Summary
Här beskriver vi syntesen av narkotikabelastade liposomer och deras mikroinjektion i larv zebrafisk i syfte att rikta läkemedelsleverans till makrofag-härstamning celler.
Abstract
Zebrafisk(Danio rerio)larver har utvecklats till en populär modell för att undersöka värdpatogeninteraktioner och bidraget från medfödda immunceller till inflammatorisk sjukdom på grund av deras funktionellt bevarade medfödda immunsystemet. De används också i stor utsträckning för att undersöka hur medfödda immunceller hjälper till att vägleda utvecklingsprocesser. Genom att dra nytta av den optiska transparensen och genetiska tarmkraften hos larv zebrafisk, fokuserar dessa studier ofta på levande bildmetoder för att funktionellt karakterisera fluorescerande märkta makrofager och neutrofiler inom intakta djur. På grund av deras olika funktionella heterogenitet och ständigt växande roller i sjukdomspatogenes, makrofager har fått stor uppmärksamhet. Förutom genetiska manipulationer används nu kemiska ingrepp rutinmässigt för att manipulera och undersöka makrofagbeteende i larvzebrafish. Leverans av dessa läkemedel är vanligtvis begränsad till passiv inriktning på fri drog genom direkt nedsänkning eller mikroinjektion. Dessa tillvägagångssätt bygger på antagandet att alla ändringar av makrofagbeteende är resultatet av en direkt effekt av läkemedlet på makrofager själva, och inte en nedströms konsekvens av en direkt effekt på en annan celltyp. Här presenterar vi våra protokoll för inriktning droger specifikt till larv zebrafisk makrofager genom microinjecting drog-loaded fluorescerande liposomer. Vi avslöjar att poloxamer 188-modifierade droglastade blå fluorescerande liposomer lätt tas upp av makrofager, och inte av neutrofiler. Vi ger också bevis för att läkemedel som levereras på detta sätt kan påverka makrofagaktivitet på ett sätt som är förenligt med mekanismen för läkemedlets verkan. Denna teknik kommer att vara av värde för forskare som vill säkerställa inriktning av läkemedel till makrofager och när läkemedel är för giftiga för att levereras med traditionella metoder som nedsänkning.
Introduction
Det mononukleära fagocytsystemet ger en första försvarslinje mot invaderande patogener. Detta system består av monocyter, monocyt-härledda dendritiska celler och makrofager, som aktivt fagocytoze utländska patogener, vilket begränsar patogen spridning. Förutom dessa fagocytiska och mikrobiska effektorfunktioner kan dedritiska celler och makrofager också cytokinproduktion och antigenpresentation aktivera det adaptiva immunsystemet1. Av dessa celler har makrofager fått särskild uppmärksamhet på grund av deras olika funktionella heterogenitet och engagemang i flera inflammatoriska sjukdomar, från autoimmunitet och infektionssjukdomar till cancer2,3,4,5,6,7. Makrofagers plasticitet och deras förmåga att funktionellt anpassa sig till behoven till sin vävnadsmiljö kräver experimentella metoder för att direkt observera och förhöra dessa celler in vivo.
Larval zebrafisk är en idealisk modell organism för att studera funktion och plasticitet makrofager in vivo8. Den optiska genomskinligheten hos larv zebrafisk ger ett fönster för att direkt observera makrofagers beteende, särskilt i kombination med makrofagmärkning transgena reporterlinjer. Utnyttja levande bildbehandling potential och experimentell auttlighet larv zebrafisk har lett till många betydande insikter i makrofag funktion som har direkt relevans för människors sjukdom9,10,11,12,13, 14,15. Många av dessa studier har också dragit nytta av den höga bevarandet av läkemedelsaktivitet i zebrafisk (ett attribut som ligger till grund för deras användning som en hel djurläkemedelsupptäcktplattform16,17,18), genom att använda kemiska interventioner för att farmakologiskt manipulera makrofagfunktion. Hittills har dessa farmakologiska behandlingar mestadels levererats antingen genom nedsänkning, vilket kräver att läkemedlet är vattenlösligt, eller genom direkt mikroinjektion av fritt läkemedel(figur 1A). Begränsningar av dessa passiva leveransstrategier omfattar effekter utanför målet och allmän toxicitet som kan förhindra att man bedömer eventuella effekter på makrofagfunktionen. Dessutom, när man undersöker läkemedelseffekter på makrofager är det okänt om drogerna agerar på makrofager själva eller genom mer indirekta mekanismer. När du utför liknande kemiska interventionsstudier för att undersöka makrofagfunktion, insåg vi att det fanns ett otillfredsställt behov av att utveckla en billig och enkel leveransmetod för att rikta läkemedel specifikt till makrofager.
