig zijn uit hetzelfde stuk folie of gemaakt van dezelfde sensor cocktail als de folie die wordt gebruikt in het eigenlijke experiment. - Vul het aquarium met hetzelfde vloeibare medium als gebruikt in de experimenten.
Opmerking: het gebruik van verschillende media voor kalibraties en experimenten kan de meting beïnvloeden (bijv. door de sensor respons en/of de oplosbaarheid in O2 te veranderen). Zo moet de kalibratie worden uitgevoerd in hetzelfde medium en op dezelfde temperatuur als het eigenlijke experiment. Schommelingen in de temperatuur zullen het luminescentie signaal beïnvloeden en moeten worden vermeden. Als de temperatuur echter niet stabiel kan worden gehouden, moet de temperatuurcompensatie worden uitgevoerd door de O2-gevoelige optode (meerdere punten) te kalibreren bij verschillende (relevante) temperaturen en de daaropvolgende herberekening van de waarden. - Pas de concentratie van O2 in het kalibratie aquarium aan door het water te spoelen met een lucht/N2 -gasmengsel van bekende O2 -concentratie, met behulp van een gasmenginrichting. Zorg ervoor dat het water goed wordt geëscaleerd met het gebruikte gasmengsel door te belueren gedurende een voldoende tijd (afhankelijk van de stromingssnelheid en de grootte van het aquarium).
Opmerking: we raden u aan het niveau O2 in het kalibratie aquarium te bewaken met een externe, gekalibreerde o2 -sensor met temperatuurcompensatie (bijv. met behulp van een Fiber Optic-of elektrochemische o2 -sensor). - Neem een reeks beelden in verschillende O2 -concentraties in de kalibratie kamer.
Opmerking: ten minste vijf verschillende O2 -concentraties moeten worden gemeten om een juiste curve te kunnen aanpassen aan de verkregen kalibratiegegevens. Het is belangrijk om te meten bij 0 hPa (anoxische condities) en vervolgens de andere waarden over het dynamische bereik van uw specifieke indicatorkleur stof te verdelen. Hier gebruikten we PtTFPP als de O2-gevoelige indicatorkleur stof geïmmobiliseerd in een polystyreen matrix. Afbeeldingen zijn genomen op 0, 48, 102, 156 en 207 hPa; 207 hPa komt overeen met 100% lucht verzadiging bij het gegeven zoutgehalte en de druk.
- Plaats een stukje Planar O2-gevoelige optode in een (klein) glazen aquarium. Bevestig de planaire optode op de glazen wand van de kalibratie kamer zoals eerder beschreven (zie punt 2,3). Plaats het kalibratie aquarium voor de camera. Zorgen voor gelijkmatige verlichting door de LED, evenals dat de optode vult het gehele gezichtsveld.
- Het monster Imaging
- Plaats het monster voor de camera en zorg voor gelijkmatige verlichting.
- Schakel het licht dat de straling levert aan de installatie (en alle andere lichtbronnen) net voorafgaand aan het verkrijgen van het luminescentie levensduur beeld van de plant uit. Pas de acquisitie tijd aan op basis van het intensiteits beeld, zodat het signaal niet oververzadigd of te zwak is voor een goede signaal-ruis verhouding (S/N) in de levensduur bepaling.
- Stel de plant bloot aan wisselende lichtomstandigheden (bijv. licht/donker) en verkrijg een set beelden.
- Schakel het licht in de ruimte in om een structureel beeldte verkrijgen.
Opmerking: wanneer het achtergrond lampje is ingeschakeld, zal de camera geen realistisch levensduur beeld meten. De intensiteit afbeelding toont nu echter het hele gezichtsveld zoals gezien door de semi-transparante optode. - Neem een afbeelding met een liniaal of gelijk in het gezichtsveld om later schalen van de verworven afbeeldingen mogelijk te maken.
5. gegevensanalyse
- Exporteer de levensduur van de fase en intensiteit afbeeldingen rechtstreeks vanuit de specifieke imaging software, met behulp van de macro die door de fabrikant van de camera.
