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Methodenartikel

Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs in Glioblastom und deren Engineering in künstliche Cluster für die Gentherapie

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⸱

DOI:

10.3791/60215

⸱

4. Oktober 2019

 , 
1Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Charakterisierung von Modulen biologisch synergistischer miRNAs und deren Montage in kurze Transgene beschrieben, das eine gleichzeitige Überexpression für Gentherapieanwendungen ermöglicht.

Zusammenfassung

Die biologische Relevanz von microRNAs (miRNAs) in Gesundheit und Krankheit hängt signifikant von spezifischen Kombinationen vieler gleichzeitig deregulierter miRNAs ab und nicht von der Wirkung einer einzelnen miRNA. Die Charakterisierung dieser spezifischen miRNAs-Module ist ein grundlegender Schritt zur Maximierung ihrer Anwendung in der Therapie. Dies ist äußerst relevant, da ihre kombinatorischen Eigenschaften praktisch ausgenutzt werden können. Hier wird eine Methode beschrieben, um eine spezifische miRNA-Signatur zu definieren, die für die Kontrolle von onkogenen Chromatin-Repressoren bei Glioblastom relevant ist. Der Ansatz definiert zunächst eine allgemeine Gruppe von miRNAs, die bei Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe dereguliert werden. Die Analyse wird durch differenzielle Kulturbedingungen weiter verfeinert, was eine Untergruppe von miRNAs unterstreicht, die gleichzeitig während bestimmter Zellzustände mitexprimiert werden. Schließlich werden die miRNAs, die diese Filter zufriedenstellen, zu einem künstlichen polycistronischen Transgenes kombiniert, das auf einem Gerüst natürlich vorhandener miRNA-Clustergene basiert und dann zur Überexpression dieser miRNA-Module in empfangende Zellen verwendet wird.

Einleitung

miRNAs bieten eine unübertroffene Möglichkeit für die Entwicklung eines breiten Gentherapie-Ansatzes für viele Krankheiten1,2,3, einschließlich Krebs4,5. Dies basiert auf mehreren einzigartigen Merkmalen dieser biologischen Moleküle, einschließlich ihrer kleinen Größe6, einfache Biogenese7, und natürliche Tendenz, in Assoziation zu funktionieren8. Viele Krankheiten sind durch spezifische miRNA-Expressionsmuster gekennzeichnet, die oft auf die Regulierung komplexer biologischer Funktionen konvergieren9. Der Zweck dieser Methode ist zunächst eine Strategie zu definieren, um Gruppen von miRNAs zu identifizieren, die synergistisch relevant für bestimmte zelluläre Funktionen sind. Folglich bietet sie eine Strategie für die Wiederherstellung solcher miRNA-Kombinationen in nachgelagerten Studien und Anwendungen.

Diese Methode ermöglicht die funktionelle Analyse mehrerer miRNAs auf einmal, indem sie ihre gleichzeitige Ausrichtung auf eine große Anzahl von mRNAs nutzt und so die komplexen Landschaften von Krankheiten rekapituliert. Dieser Ansatz wurde vor kurzem verwendet, um eine Gruppe von drei miRNAs zu definieren, die 1) gleichzeitig bei Hirntumor enregulierung sind und 2) ein starkes Ko-Expressionsmuster während der neuronalen Differenzierung sowie als Reaktion auf genotoxischen Stress durch Strahlung oder DNA-Alkylierungsmittel. Die kombinatorische Reexpression dieses Moduls von drei miRNAs durch die unten beschriebene Clustering-Methode führt zu tiefgreifenden Eingriffen in die Biologie von Krebszellen und kann leicht als Gentherapiestrategie für präklinische Studien verwendet werden10. Dieses Protokoll kann für diejenigen von besonderem Interesse sein, die an der miRNA-Forschung und ihren translationalen Anwendungen beteiligt sind.