Liposomer är mikroskopiska, biokompatibla, lipid bilayered blåsor som kan kapsla proteiner, nukleotider och narkotika last19. Unilamellar eller multilamellar lipid bilayer struktur liposomer bildar en vattenlösliga läkemedel kan införlivas medan hydrofoba läkemedel kan integreras i lipidmembranen. Dessutom kan de fysicokemiska egenskaperna hos liposomer, inklusive storlek, laddning och ytmodifieringar manipuleras för att skräddarsy sin inriktning till specifika celler20,21. Dessa funktioner i liposomer har gjort dem till ett attraktivt fordon för att leverera droger och förbättra precisionen i nuvarande behandlingsregimer20. Som liposomer är naturligt fagocytozed av makrofager (en funktion som utnyttjas av deras rutinmässiga användning för att leverera clodronate specifikt till makrofager för ablation experiment22),de presenterar som ett attraktivt alternativ för makrofag-specifika läkemedelsleverans(figur 1B).
Detta protokoll beskriver formuleringen av läkemedel till blå fluorescerande liposomer belagda med hydrofilpolymer poloxamer 188, som bildar ett skyddande lager på liposome ytan och har visat sig förbättra läkemedelsretention och har överlägsen biokompatibilitet23. Poloxamer valdes för ytbeläggning av liposomer som vår tidigare forskning hade visat att, jämfört med polyetenglykol modifierade liposomer, poloxamer modifierade liposomer visade bättre biokompatibilitet efter subkutan injektion av råtttassar och liknande farmakokinetik hos kaniner efter intravenös infusion23. Protokoll beskrivs också för deras mikroinjektion i larv zebrafisk och levande bildbehandling för att bedöma deras makrofag-inriktning förmåga och lokalisering till intracellulära fack som krävs för liposome nedbrytning och cytoplasmatisk läkemedelsleverans. Som ett proof-of-concept har vi tidigare använt denna teknik för att rikta två läkemedel till makrofager för att undertrycka deras aktivering i en larv zebrafisk modell av akut gouty inflammation24. Denna drogleveransteknik utökar den kemiska "verktygslåda" som finns tillgänglig för zebrafiskar forskare som vill säkerställa makrofag-inriktning av sina läkemedel av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av droglastade Marina Blue-märkta Liposomer
OBS: Liposomer bär den blå fluorescerande färgämne, Marina Blue och läkemedel är beredda med hjälp av en tunn film hydrering metod med post insättning av poloxamer 188. Alla procedurer utförs vid rumstemperatur om inte annat anges. Kontrollera liposomer bär bara Marina blå och PBS. Exemplet här beskriver lastning liposomer med en mitokondria-inriktning antioxidant läkemedel25 som används i representativa resultat som ett proof-of-concept.
- För att förbereda liposomer, lös upp 16,4 mg (22,2 μmol) av fosfolipiderna 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosphocholine (se Materials tabell ), 4.To prepare liposomes, dissolve 16.4 mg (22.2 μmol) av fosfolipiderna 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (se Materialstabell), 4.To prepare, 3 mg (11,1 μmol) kolesterol (se Materialtabell)och 2,8 mg (3,7 μmol) 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-fosphocholine (se Materialtabell, i 3 ml klorformen:metanol (3:1 v/v) i en 25 ml rundbottenkolv.
- Till ovanstående blandning, tillsätt 31 nmol marina blå 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (se Table of Materials) och 300 nmol av en mROS hämmande läkemedel (se Materialbord)och sonicate kort för att helt lösa upp. För kontroll liposomer, tillsätt bara Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine.
OBS: För att undvika fotoblekning av det ljuskänsliga Marina Blå lysrör, skydda alla förfaranden från ljus, där så är möjligt. Detta är också viktigt om läkemedlet som ska lastas är ljuskänsligt. - Ta bort lösningsmedlet långsamt på en roterande förångare (se Materialbord)över ett temperaturstyrt vattenbad som är satt till 45 °C genom att vrida vid 75 varv/min under vakuumtryck (200 mbar i 15 min sedan 0 mbar i 20 min). Detta bildar en torr tunn lipidfilm inom kolvens glasväggar som torkas ytterligare i 45 min under N2 för att underlätta fullständigt avlägsnande av det organiska lösningsmedlet.
- Efter bildandet av tunnfilm, ställ in vakuumtrycket till 40 mbar i 15 min, sedan rensa med kvävegas i 30 min för att säkerställa avlägsnande av restmedel.
- Hydrat den tunna filmen med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7.4) och försegla med parafilm innan kolven retar snett sett över ett vattenbad på 60 °C i 20 min för att bilda vesicles.
- Under förutsättning att den hydrerade fjädringen på 7 cykler av frysning och tina genom frysning i vätska N2 i 3 min följt av nedsänkning i ett vattenbad på 45 °C i 7 min.