- Voer een verdere beeldanalyse uit met behulp van een vrij beschikbare beeldanalyse software (Zie tabel met materialen).
- Open de fase levensduur beelden van de kalibratie in de beeldanalyse software en bepaal het gemiddelde van de hele afbeelding met behulp van de meetfunctie. Plot de gemeten levensduur tegen de bekende concentraties van O2 om de kalibratiefunctie te bepalen (Figuur 4A).
- Bereken τ0/τ van alle gegevens (τ0 is de levensduur van de gemeten fase bij afwezigheid van O2). Plot deze waarden versus de bekende concentraties van O2 (Figuur 4B).
- Bepaal de parameters KSV en f van de kalibratie plot met behulp van het vereenvoudigde twee-site-model voor dynamische botstlessend (vergelijking 3)38,39 waarbij [Q] de concentratie O2 is. Definieer de fit-function in de data analysis software, die vervolgens KSV en f bepaalt.
3
- Open de verworven voorbeeldafbeeldingen in de analyse software voor afbeeldingen om de levensduur van de afbeelding om te zetten in O2 -concentraties, met behulp van de vastgestelde parameters KSV, f en τ0.
Opmerking: als alternatieve benadering kunnen ook de levensduur waarden van de verworven kalibratie fase (Figuur 4A) direct worden gebruikt. In dit geval wordt een exponentiële pasvorm met behulp van de curve Fit-functie gebruikt voor kalibratie. - Open de afbeelding met de liniaal naast de beeldanalyse software en meet een bekende afstand met behulp van het meetinstrument. Stel deze meting in als globale schaal onder set Scale.
Representative Results
Als voorbeeld van een applicatie voor het nieuwe beeldvormings systeem tonen we 2D O2 beeldvorming van een complex biologisch monster (d.w.z. de rhizosfeer van de aquatische plant Littorella uniflora).
Ten eerste beschrijft de methode de fabricage van een vlakke sensor film, een zogenaamde planaire optode. Zoals te zien in Figuur 1, is een dergelijke optode gemaakt van een dun laagje van een optische indicator in een polymeer matrix die wordt verspreid op een transparante drager. Door het beschreven protocol te volgen, wordt een homogene sensor film met een uniforme dikte, zoals gedefinieerd door de spleet van het mes coating apparaat, verkregen. Als de geproduceerde optode heeft een fragmentarische sensor materiaaldistributie (bv, gaten in de coating, toont strepen, of kleurstof aggregaten (dit kan visueel worden geëvalueerd, en visueel met behulp van een UV-lamp)), het protocol moet worden herhaald en alle materialen moeten grondig worden gereinigd met behulp van aceton.
Zodra de Planar optode is bereid, kan het monster in nauw contact worden gebracht met de sensorlaag van de planaire optode, zoals hier getoond met de planaire optode geïntegreerd in een rhizo-sandwich kamer, waar de wortels van een plant in een omringende sediment matrix in nauw contact met de planaire optode kunnen worden geplaatst (Figuur 2). Indien correct bereid, de rhizo-sandwich kamer moet gemakkelijk worden beweegbaar van het ene Aquarium (incubatie) naar de andere (meting). Indien niet correct geconstrueerd, kan de rhizo-sandwich kamer worden Instable, sediment verliezen of luchtbellen bevatten. Visueel onderzoek van de rhizo-sandwich kamer direct na montage wordt dus aanbevolen.
Het gegeven protocol maakt het mogelijk om op frequentiedomein gebaseerde luminescentie levensduur beelden van het monster in contact te stellen met de planaire optode met behulp van de op frequentie-domein gebaseerde luminescentie levensduur camera. Meer informatie over dit camerasysteem, zoals de modus van beeld verwerving en de kenmerken van de camera van wetenschappelijke complementaire metaaloxide-halfgeleider (scmos), worden gegeven in recente publicaties8,29.