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Protokoll

1. Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs bei Glioblastom

  1. Analyse der breiten differentialen miRNA-Expression bei Glioblastom vs. Gehirn
    1. Bestimmen Sie zunächst die am deutlichsten deregulierten miRNAs im Tumor. Dies kann mit mindestens drei verschiedenen Methoden erreicht werden:
      1. Mine the Cancer Genome Atlas, gefunden in https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, zur Sequenzierung von Daten11.
      2. Führen Sie eine Mikroarray-Analyse von einer frischen operativen Probe12durch.
      3. Verwenden Sie zuvor veröffentlichte Datasets13.
        HINWEIS: Unabhängig davon, welche Methode gewählt wird, stellt die Ausgabe einen Massensatz von miRNAs bereit, deren Ausdruck statistisch (entweder direkt oder umgekehrt) mit der Tumorbiologie korreliert. Diese anfängliche Gruppe bildet den Pool von miRNAs, die weiter analysiert werden, um eine Teilmenge von miRNAs zu identifizieren, die die strengste funktionelle Assoziation anzeigen, indem eine dynamischere Analyse von Ausdrucksänderungen durchgeführt wird, wie unten erläutert.
  2. Bedingungsspezifische miRNA-Expressionsanalyse
    1. Induktion der Zelldifferenzierung:
      1. Verwenden Sie vorbeschichtete Poly-D-Lysin (PDL) Kunststoffschalen, um die Bildung einer Monolayer-Kultur zu begünstigen. Für die Schalenbeschichtung PDL in Wasser in einer Konzentration von 100 g/ml auflösen. Verwenden Sie 1 ml Lösung pro 25 cm2 Oberfläche. 2x mit PBS 6 h nach Anwendung der PDL-Lösung abspülen.
      2. Platte menschliche neuronale Stammzellen in gleichen Mengen (100.000 Zellen/5 ml) entweder im Stammzellmedium (neurobasales Medium + B27-Ergänzung + 20 ng/mL EGF/FGF), astrozytäres Differenzierungsmedium (DMEM + 10% FBS) oder neuronales Differenzierungsmedium (neurobasales Medium + B27 Ergänzung, + 2 M Retinsäure)14. Das Protokoll für Oligodendrozyten Differenzierung erfordert Zugabe von IGF-1 (200 ng/mL) nach EGF/FGF Entfernung14,15.
      3. Nach der Zellbeschichtung 1 Woche bei 37 °C, 5%CO2in den Inkubator geben.
    2. RNA-Extraktion:
      1. Entfernen Sie nach 7 Tagen die Zellen aus dem Inkubator und entfernen Sie das Medium.
      2. Waschen Sie die Zellen mit PBS (5 ml). Fügen Sie dann 1 ml Lysereagenz (siehe Materialtabelle) hinzu, um die Zellen zu lysieren und die Zellen mit einem Zellschaber in ein 1,5 ml Mikrofugerohr zu zerkleinern. Bewahren Sie die Rohre, die die lysierten Zellen enthalten, bei Raumtemperatur (RT) 5 min aufbewahren.
      3. Fahren Sie mit der vollständigen RNA-Isolierung gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.
    3. miRNA-Expressionsanalyse:
      1. Quantifizieren Sie die differenzielle Expression spezifischer miRNAs, die in Schritt 1.1 unter den drei Differenzierungsmustern durch Echtzeit-PCR identifiziert wurden, mit Hilfe von TaqMan-Sonden und nach den Protokollen des Herstellers für Reverse Transkription und PCR-Verstärkung ( Abbildung 1).
  3. Validierung von miRNA-Clustern durch stressspezifische Herausforderungen
    1. Kultur G34 Glioblastom Stamm-ähnliche Zellen in neurobasalen Medium + B27 Ergänzung + 20 ng/mL EGF/FGF. Beginnen Sie mit 1 x 106 Zellen in 5 ml in einem 25 cm2 niedrigen Befestigungskolben.
    2. Ab 48 h nach der Beschichtung, fügen Sie die Verdoppelung der Konzentrationen des DNA-Alkylierungsmittels Temozolomid (TMZ) alle 5 Tage wie folgt hinzu:
      1. Beginnen Sie mit 5 m für 5 Tage. Nach 5 Tagen, entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie mit frischem Medium ohne Temozolomid, damit die überlebenden Zellen sich erholen können. Nach 48 h 10 'M TMZ hinzufügen und weitere 5 Tage brüten.
      2. Wiederholen Sie Schritt 1.3.2.1, wobei die TMZ-Konzentration jedes Mal verdoppelt wird, bis eine Konzentration von mindestens 100 m erreicht ist und die Zellen gegen das Medikament10resistent werden.
    3. Bestrahlen Sie in einem parallelen Experiment G34-Zellen wie folgt:
      1. Ab 48 h nach der Beschichtung von 1 x 106 Zellen in 5 ml in einem 25 cm2 Niedrigbefestigungskolben, bestrahlen Zellen mit 2 Gy Energie (jeder Bestrahlungskörper, der Photonenemission liefert, ist akzeptabel). Geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück und stören Sie nicht. Nach 48 h die Zellen wieder mit zusätzlichen 2 Gy Energie bestrahlen.
      2. Wiederholen Sie Schritt 1.3.3.1 4x, bis insgesamt 10 Gy Energie verabreicht wird.
      3. Geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück und lassen Sie sie sich mindestens 5 Tage vor der nachgelagerten Analyse in frischem Medium erholen.
    4. Nach der Induktion der Resistenz, Lyse-Zellen mit Lyse-Reagenz und extrahieren gesamt RNA nach dem Herstellerprotokoll.
    5. Analysieren Sie die Expression der spezifischen miRNAs, die in den Abschnitten 1.1-1.2 identifiziert sind, wie in Schritt 1.2.1 (Abbildung 2) beschrieben.
  4. Charakterisierung der funktionalen Konvergenz von gruppierten miRNAs
    1. Erhalten Sie das vorhergesagte Targetome jedes miRNAs, das in den Abschnitten 1.2-1.3 definiert ist, die mit miRNA-Targeting-Vorhersagewerkzeugen erhalten wurden.
      HINWEIS: Wir greifen in der Regel auf TargetScan zurück, da sein Algorithmus regelmäßig aktualisiert wird16. Weitere Vorhersagetools sind miRanda17, miRDB18und DIANA-miRPath19. Alle diese Programme sind kostenlose, webbasierte Anwendungen.
      1. Wählen Sie auf der Titelseite von Targetscan die miRNA aus dem vorab ausgefüllten Dropdown-Menü aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden.
      2. Laden Sie die resultierende Liste der Ziele als Tabellenkalkulation mithilfe des Link Tabelle herunterladen herunter (ergänzende Abbildung 1).
      3. Um die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Vorhersagen zu verringern, beziehen Sie nur Ziele innerhalb der Spalte "Konservierte Standorte" in nachgelagerte Analysen ein. Darüber hinaus kann eine weitere Stringenz durch die Verwendung zusätzlicher miRNA-Vorhersageprogramme (siehe oben) und nur mit Zielen erreicht werden, die allen Algorithmen gemeinsam sind.
    2. Klassifizieren Sie die resultierenden Targetome nach Gene Ontology Kategorien mit ToppGene Suite20, um die Anreicherung von Pfaden zu bewerten, die jeder miRNA gemeinsam sind.
      1. Fügen Sie die Liste der Ziele, die aus Schritt 1.4.1 stammen, in das Fenster "Training gene set" ein, indem Sie das HGNC-Symbol als Eintragstyp verwenden. Klicken Sie auf Senden > Starten. Das Programm stellt eine Ausgabetabelle mit den wichtigsten "Go"-Kategorien für die eingegebene Liste der Gene bereit (Ergänzende Abbildung 2).
    3. Um schließlich den Beitrag jeder miRNA zur Regulierung eines gemeinsamen Signalwegs oder zellulären Prozesses (in diesem Fall der Chromatinregulation) zu ermitteln, überprüfen Sie jedes in Schritt 1.4.1 erhaltene Targetome anhand der vollständigen Liste der Gene, die am spezifischen zellulären Prozess beteiligt sind ( z.B. Chromatinregulation), mit der Venn-Diagrammfunktion, die auf der Website bioinformatics and Evolutionary Genomics http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn bereitgestellt wird.
      HINWEIS: Dieses Programm ermöglicht den Schnittpunkt mehrerer Gruppen gleichzeitig (Abbildung 3). Die spezifischen einzigartigen Ziele, die von jeder miRNA zur Verfügung gestellt werden, werden dann mit Anmerkungen versehen und für nachgelagerte funktionelle Experimente ausgewählt.
      1. Laden Sie auf der Startseite des Programms die Liste hoch oder kopieren/kleben Sie sie, wenn Sie die Ziel-mRNAs für jede miRNA oder das Interesse an den jeweiligen Fenstern ansprechen. Benennen Sie jede Liste mit einem eindeutigen Bezeichner.
      2. Klicken Sie auf Senden. Das Programm wird eine visuelle Ausgabe eines Venn-Diagramms mit einer Anzahl von Genen in jedem Sektor sowie eine vollständige Liste der mRNAs für jede Teilmenge und Schnittpunktkombinationen bereitstellen.