- Extrudeliposomes genom ett membran med hjälp av en mini-extruder (se Table of Materials)och 1,0 μm spår-etsade polykarbonat membran (se Table of Materials)för 2-6 cykler för att få stora unilamellar blåsor.
OBS: För att uppnå mer gynnsam inriktning mot makrofager, manipulera extrudering cykler tills diametern på liposomer är ca 1 μm26,27,28. - Kondensera de färska liposomerna till en pellet vid ultracentrifugering vid 186 000 x g och inkubera med 1 ml 1% poloxamer 188 (se Materialbord)lösning (10 mg/ml i PBS) vid 45 °C och 750 rpm i 30 min med hjälp av en termomixer med en 2 ml mikrocentrifugrörfastsättning (se Materialbord).
- Ultracentrifuge blandningen vid 186.000 x g för 1 h vid 4 °C och ta bort supernatanten för att avlägsna obunden polymer eller läkemedel. Förvara liposomernapellets vid 4 °C, skyddad mot ljus.
2. Karakterisering av Liposome Storlek och Zeta Potential
- Späd liposome formulering med ultrapuret vatten (1:100) och mäta partikelstorlek, polydispersity index (PDI) och zeta potential liposomer med hjälp av en dynamisk ljus spridning analysator (se Table of Materials), i triplicate vid 25 °C.
OBS: PDI är ett mått på storleken fördelningen av nanopartikelbefolkningen. PDI-värden < 0,05 anger en jämnare fördelning medan värden närmare 1 anger en större storleksfördelning. Zeta potentialen är den totala ytladdningen.
3. Beräkning av entrapment effektivitet och droglastning i liposomer
OBS: För att bestämma entrapment effektivitet läkemedel i liposomer, läkemedlet innehållet i supernatant och liposome pellet mäts.
- Resuspend liposome pellet i 1 ml PBS.
- Ta bort supernatanten, späd 10 x med ultrarent vatten och analysera genom högpresterande flytande kromatografi (HPLC).
- För att bestämma läkemedelskoncentrationen inom liposomerna, tillsätt 100 μl liposome suspension till 900 μL av 10% triton-X100 lösning (för att förstöra lipidmembranet, släppa det fastspända läkemedlet och förhindra lipid bygga upp inom HPLC kolumnen) och virvel i 3 min före analys.
- Injicera 20 μl prov i ett HPLC-system bestående av en kvartär pump, termostatautoprovare och en 3 μm 250 x 4,6 mm kolonn. Ställ in mobilfasen (10 mM PBS pH 2.5, acetonitrile och metanol (30:40:30, v/v/v)) flöde till 0,9 ml/min och få spektrala profiler med hjälp av en diodarraydetektor inställd på 230 mM.
- Beräkna entrapmenteffektivitet (EE) och droglastning (DL) med hjälp av följande ekvationer:
EE (%) = [Jag / Mt] x 100
DL (%) = [Jag / Mlip] x 100
Där jag är massan av läkemedel inkapslade, Mt är den totala massan av läkemedel som används under formuleringen och Mlip är den totala massan av lipider (inklusive kolesterol) och inkapslade läkemedel.
4. Beredning och injektion av liposomer
- Förbered borosilikat mikroinjektionnålar genom att sätta in en tunn väggborosilikat glaskapillär (1 mm O.D. x 0,78 mm ID x 10 cm längd) i en micropipett avdragare enhet (se Table of Materials) med följande generiska avdragare inställningar (värme 680, dra 75, hastighet 40, tid 55 och tryck 530) för att producera en avsmalnande mikroinjektion nål.
- Placera nålarna i en Petri maträtt på modellering lera och ordna på ett sätt som den dragna änden inte vidrör botten av skålen. Håll Petri skålen locket stängt för att undvika dammkontaminering tills klar för användning.
- Späd nyberedda liposomformuleringar 1:1 i sterilpbs (pH 7,4) och kort virvel (2-3 s) att blanda.
OBS: Skydda liposomer från ljus tills larverna är redo för mikroinjektion. - Ställ upp vuxna zebrafisk avelpar kvällen innan och samla embryon som tidigare beskrivits av Rosen et al.29.
- Överför embryona till en Petriskål (100 mm x 20 mm stil med cirka 60 embryon per maträtt) som innehåller E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) kompletterad med 0,1% metylenblå för att hämma svamptillväxt. Avlägsna alla döda eller obefruktade embryon och inkubera över natten vid 28,5 °C.
- För att underlätta levande bildbehandling, tillsätt 0,003% N-Fenylthiourea (PTU) till E3 media när embryona når 24 h utveckling för att förhindra pigmentbildning (melanisering).
- Dechorionate embryona manuellt vid cirka 30 h efter befruktning (hpf) med hjälp av fina spetspincett.