De Setup zelf is vrij eenvoudig en omvat alleen de camera die een lichtbron bestuurt (in dit geval een LED-excitatie bron) en het monster met de optode (Figuur 3). Zorg ervoor dat alle onderdelen correct zijn aangesloten en dat het monster homogeen wordt verlicht. Achtergrondlicht moet worden vermeden tijdens het voorvormen van metingen.
Voorafgaand aan de beeldvorming van het monster moet de optode worden gekalibreerd. Zoals te zien in Figuur 4A, neemt de gemeten luminescentie levensduur af met een toename van de O2 -concentratie na een quasi-exponentieel verval. Deze relatie kan ook worden beschreven met behulp van het vereenvoudigde twee-site-model (Figuur 4B en vergelijking 3). In het gegeven voorbeeld waren de parameters die nodig waren om de O2 -concentratie te berekenen als volgt; τ0 = 56,26 μs, KSV = 0,032 hpa-1 en f = 0,86.
Het uitvoeren van een kalibratie is ook een ideale manier om te testen of het systeem goed werkt. Als alle componenten zijn geïnstalleerd zoals hier beschreven (of binnen de richtlijnen van de fabrikant), moet de gemeten levensduur dezelfde2 afhankelijkheid vertonen zoals te zien is in Figuur 4. Bovendien moet voor dezelfde combinatie van O2 -detectie materialen (polymeer en kleurstof) de gemeten τ0 zich in hetzelfde bereik bevinden (± een paar μs) zoals hier gemeten (voornamelijk beïnvloed door de experimentele temperatuur). Als er geen vergelijkbare kalibratiecurve kan worden verkregen, moet u ervoor zorgen dat alle stappen correct zijn gevolgd. Soms wordt de optode per ongeluk bevestigd met de gevoelige kant naar de glazen wand in plaats van het monster, of de verworven beelden zijn over-of onderbelicht.
Met de kalibratie parameters is het mogelijk om de O2 -concentratie te bepalen door de luminescentie levensduur (τ) te Imaging. Dit wordt aangetoond in Figuur 5A, B, waar de verdeling van de concentratie van O2 in de rhizosfeer van Littorella uniflora werd afgebeeld in de duisternis en na blootstelling aan 500 μmol fotonen m-2 s-1 voor 12 h, respectievelijk. Als gevolg van de fotosynthetische activiteit van de plant steeg de O2 -concentratie in de rizosfeer na blootstelling aan licht. Naast levenslange beelden kunnen ook "structurele" beelden worden verkregen onder externe verlichting, terwijl de beeld geometrie vast blijft. Op deze manier kunnen O2 -beelden nauwkeurig worden gecorreleerd aan het structurele beeld (Figuur 5C), doorsneden of gebieden die van belang zijn. Als voorbeeld werden O2 -concentratie profielen in een enkele wortel geëxtraheerd uit het beeld dat respectievelijk in duisternis en licht werd verkregen (Figuur 5D).
Figuur 1: fabricage van een planaire O2 optode. A) eenPET-folie wordt op een glasplaat bevestigd en het mes-coating apparaat wordt op de folie geplaatst. B) de bereide sensor cocktail wordt op de PET-folie uitgespreid als een dunne lijn voor het mes-coating apparaat. C) het mescoating apparaat wordt naar beneden verplaatst om de sensor cocktail te verspreiden als een dunne film op de PET-folie, die na het verdampen van het oplosmiddel resulteert in een gebruiksklaar planaire optode. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Rhizo-sandwich kamer assemblage met integratie van een Planar O2 optode. A) de optode wordt op één van de glazen platen met een water film bevestigd. B) de optode wordt met elektrische tape aan de plaat vastgelijmd. C) het sediment wordt in de tegengestelde plaat gevuld met de bijgevoegde spacers (d.w.z. Microscoop-dia's). D) de wortels van de plant worden op het gelijkmatig gespreide sediment geplaatst. E) de rhizo-sandwich kamer is gesloten en tijdelijk met klemmen bevestigd. F) volledig gesloten en geassembleerde rhizo-sandwich kamer. G) om de optode te beschermen tegen blootstelling aan licht door de incubatie lamp en om algengroei te voorkomen, wordt een plastic afdekking boven de gemonteerde rhizo-sandwich kamer geplaatst. H) de rhizo-sandwich kamer geïnineerd in een aquarium. