Ziel des Protokolls ist es, die mechanischen Eigenschaften von Riesenvesikeln durch Mikropipette-Aspiration zuverlässig zu messen.
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Methodenartikel
Verdunkelung von Riesen-Unilamellar-Hybridvesikeln durch Elektroformation und Messung ihrer mechanischen Eigenschaften durch Micropipette Aspiration
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Riesige Vesikel aus Phospholipiden und Copolymeren können in verschiedenen Anwendungen genutzt werden: kontrollierte und gezielte Wirkstoffabgabe, biomolekulare Erkennung innerhalb von Biosensoren zur Diagnose, funktionelle Membranen für künstliche Zellen und Entwicklung bioinspirierter Mikro-/Nanoreaktoren. In all diesen Anwendungen ist die Charakterisierung ihrer Membraneigenschaften von grundlegender Bedeutung. Unter den bestehenden Charakterisierungstechniken ermöglicht die von E. Evans entwickelte Mikropipette-Aspiration die Messung der mechanischen Eigenschaften der Membran wie Flächenkompressiermodul, Biegemodul und Lysespannung und Dehnung. Hier stellen wir alle Methoden und detaillierten Verfahren zur Gewinnung von Riesenbläschen aus dem Dünnschicht eines Lipids oder Copolymers (oder beidem), die Herstellung und Oberflächenbehandlung von Mikropipetten und das Aspirationsverfahren vor, das zur Messung aller zuvor genannten Parameter führt.
Einleitung
Riesenbläschen aus Phospholipiden (Liposomen) sind seit den 1970er Jahren als Basis-Zellmembranmodell1weit verbreitet. In den späten 1990er Jahren erschienen vesikuläre Morphologien, die aus der Selbstmontage von Copolymeren gewonnen wurden, polymersomen in Bezug auf ihre Lipidanaloga2,3, schnell als interessante Alternative zu Liposomen, die eine schwache mechanische Stabilität und eine schlechte modulare chemische Funktionalität besitzen. Ihr zellbiomimetischer Charakter ist jedoch im Vergleich zu Liposomen eher begrenzt, da letztere aus Phospholipiden bestehen, dem Hauptbestandteil d....
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Protokoll
1. Herstellung von Mikropipetten
HINWEIS: Hier sind Mikropipetten mit einem Innendurchmesser von 6 bis 12 m und einer Verjüngungslänge von ca. 3-4 mm erforderlich. Eine detaillierte Methode zur Herstellung von Mikropipette wird im Folgenden beschrieben.
- Legen Sie die Borosilikatglaskapillare in die Zugstange des Abziehers und fixieren Sie eine der Enden, indem Sie den Knopf anziehen.
- Schieben Sie das Glas vorsichtig durch die Löcher an der Seite der Heizkammer.
- Ziehen Sie den Klemmknopf am anderen Ende fest.
- Steuern Sie die Größe der Spitze und die Verjüngungslänge, um die gewünschten Spezifikationen ....
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Ergebnisse
Mit dem oben genannten Protokoll wir haben verschiedene synthetische Riesen-Unilamellar-Vesikel (GUV) untersucht, die aus einem Phospholipid gewonnen wurden: 2-Oleoyl-1-Palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC), ein Triblock-Copolymer: Poly(Ethylenoxid)-b-Poly(Dimethylsiloxan)-b-Poly(Ethylenoxid) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) in einer früheren Studie13und ein Diblock-Copolymer Poly(Dimethylsiloxan)-<.......
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Diskussion
Die Beschichtung der Mikropipette ist einer der wichtigsten Punkte, um zuverlässige Messungen zu erhalten. Die Haftung des Vesikels an der Mikropipette muss verhindert werden, und eine Beschichtung wird häufig in der Literatur17,18,19,20,21, mit BSA, '-Casein oder Surfasil verwendet. Details des Beschichtungsverfahrens werden selten erwähnt.
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren danken dem ANR für die finanzielle Unterstützung (ANR Sysa).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Erforderliche Ausrüstung und Materialien für die Konstruktion von Mikropipetten | |||
| Borosilikatglas Kapillaren | World Precision Instruments | 1B100-4 | Außen- und Innendurchmesser von 1 mm bzw. 0,58 mm. |
| Filament installiert | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2,5 mm * 2,5 mm Box Filament |
| Flammen / Brauner Mikropipettenabzieher | Sutter Instrument Co. | Modell P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | mit zwei Objektiven (10x und 32x) |
| Materialien für die Beschichtung von Pipettenspitzen mit BSA | |||
| Rinderserumalbuminfraktion V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Einwegspritze 1 ml Luerspitze | Codan | 62.1612 | |
| Einwegspritze 10 ml Luerspitze | Codan | 626616 | |
| Einwegspritze 5 ml Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Einweg-Acetat-Zellulosefilter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Porengröße: 0,22 & Mikro; m, Durchmesser: 25 mm |
| Flexibler Quarzglas-Kapillarschlauch | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Innendurchmesser 536µ m, Außendurchmesser 660 & Mikro; m,Glucose |
| Sigma-Aldrich | G5767 | ||
| Spritze 500 & Mikro; L luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Reagenzglas-Rotationsmischer | Labinco | 28210109 | |
| Mikromanipulation Setup | |||
| Aluminium Optische Schiene, 1000 mm Länge, M4 Gewinde, X48 Serie | Newport | ||
| Gedämpfter optischer Tisch | Newport | Wird als Stütze des Mikroskops verwendet, um äußere Vibrationen zu vermeiden. | |
| Mikromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | Die Moduleinheit (Motoreinheit für X-, Y- und Z-Bewegung) wird mit Hilfe eines Adapters auf das inverse Mikroskop montiert. |
| Mikrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Mikrometer Kopf 25,4 mm Reichweite 0,001 mm |
| Wasserreservoir aus Plexiglas (100 ml) | Selbstgebautes | ||
| inverses konfokales Mikroskop TCS SP5 (DMI6000), ausgestattet mit einem Resonanzscanner und einem Wasserimmersionsobjektiv (HCX APO L 40x/0,80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Schienenträger 80 mm Länge, mit 1/4-20, 8-32 und 4-40 Gewinde | Newport | ||
| Materialien für die Herstellung von Saccharose und amphiphilen Lösungen< | |||
| a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank"> 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamin-N-(Lissamin, Rhodamin, B, Sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamin verschlagwortet mit Lipid |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Elektroformation einrichten | |||
| 10 & micro; L Glas Kapillarringkappen | Hirschmann | 9600110 | |
| Einweg 1 ml Spritze Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Fett | Apiezon | Apiezon H Fett | Silikonfreies Fett |
| Indiumzinnoxid beschichtete Glasobjektträger | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Nadel | Terumo | AN2138R1 | 0,8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluol | VWR | 28676.297 | |
| Spannungsgenerator | Keysight | 33210A |
Referenzen
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