OBS: Använd inte enzymatisk behandling för att dechorionate embryon eftersom detta kan orsaka epitelskador och lokal inflammation och därigenom påverka immunologiska studier - Låt embryona utvecklas vid 28,5 °C fram till 2 dagar efter befruktningen (dpf).
- Förbered en injektionsplatta genom att hälla tillräckligt med 3% metylcellulosa (i E3-media) i locket på en liten 35 mm kulturrätt för att bilda en tunn film som täcker hela ytan.
OBS: När du förbereder 3% metylcellulosa i E3 media, det tar flera dagar för metylcellulosa att lösas upp med mild agitation på en orbital shaker. - Bedövningsmedel genom att inkubera i E3-medier kompletterat med 200 μg/ml tricain.
- Samla en pool med cirka 20-25 larver med hjälp av en plastöverföringspipett och låt embryona koncentrera sig på pipettens spets av gravitationen. Var noga med att överföra larverna med minimal vätska, placera dem i mitten av 35 mm kultur skålen locket.
- Ordna larverna på följande sätt med hjälp av en mikrokapillär lastare: främre mot injektionsplattans överkant med den dorsala ytan vänd mot mikroinjektionsnålen, för att injicera i bakhjärnans ventrikel (figur 2A-D); eller, främre mot vänster om injektionsplattan (vid injektion från höger) med den ventrala ytan vänd mot mikroinjektionsnålen för att injicera i sinusvenosus(figur 2I).
OBS: När den injiceras på detta sätt, hindbrain ventrikel-bosatt(Figur 2E) och caudal hematopoietic vävnad (CHT)-bosatt(figur 2J)makrofager kan riktas, respektive. CHT regionen larv zebrafisk är en hematopoietic webbplats som liknar däggdjur fetala lever. Var extra uppmärksam på att inte skada embryona samtidigt ordna eftersom detta kan orsaka lokal inflammation och därigenom påverka immunologiska studier. - Ta nyberedda liposomer (från steg 4.3) och fyll tillbaka en injektionsnål med ca 5 μL av den liposomska injektionsmixen med hjälp av en mikrokapillärlastare (se Materialstabell).
OBS: Vid bedömning av lokaliseringen av liposomer till makrofagers feoksomala fack(figur 2H),komplettera denna injektionsblandning med 200 μg/ml av en röd fluorescerande markör för fallovet (se Materialtabell)och 100 nM av en mycket röd lysosommarkör (se Materialtabell)för att markera phagosomer30,31 respektive lysosomer32. - Montera nålen i en mikromanipulator (se Materialbord)som är anslutet till ett magnetiskt stativ och en tryckinjektor (se Materialtabell). Placera under ett stereomikroskop och ställ in injektorn på en pulstid på cirka 50 ms och ett injektionstryck på cirka 40 psi.
- Skär mikroinjektionsnålens spets med rena fina spetsagg för att generera en öppning på cirka 5 μm i diameter.
- Kalibrera den volym som ska injiceras genom att injicera en bolus i en droppe mineralolja placerad över rutnätslinjerna i en hemocytometer. Justera pulstiden och/eller injektionstrycket tills bolusdiametern täcker 2,5 av de minsta rutnätslinjerna (detta motsvarar en volym på cirka 1 nL).
- Injicera försiktigt 1 nL av den liposomska injektionsblandningen i hindbrainventrikeln hos varje larver.
OBS: När du injicerar i hindbrain ventrikeln, var noga med att inte tränga för långt ventrally (bortom hindbrain) eftersom detta kan störa den underliggande vaskulatur som leder till blödningar. När du injicerar i sinus venosus, bör försiktighet vidtas för att säkerställa spetsen av nålen är bara inom hjärtsäcken och inte tränga in i äggula. - Efter injektion, omedelbart överföra injicerade larver tillbaka till E3-media genom att lägga Till E3-media till injektionsplattan och försiktigt agitera larverna ur metylcellulosan med hjälp av en plastöverföring pipett.
- Inkubera larverna vid 28,5 °C (skyddad från ljus) tills analys av levande konfokal avbildning.
5. Confocal Imaging och bildanalys för att bekräfta makrofag inriktning liposomer
- Värm ett vattenbad till 50 °C.
- Bedövningsdämpande injicerade larver genom att överföra till en ny Perti-skål som innehåller E3-medier kompletterat med 0,003% PTU och 200 μg/ml Tricaine.
- Förbered levande bildmonteringsmedium genom att upplösa 1% låg smältpunkt agarose i E3 media, kompletterad med 0,003% PTU, i en mikrovågsugn. Placera i vattenbadet och när lösningen har svalnat till 50 °C, tillsätt 200 μg/ml Tricaine.
- Förvara monteringsmediet i vattenbadet 50 °C för att förhindra för tidig polymerisering av agarose.