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 3: Imaging Setup met de op frequentiedomein gebaseerde luminescentie levensduur camera, met de doelstelling gericht op het monster met de optode van achteren via het transparante aquarium en de rhizo-sandwich kamer wanden. De lichtgeleider van de LED-excitatie bron wordt gepositioneerd om het monster gelijkmatig te verlichten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: kalibratie curves voor Planar O2 optode. A) verschillende levensduur van fosforescentie gemeten bij de respectieve O2 -concentraties in de met water gevulde kalibratie kamer. B) Stern-Volmer-plot van de ijkgegevens die zijn aangebracht met gebruikmaking van het vereenvoudigde twee-site-model voor dynamische botstlessend (vergelijking 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: levenslange beeldvorming van de O2 -verdeling in de rhizosfeer van de aquatische plant Littorella uniflora. A) O2 verdeling na het in licht houden van de plant gedurende 12 uur bij ongeveer 500 μmol fotonen m-2 s-1. B) O2 verdeling na het in duisternis houden van de plant gedurende 1 h.C) structureel beeld van de wortels van de plant zoals te zien is via de planaire optode. D) transversale O2 -concentratie Profiel (de locatie wordt aangegeven door de gele lijn in paneel A en B) na 12 h in licht (rood) en 1 h in duisternis (zwart). Aangepast met toestemming van (koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. luminescentie levenslange beeldvorming van chemische sensoren-een vergelijking tussentijd-domein en frequentie-domein gebaseerde camera systemen. Analytische chemie. 91 (5), 3233-3238, DOI: 10.1021/ACS. analchem. 8b05869 (2019)). Copyright (2019) American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
In dit protocol wordt de volledige werkstroom van optode voorbereiding tot O2 beeldanalyse gedekt. Door dit protocol te volgen, kunnen chemische beelden worden verkregen met behulp van de nieuwe frequentie-domein gebaseerde luminescentie Lifetime camera. Afhankelijk van de toepassing, de Planar optodes kunnen worden vervaardigd in verschillende maten en laagdikte van de sensor laag, variërend van robuuste 50-100 μm dik Planar optodes van verschillende tienden van vierkante centimeter tot Microscoop dekken stroken met < 1 μm dikke sensor lagen6,40. Het potentieel van deze methode werd aangetoond met een bepaalde toepassing, maar is niet alleen beperkt tot O2 beeldvorming in plant rhizospheres12,28.
Deze methode heeft verschillende voordelen in vergelijking met zuivere luminescentie-intensiteit gebaseerde chemische beeldvormingsmethoden. Luminescentie Lifetime Imaging is niet, of in ieder geval veel minder, beïnvloed door ongelijke belichting, ongelijke optode dikte en foto bleken25. Deze methode vermijdt ook het gebruik van een extra referentie kleurstof die vaak voorkomt in ratiometrische beeldvorming17,37. In vergelijking met andere levenslang gebaseerde camerasystemen, zoals veelgebruikte gated time-Domain camera's8,26, het nieuwe camerasysteem en protocol gepresenteerd hier kan vergelijkbare resultaten opleveren. In een recente publicatie werden de analytische kenmerken van deze twee systemen vergeleken en bleek dat het op frequentie-domein gebaseerde luminescentie Lifetime camerasysteem op zijn minst vergelijkbaar is met de beëindigde tijd-domein-gebaseerde voorganger8.
We hebben de eenvoudigste O2 optode gepresenteerd die alleen bestaat uit een indicator in een polymeer matrix. Naast meerdere andere mogelijke O2 -indicatoren20 die kunnen worden gebruikt, kunnen additieven worden opgenomen, d.w.z. verstrooiings middelen zoals Tio2 of Diamond Powder2 om het sensorsignaal te verhogen en tegelijkertijd de transparantie van de optode te verminderen. Ook kunnen extra kleurstoffen worden gebruikt om de signaalintensiteit te verbeteren via energie overdracht41.
Voor planaire optode fabricage raden we aan een spleet te gebruiken in het mes-coating apparaat van 75-120 μm om een uiteindelijke sensorlaag dikte te leveren van ongeveer 7,5 tot 12 μm na het verdampen van het oplosmiddel (ongeveer 10% van de gebruikte kloof), bij gebruik van de beschreven sensor cocktail samenstelling. Dit is een goed compromis tussen de signaalintensiteit, die kan worden gewijzigd door een hogere kleurstof belasting, of door indicator-en referentie kleurstoffen van hogere helderheid en responstijd te kiezen. Een toename van de laagdikte resulteert in een toename van de responstijd, omdat de tijd die nodig is voor de analyt om een thermodynamisch evenwicht in de sensorlaag te bereiken met de omringende media12stijgt.
Optodes, zoals hier beschreven, reageren op veranderingen in O2 concentratie binnen een paar seconden17 terwijl nog steeds een voldoende sterke luminescentie signaal. Ultradunne sensor coatings met subseconde responstijden kunnen worden gerealiseerd met spin-coating6. Als de ondersteuning of het mes-coating apparaat niet goed gereinigd is, kan dit resulteren in inhomogene sensor lagen. Ook wanneer de cocktail niet volledig homogeen is of te snel wordt aangebracht na verspreiding vóór de coating, kan een ongewenst resultaat worden waargenomen. Daarom is het wellicht wat oefening nodig om optimale optodes voor te bereiden.
De methode kan worden gebruikt voorbeeld monsters die in nauw contact kunnen worden gebracht met de optode, zoals bepaalde zeedieren42, biofilms6 en bodems31 om er maar een paar te noemen. We presenteren een standalone Setup met een doel, maar de camera kan gemakkelijk worden gekoppeld aan een Microscoop voor een hogere resolutie chemische Imaging43.
Terwijl Time-Domain gebaseerd luminescentie levensduur Imaging ingeschakeld onderdrukking van achtergrond fluorescentie26, dit is een probleem bij het gebruik van de nieuwe frequentie-domein-gebaseerde camerasysteem8. Door de continue beeld verwerving zal deze camera elke achtergrond fluorescentie van het monster opnemen die kan worden opgewekt door de geselecteerde LED en uitzendt in het geselecteerde spectrale venster zoals gedefinieerd door het emissie filter op de camera doelstelling. Dit zal resulteren in een schijnbaar lagere levensduur en dus in valse lezingen. In het geval dat u met monsters werkt met een significante intrinsieke fluorescentie die overlapt met de O2 sensor excitatie en-emissie, is het essentieel om een extra optische isolatie toe te passen bovenop de optode, door een extra laag met Carbon Black2,17te coaten. Zo zal alleen de luminescentie die uit de planaire optode wordt uitgezonden de camera bereiken. Om te controleren op achtergrond luminescentie kan een afbeelding zonder de optode worden genomen, die dan uitsluitend intrinsieke luminescentie van het monster zou vertonen. Het is ook mogelijk om verstrooiings middelen zoals Tio2 of Diamond Powder2,44toe te voegen aan de cocktail van de sensor, om de luminescentie intensiteit van de indicator kleurstof te verhogen. Dit kan echter ook leiden tot een snellere bleken van Foto's en Tio2 is een bekende Photo-Catalyst, die de foto stabiliteit van een kleurstof41kan aantasten. Een ander aspect om te overwegen is achtergrondlicht. Als de levensduur van de Imaging wordt verlicht, moet het achtergrondlicht zo efficiënt mogelijk worden vermeden. Daarom vereist deze beeldvormings methode dat de instellingen in een donkere omgeving worden geplaatst en dat elke externe lichtbron tijdelijk moet worden uitgeschakeld tijdens het verzamelen van afbeeldingen.