- För att avbilda bakhjärnans dorsala yta på ett konfokaltmikroskop utrustat med en vattennedsänkningslins (Figur 2E), bädda in larverna enligt följande: Fyll en 35 mm kulturrätt med monteringsmediet (till ett djup av ca 5 mm) och låt den polymerisera. Gräv ut ett litet dike i agarose som är av tillräcklig storlek för att rymma äggula säcken.
- Fyll en plastöverföring pipett med smält monteringsmedium, utvisa en liten mängd och använd den för att samla in de anaesthetiserade larverna. Överför omedelbart larverna till odlingsskålen och orientera rulusäckarna, ventrala sidan nedåt, i de utgrävda hålen med hjälp av en mikrokapillärlastare. Regelbundet behålla dem i detta läge tills agarose polymerizes. Överlägg med E3-medier kompletterat med 200 μg/ml Tricaine.
OBS: När du överför och placerar larver, var noga med att inte orsaka epitelskador och lokal inflammation som kan påverka immunologiska studier. För placering av larver för att leva bilden CHT regionen (Figur 2J), montera enligt beskrivningen ovan, men placera larverna i det utgrävda hålet i sidled. - När bildbehandling på ett inverterat konfokalmikroskop bäddar du in larverna, utan aupprossängen, direkt på botten skålens botten. Ordna dem dorsala yta ner (eller i sidled) och efter polymerisering, täck hela skålen ytan med ett jämnt lager av monteringmedium. När polymerized, tillsätt ett tunt lager av E3-medier kompletteras med 200 μg/ml tricaine.
- För att leva bild hindbrain ventrikeln på ett konfokalmikroskop, använd följande inställningar: 512 x 512 pixlar; 40 x 3 μm Z-stackar (som sträcker sig från dorsala mest yta av hindbrain); 20x mål; 2.5x zoom.
OBS: Vid jämförelse av signalintensiteter mellan prover (t.ex. vid avbildning av upptaget av Marina Blue-märkta liposomer injiceras inom reporterlinjer som markerar antingen makrofager [Tg(mpeg1:EGFP)33] eller neutrofiler [Tg(lyz:EGFP)34]), är det viktigt att laserinställningarna hålls desamma (t.ex. håldiameter, laserspänning, offset och förstärkning) för att säkerställa att eventuella skillnader inte är en artefakt av ändrade bildförvärvsinställningar. - Använd 3D-bildanalysprogramvara för att kvantifiera makrofag eller neutrofil upptag av Marina Blue-märkta liposomer. För att kvantifiera antalet celler som innehåller liposomer(figur 2F) i en Z-stack, bläddra igenom de enskilda Z-sektionerna och räkna antalet enskilda celler som innehåller Marina Blue-märkta liposomer. För att kvantifiera fluorescensintensiteten hos liposomer i celler(figur 2G),rita en region av intresse runt varje cell (i X, Y och Z dimensioner) för att kvantifiera den totala eller genomsnittliga fluorescensintensiteten i intracellulära Marina Blue.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tunna filmen hydrering strategi som beskrivs här för framställning av fluorescerande liposomer omsluter droger är en enkel och kostnadseffektiv metod. Med det protokoll som används i denna studie, liposomerna förväntas vara unilamellar23,24. Storleken, zeta potential, drog lastning och entrapment effektivitet liposomer som produceras sammanfattas i tabell 1. Partikelstorleken på liposomerna (före och efter läkemedelsbelastning) är likartade(tabell 1). Ytladdningen (zetapotential) av droglastade liposomer är något mer neutral jämfört med kontrollliposomer, men de är alla negativt laddade vilket innebär att detta inte kommer att avsevärt ändra deras biodistribution mönster.
Mikroinjektion av Marina Blue-märkta liposomer i hindbrain ventrikeln resulterar i snabb upptag av inhemska makrofager som lätt kan observeras genom konfokal mikroskopi med 3 h post injektion, när injiceras i makrofag härstamning-märkning transgena reporter linje Tg (mpeg1:EGFP)33 (Figur 2C,E-G). Detta står i kontrast till neutrofiler (som märks inom den neutrofilspecifika Tg(lyz:EGFP)34-reporterlinjen) som sällan observeras innehållande intracellulära liposomer(figur 2E-G). Inom enskilda liposom-lastade makrofager ackumuleras liposomerna inom fagolysosomalfack (figur 2H), vilket är nödvändigt för liposome nedbrytning och den efterföljande frisättningen av deras läkemedelsinnehåll i cytoplasman35. Välja olika mikroinjektion siatoner för liposome leverans kan påverka vilka vävnad-bosatt makrofager är riktade. Som exempel, leverans i hindbrain ventrikeln effektivt mål hindbrain-bosatt makrofager(Figur 2D,E) medan mikroinjektion i sinus venosus kan leverera liposomer till CHT-bosatta makrofager via cirkulationen(figur 2I,J).