Kortom, luminescentie Lifetime Imaging is een robuuste chemische beeldvormings methode die kan worden aangepast aan veel verschillende toepassingen. Dit protocol (zie paragraaf 1-5) behandelt alle essentiële stappen voor het genereren van een afbeelding O2 en maakt gebruik van het momenteel meest flexibele frequentie-domein luminescentie levensduur beeldvormings systeem, dat de beëindigde gated time-Domain camera voor 2D O2 Imaging met Planar optodes kan vervangen.
Disclosures
De auteur Gerhard Holst is een werknemer van PCO AG die het camerasysteem vervaardigt dat in dit artikel wordt gebruikt. PCO AG heeft financieel bijgedragen aan de publicatie en de Open Access kosten van dit artikel.
Acknowledgments
We danken Sofie Lindegaard Jakobsen (Universiteit van Kopenhagen) en Lars Borregaard Pedersen (Universiteit van Aarhus) voor technische assistentie. De financiering van deze studie werd verkregen uit een sapere-Aude Advanced Grant van het onafhankelijke onderzoeksfonds Denemarken (DFF-1323-00065B; MK), projectsubsidies van het onafhankelijke onderzoeksfonds Denemarken | Natuurwetenschappen (DFF-8021-00308B; MK) & technische en productie Wetenschappen (DFF-8022-00301B en DFF-4184-00515B; MK), de Deense National Research Foundation (DNRF136), en de Poul Due Jensen Foundation (KK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air pump with air stone and water pump | Local aquarium store | ||
| Chloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| DC4 silicone compound | Dow Corning GmbH | 2793695 | |
| Gas mixer | Vögtlin Instruments GmbH | red-y compact meter GCM | This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices |
| Glass plates and aquaria | Local aquarium or hardware store | ||
| ImageJ Software | ImageJ | Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html) | |
| Knife-coating device | BYK-GARDNER GMBH byk.com |
2021 | This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation. |
| LED lamp, Reflector PAR38 | Megaman | MM17572 | |
| LED LEDHUB | Omicon Laserage, Germany | Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential | |
| LOCTITE AA 3494 | Henkel AG & Co. KGaA | NA | Acrylic-based instant adhesive |
| NIS Elements AR Software | Nikon Inc | Software package used for image acquisition | |
| pco.flim | PCO AG, Germany | Frequency domain based luminescence lifetime camera | |
| platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP) | Frontier Scientific | PtT975 | O2 indicator |
| polyethylene terephthalate (PET) foil | Goodfellow | 320-992-72 | Such foils might also be found from other providers and serve as solid support |
| Polystyrene (PS) | Sigma Aldrich | 9003-53-6 | Polymer matrix |
| Schott RG610 filter | www.uviroptics.com | Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective | |
| Vinyl electrical tape | Scotch, Super 33+ | NA | |
| Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor | delivered with the camera | Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount |
References
- Glud, R. N., Kühl, M., Kohls, O., Ramsing, N. B. Heterogeneity of oxygen production and consumption in a photosynthetic microbial mat as studied by planar optodes. Journal of Phycology. 35 (2), 270-279 (1999).
- Moßhammer, M., Strobl, M., Kühl, M., Klimant, I., Borisov, S. M., Koren, K. Design and Application of an Optical Sensor for Simultaneous Imaging of pH and Dissolved O2 with Low Cross-Talk. ACS Sensors. 1 (6), 681-687 (2016).
- Jensen, S. I., Kühl, M., Glud, R. N., Jørgensen, L. B., Priemé, A. Oxic microzones and radial oxygen loss from roots of Zostera marina. Marine Ecology Progress Series. , 49-58 (2005).
- Larsen, M., Santner, J., Oburger, E., Wenzel, W. W., Glud, R. N. O2 dynamics in the rhizosphere of young rice plants (Oryza sativa L.) as studied by planar optodes. Plant and Soil. 390 (1-2), 279-292 (2015).
- Brodersen, K. E., Koren, K., Moßhammer, M., Ralph, P. J., Kühl, M., Santner, J. Seagrass-Mediated Phosphorus and Iron Solubilization in Tropical Sediments. Environmental Science and Technology. 51, 14155-14163 (2017).
- Kühl, M., Rickelt, L. F., Thar, R. Combined imaging of bacteria and oxygen in biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 73 (19), 6289-6295 (2007).
- Sønderholm, M., et al. Tools for studying growth patterns and chemical dynamics of aggregated Pseudomonas aeruginosa exposed to different electron acceptors in an alginate bead model. npj Biofilms and Microbiomes. 3, 1-11 (2018).
- Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S. M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Analytical Chemistry. 91 (5), 3233-3238 (2019).
- Brodersen, K. E., Koren, K., Lichtenberg, M., Kühl, M. Nanoparticle-based measurements of pH and O2 dynamics in the rhizosphere of Zostera marina L.: effects of temperature elevation and light-dark transitions. Plant, Cell & Environment. 39 (7), 1619-1630 (2016).
- Zhu, Q., Aller, R. C., Fan, Y. High-Performance Planar pH Fluorosensor for Two-Dimensional pH Measurements. in Marine Sediment and Water. Environmental Science & Technology. 39, 8906-8911 (2005).
- Murniati, E., Gross, D., Herlina, H., Hancke, K., Glud, R. N., Lorke, A. Oxygen imaging at the sediment-water interface using lifetime-based laser induced fluorescence (τLIF) of nano-sized particles. Limnology and Oceanography: Methods. 14 (8), 506-517 (2016).
- Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils - a review. Analytica Chimica Acta. , 9-42 (2015).
- Glud, R. N.
- Revsbech, N. P., Jorgensen, B. B., Blackburn, T. H. Oxygen in the Sea Bottom Measured with a Microelectrode. Science. 207 (4437), 1355-1356 (1980).
- Klimant, I., Meyer, V., Kuhl, M. Fiberoptic oxygen microsensors, a new tool in aquatic biology. Limnology and Oceanography. 40 (6), 1159-1165 (1995).
- Glud, R. N., Tengberg, A., Kühl, M., Hall, P. O. J., Klimant, I., Holst, G. An in situ instrument for planar O2 optode measurements at benthic interfaces. Limnology and Oceanography. 46 (8), 2073-2080 (2001).
- Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9, 348-360 (2011).
- Glud, R., Ramsing, N., Gundersen, J., Klimant, I. Planar optrodes:a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
- Frederiksen, M. S., Glud, R. N. Oxygen dynamics in the rhizosphere of Zostera marina: A two-dimensional planar optode study. Limnology and Oceanography. 51 (2), 1072-1083 (2006).
- Quaranta, M., Borisov, S. M., Klimant, I. Indicators for optical oxygen sensors. Bioanalytical Reviews. 4, 115-157 (2012).
- Koren, K., Hutter, L., Enko, B., Pein, A., Borisov, S. M., Klimant, I. Tuning the dynamic range and sensitivity of optical oxygen-sensors by employing differently substituted polystyrene-derivatives. Sensors and Actuators B: Chemical. 176 (100), 344-350 (2013).
- Borisov, S. M. Fundamentals of Quenched Phosphorescence O2 Sensing and Rational Design of Sensor Materials. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. , 1, Chapter 1 1-18 (2018).
- Wang, X., Wolfbeis, O. S. Optical methods for sensing and imaging oxygen: materials, spectroscopies and applications. Chemical Society Reviews. 43, 3666-3761 (2014).
- Ehgartner, J., Wiltsche, H., Borisov, S. M., Mayr, T. Low cost referenced luminescent imaging of oxygen and pH with a 2-CCD colour near infrared camera. The Analyst. 139 (19), 4924 (2014).
- Meier, R. J., Fischer, L. H., Wolfbeis, O. S., Schäferling, M. Referenced luminescent sensing and imaging with digital color cameras: A comparative study. Sensors and Actuators B: Chemical. 177, 500-506 (2013).
- Holst, G., Kohls, O., Klimant, I., König, B., Kühl, M., Richter, T. A modular luminescence lifetime imaging system for mapping oxygen distribution in biological samples. Sensors and Actuators B. 51, 163-170 (1998).