Övervägande av mikroinjektionsstället för liposome leverans är viktigt när du använder denna teknik för att förhöra makrofag svar på en immunologisk utmaning eftersom det bidrar till att säkerställa särskilda makrofager under utredning får drogen. Vi har rutinmässigt använt detta protokoll för leverans av narkotika-lastade liposomer i hindbrain ventrikeln för att bedöma effekterna av dessa läkemedel på makrofag svar på mononatriumuat (MSU) kristaller, på samma sätt injiceras i bakhjärnan facket(Figur 3A). Som orsaksmedel för akut gouty inflammation, MSU kristaller aktivera vävnad-bosatta makrofager för att producera proinflammatoriska medlare inklusive Interleukin-1β (IL-1β) genom en process beroende av mitokondriellre reaktiva syrearter (mROS)10,36,37,38. Dessa aktiverade makrofager kör sedan neutrofil infiltration, ett kännetecken för akut gouty inflammation. Mikroinjektion av liposomer laddade med ett mROS-hämmande läkemedel i hindbrain ventrikeln kan avsevärt undertrycka MSU kristalldriven mROS produktion inom liposome-lastad hindbrain-resident makrofager (Figur 3B-D). Med hjälp av det protokoll som beskrivs här uppnådde vi en entrapmenteffektivitet på 49,12 ± 0,17 %, vilket resulterade i en formulering med en läkemedelskoncentration på 103,05 ± 0,36 μM. Notera, injicera en 1 nL volym vid denna koncentration resulterade i någon observerbar toxicitet under våra experiment, vilket framgår av grova morfologiska förändringar eller hjärtstillestånd. Ytterligare validering av de suppressiva effekterna av detta läkemedel på makrofag aktiveringtillstånd kan utföras genom att undersöka il1b uttryck (zebrafish ortolog av IL-1β) genom hela fästet in situ hybridisering(figur 4A,B) och tidsmässig rekrytering av neutrofiler(figur 4C,D).
Figur 1: Schematisk illustrerar konventionell fri drogleverans kontra liposome-medierad läkemedelsleverans till larv zebrafisk. (A)Strategier som rutinmässigt används för läkemedelsleverans till larv zebrafisk är till stor del begränsade till nedsänkning i eller mikroinjektion av, fri drog. (B)Mikroinjektion av läkemedel-laddade liposomer möjliggör direkt inriktning på makrofager, där liposome nedbrytning inom phagolysosomal fack resulterar i cytoplasmatisk läkemedelsleverans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Inriktning droger till makrofager med fluorescerande liposomer. (A)Microinjection set-up som visar mikroinjektionnål (svart pil) och larver arrayed i en 35 mm vävnad sikande inom 3% metylcellulosa. (B)Förstorad vy över larver som är arrayade som i A. (C) Levande konfokal bild av 2 dpf Tg(mpeg1:EGFP) larver, främre till vänster. (D)Förstorad syn på arrayed larver, som i A, visar mikroinjektion i hindbrain ventrikeln (svart pil markerar mikroinjektion nål). (E)Schematiska illustrerar inriktning en hindbrain-bosatt makrofager och levande konfokal bilder (dorsala vyer, främre till vänster) i hindbrain regionen Tg (mpeg1:EGFP) och Tg (lyz:EGFP) larver, 3 h efter hindbrain mikroinjektion av Marina Blue-märkta liposomer (vita pilar markerar liposom-lastad makrofager). (F och G)Kvantifiering av liposomupptag av makrofager och neutrofiler (som detekteras i E), mätt som antalet celler som innehåller (F)och fluorescensintensiteten/cellen(G)marina blåmärkta liposomer. (H)Levande konfokal bild av liposome-lastad makrofag i hindbrain märkt med en röd fluorescerande markör av phagosomer och en mycket röd fluorescerande markör lysosomer inom Tg (mpeg1:EGFP) larver, 3 h efter hindbrain mikroinjektion av Marina Blue-märkta liposomer. (I)Förstorad syn på arrayed larver, som i A, visar mikroinjektion i sinus venosus (svart pil markerar mikroinjektion nål). (J)Schematiska illustrerar inriktning en CHT-bosatt makrofager och levande konfokal bilder (laterala vyer, främre till vänster) i CHT regionen Tg (mpeg1:EGFP) och Tg (lyz:EGFP) larver, 3 h efter mikroinjektion av Marina Blue-märkta liposomer i sinus venosus (vita pilar markera liposome-lastad makrofager). Felstaplar visar medelvärde ± SD. *p<0.05; p < 0.0001, Student'st-test. Skalstänger = 100 mm (A), 100 μm (B), 250 μm (C, D och I), 10 μm (E), 5 μm (H), 50 μm (J). Denna siffra har ändrats från tidigare publicering24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mikroinjektion av liposomer laddade med