- Moßhammer, M., Brodersen, K. E., Kühl, M., Koren, K. Nanoparticle- and microparticle-based luminescence imaging of chemical species and temperature in aquatic systems: a review. Microchimical Acta. , 1-28 (2019).
- Koren, K., Kühl, M. CHAPTER 7. Optical O2 Sensing in Aquatic Systems and Organisms. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. 1, 145-174 (2018).
- Chen, H., Holst, G., Gratton, E. Modulated CMOS camera for fluorescence lifetime microscopy. Microscopy Research and Technique. 78, 1075-1081 (2015).
- Franke, R., Holst, G. A. Frequency-domain fluorescence lifetime imaging system (pco.flim) based on a in-pixel dual tap control CMOS image sensor. Proceedings of SPIE 93281, Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues XIII. , 1-19 (2015).
- Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
- Schreml, S., et al. 2D luminescence imaging of physiological wound oxygenation. Experimental dermatology. 20 (7), 550-554 (2011).
- Trampe, E., et al. Functionalized Bioink with Optical Sensor Nanoparticles for O2 Imaging in 3D-Bioprinted Constructs. Advanced Functional Materials. 1804411, 1804411 (2018).
- Gouterman, M. Oxygen Quenching of Luminescence of Pressure Sensitive Paint for Wind Tunnel Research. Journal of Chemical Education. 74 (6), 697 (1997).
- Fischer, L. H., et al. Referenced dual pressure- and temperature-sensitive paint for digital color camera read out. Chemistry. 18 (49), 15706-15713 (2012).
- Fabricius-Dyg, J., Mistlberger, G., Staal, M., Borisov, S. M., Klimant, I., Kühl, M. Imaging of surface O2 dynamics in corals with magnetic micro optode particles. Marine Biology. 159 (7), 1621-1631 (2012).
- Koren, K., Jakobsen, S. L., Kühl, M. In-vivo imaging of O2 dynamics on coral surfaces spray-painted with sensor nanoparticles. Sensors and Actuators B: Chemical. 237, 1095-1101 (2016).
- Carraway, E. R., Demas, J. N., DeGraff, B. A., Bacon, J. R. Photophysics and Photochemistry of Oxygen Sensors Based on Luminescent Transition-Metal Complexes. Analytical Chemistry. 63 (4), 337-342 (1991).
- Klimant, I., Ruckruh, F., Liebsch, G., Stangelmayer, A., Wolfbeis, O. S. Fast response oxygen micro-optodes based on novel soluble ormosil glasses. Mikrochimica Acta. 131, 35-46 (1999).
- Askaer, L., Elberling, B., Glud, R. N., Kühl, M., Lauritsen, F. R., Joensen, H. P. Soil heterogeneity effects on O2 distribution and CH4 emissions from wetlands: In situ and mesocosm studies with planar O2 optodes and membrane inlet mass spectrometry. Soil Biology and Biochemistry. 42 (12), 2254-2265 (2010).
- Mayr, T., Borisov, S. M., Abel, T., Enko, B., Waich, K. Light Harvesting as a Simple and Versatile Way to Enhance Brightness of Luminescent Sensors. Analytical Chemistry. 81, 6541-6545 (2009).
- Kühl, M., et al. Microenvironmental Ecology of the Chlorophyll b-Containing Symbiotic Cyanobacterium Prochloron in the Didemnid Ascidian Lissoclinum patella. Frontiers in microbiology. 3, 1-18 (2012).
- Dalfen, I., Dmitriev, R. I., Holst, G., Klimant, I., Borisov, S. M. Background-Free Fluorescence-Decay-Time Sensing and Imaging of pH with Highly Photostable Diazaoxotriangulenium Dyes. Analytical Chemistry. 91 (1), 808-816 (2019).
- Chatni, M. R., Maier, D. E., Porterfield, D. M. Evaluation of microparticle materials for enhancing the performance of fluorescence lifetime based optrodes. Sensors and Actuators B: Chemical. 141, 471-477 (2009).