ett mROS-hämmande läkemedel undertrycker mROS-produktion inom aktiverade makrofager. (A)Schematiska illustrerar inriktningen av ett mROS-hämmande läkemedel till makrofager och bedöma dess inverkan på makrofagaktivering efter MSU-kristallstimulering. (B och C)Levande konfokala bilder av liposom-lastad makrofager (kontroll liposomer/L-C (B) eller mROS-hämmande liposomer/L-MI (C))inom bakhjärnan av Tg(mpeg1peg:EGFP) larver, också märkt med en fluorescerande mROS-specifik sond (se Table of Materials, där fluorescerande signalen visas som en värmekarta med varma färger som representerar högre nivåer av mROS), 3 h efter hindbrain mikroinjektion av Marina Blue-märkta liposomer och MSU kristaller. Marina Blå fluorescens är pseudofärgad i gråskala. (D)Kvantifiering av fluorescensintensitet en mROS-specifik sond inom makrofager, enligt vad som upptäcks i B och C. Felstaplar visas medelvärde ± SD. ****p < 0.0001, Studentens t-test. Skalstång = 10 μm (B). Denna siffra har ändrats från tidigare publicering24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mikroinjektion av liposomer laddade med en mROS-hämmare undertrycker il1b uttryck inom aktiverade makrofager och makrofagdriven neutrofil rekrytering. (A)Uttryck för il1b (märkt med svarta pilar), som detekteras av hela fästet in situ hybridisering, inom hindbrainregionen 3 h efter hindbrain mikroinjektion av kontroll (L-C) eller mROS-hämmande liposomer (L-MI) och MSU kristaller, främre till vänster. Tal representerar andel larver med visade fenotyper. (B)Kvantifiering av il1b uttryck, som detekteras i A, visas som procent larver visar hög, låg eller inget uttryck. (C)Konfokala bilder av neutrofiler inom hindbrainregionen Tg(lyz:EGFP) larver (dorsala vyer, främre till vänster), som detekteras av immunofluorescens 3 (3 hpi) och 6 (6 hpi) h efter mikroinjektion av L-C eller L-MI och MSU-kristaller. D)Temporal kvantifiering av neutrofiler, enligt vad som upptäcks i C, 1 (1 hpi), 3 (3 hpi), 6 (6 hpi) och 9 (9 hpi) h efter hindbrain mikroinjektion av L-C eller L-MI och MSU kristaller. Felstaplar display medelvärde ± SD. ****p < 0.0001, n.s. inte betydande, enkelriktad ANOVA, Dunnett s post hoc-test. Skalstänger = 100 μm (A), 50 μm (C). Denna siffra har ändrats från tidigare publicering24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Physicochemical egenskap av liposomer (L) | Kontrollera liposomer | mROS-hämmande liposomer |
| Storlek (μm) | 1,2 ± 0,07 | 1,1 ± 0,04 |
| Zeta potential (mV) | -25,9 ± 0,57 | -13,0 ± 0,11 |
| Entrapment effektivitet (EE, %) | N/A | 49,12 ± 0,17 |
| Droglastning (DL, %) | N/A | 0,37 ± <0,01 |
Tabell 1: Fysikaliskt kemiska egenskaper hos PBS (kontroll) eller mROS-hämmande liposomer (data är medel ± standardavvikelse, n = 3). Alla liposomer var märkta med Marina Blue.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi lämnat ett detaljerat protokoll för att formulera droglastade liposomer för att specifikt rikta makrofager i larv zebrafisk. Denna metod kan användas för att dissekera makrofagers roll i vissa sjukdomsmodeller genom att säkerställa direkt riktad leverans av läkemedel specifikt till makrofager. Dessutom kan det användas när den allmänna toxiciteten av läkemedel begränsar deras användning när de levereras av mer konventionella rutter, som nedsänkning. Protokollet som beskrivs här ger ett alternativ till andra nanopartikelsystem som har använts för att rikta in sig på immunceller i larv zebrafisk. Dessa inkluderar inriktning mot antimalarial läkemedel rifampicin till Mycobacterium marinum-infekterademakrofager för att främja bakteriell clearance med hjälp av sub-micron storlek polymera nanopartiklar39. I ett annat exempel, inkapsling av (R)-roscovitine, en inducerare av neutrofil apoptos, inom polymerosomer har visat sig rikta detta läkemedel till neutrofiler, vilket främjar inflammation upplösning40. I detta protokoll har vi använt liposomer som ett fordon för läkemedelsleverans på grund av deras giftfria, biokompatibla och biologiskt nedbrytbara egenskaper. Dessutom är de icke-immunogenic, vilket är särskilt viktigt när de används för att undersöka immunologiska svar, såsom de som beskrivs här. En rad laster kan också transporteras inklusive hydrofila, hydrofoba, amfipatiska och lipofila läkemedel.
När du utför detta protokoll finns det ett antal kritiska åtgärder där särskild försiktighet måste iakttas. Dessa inkluderar steg där larver hanteras fysiskt och försiktighet måste iakttas för att minimera eventuella oavsiktliga skador på larverna. Detta inkluderar när dekorionerar larverna manuellt (särskilt undvika kontakt med äggulans känsliga epitelfoder), som arrayerar larver på injektionsplattan, deras avlägsnande från plattan efter injektioner och deras montering för levande konfokal avbildning. En oundviklig komponent i detta protokoll är behovet av att leverera liposomer (och eventuella immunutmaningar) genom mikroinjektion som kan orsaka lokal inflammation och därför kan påverka det experimentella resultatet. Mikroinjektion i larv zebrafisk kräver en viss grad av utbildning för att minimera vävnadsskador. I vårt arbete genererar en mikroinjektionnålsspetsdiameter på cirka 5 μm mycket mindre ytepitelskador (vilket framgår av mycket lågt uttryck för den inflammatoriska markörmatrisen metallopeptidas9 inom ytepitelceller i omedelbar närhet av mikroinjektionssssåret10) vid injektion i hindhjärnventrikle av 2 dpflarver. Denna diameter spets är också tillräckligt liten för att undvika läckage av injicerat innehåll, ur hindbrain ventrikeln, när mikroinjektion nålen avlägsnas. Det är viktigt att notera här att injektionsvolymer större än 2 nL ofta kommer att resultera i en del av det injicerade innehållet som svämmar över genom injektionshålet som ett resultat av att ventrikelns volym överskrids. En spetsdiameter på 5 μm är också av tillräcklig storlek för att injicera efterföljande immunutmaningar, såsom MSU-kristaller10. Beveling mikroinjektionnålspetsen till 45° med en mikroslipmaskin för att generera en skarp spets kan ge bättre penetration av den yttre peridermen och inre basala epitelskikt som täcker hindbrain ventrikeln41. Det är viktigt att notera att kontrollera injektioner som de som används här (dvs. kontrollera liposomer) är viktiga vid bedömningen av effekterna av läkemedelsladdade liposomer på makrofag funktion för att kontrollera för injektionsprocessen själv. Välja en koncentration för ett visst läkemedel när formulating till liposomer är också ett viktigt steg som etablerade effektiva läkemedelskoncentrationer, när de levereras genom nedsänkning, kan skilja sig från dem som behövs när du använder liposome-medierad läkemedelsleverans. Dessutom, när du använder detta protokoll, bör man vara noga med att inte ändra fysicokemiska egenskaper liposomer efter modifiering med poloxamer eftersom detta kan påverka deras biodistribution mönster.
Ett område för modifiering och framtida utveckling av detta protokoll kommer att vara att undersöka införliva olika ytegenskaper till liposomer såsom ligands eller receptorer för att ytterligare förbättra makrofag inriktning och upptag, eller att rikta olika immunceller, såsom neutrofiler. Denna avancerade strategi kommer att kräva ytterligare studier för att avslöja ytegenskaper som är unika för de olika zebrafiskar immun cell fack, som för närvarande är dåligt förstådda. Ytterligare områden för ändring av detta protokoll inkluderar införlivandet av andra fluorescerande sonder i liposomerna för att utöka sin mångsidighet (t.ex. när de injiceras i andra transgena reporterlinjer) och ändra deras fysiska egenskaper sådan storlek och ladda42,43. Det kommer också att vara viktigt att undersöka om olika vägar liposome administration i olika larv stadier kan utöka sin mångsidighet för att rikta ytterligare makrofag populationer, till exempel intestinala epitelceller. I protokollet som beskrivs här utfördes alla injektioner på 2 dpflarver. Under den tredje dagen av zebrafisk utveckling en enda kontinuerlig lumen från munnen till anus former, efter öppnandet av munnen44. På den fjärde dagen anus öppnar resulterar i en helt öppen rör fodrad med en polariserad epitel44. Det ska bli intressant att se om nedsänkning av äldre larver i liposomer kan underlätta inriktningen på inkapslade läkemedel till tarmepitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag som beviljats C.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) och Z.W. (Faculty Research Development Fund från University of Auckland). Författarna tackar Alhad Mahagaonkar för experthantering av zebrafish anläggningen, Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland för hjälp med confocal imaging och Graham Lieschke för gifting Tg (mpeg1: EGFP) reporter linje.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
References
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
- Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
- Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P.
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
- Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
- Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
- Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
- Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
- Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
- Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
- Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
- Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
- Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
- Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
- Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
- Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
- Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
- Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
- Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