2. Montage von miRNA-Modulen in einen polycistronischen Transgenen Cluster

  1. Herstellung eines transgenen Gerüsts auf Basis von miR-17-92 Cluster-Lokus
    1. Die Nukleotidsequenz des miR-17-92-Clusters beziehen Sie sich über den Ensembl Genombrowser21. Wählen Sie die Sequenz "Kern" des Basispaares mit der Basispaarsequenz aus, die alle sechs codierten miRNA-Haarnadeln des Locus und mindestens 200-Nukleotid-Flankensequenzen sowohl vor- (5') als auch nachgeschaltet (3') der Kernsequenz umfasst.
    2. Fügen Sie die Sequenz oben in ein beliebiges Wortbearbeitungsprogramm ein.
    3. Definieren Sie die Reihenfolge jeder der sechs nativen Haarnadeln, indem Sie sie in miRBase22abrufen. Markieren Sie jede dieser Sequenzen innerhalb der zuvor identifizierten "Kernsequenz". Alle Sequenzen zwischen den einzelnen Haarnadeln stellen Abstandssequenzen dar, die für die korrekte Verarbeitung des Transgens wichtig sind.
    4. Entfernen Sie die nativen Haarnadelsequenzen aus der "Kern"-Sequenz, mit Ausnahme von 3-5 Nukleotiden an den 5' und 3' Enden jeder Haarnadel, die als Akzeptor für die neuen Haarnadeln dienen.
  2. Erstellen einer neuen Transgencodierung mehrerer miRNAs der Wahl
    1. Erhalten Sie Haarnadelsequenzen von miRNAs, die im Transgen von miRBase überexprimiert werden sollen. Beachten Sie sorgfältig die spezifischen Nukleotide, die die Standorte der Mikroprozessorspaltung sind.
    2. Ersetzen Sie die entfernten Haarnadeln (Schritt 2.1.4) durch die Haarnadelsequenzen der gewünschten miRNAs, die in Schritt 2.2.1 erhalten wurden.
    3. Fügen Sie gewünschte Restriktionssequenzen an beiden flankierenden Bereichen des Transgens hinzu, um das Subklonen in Dietionsvektoren ihrer Wahl zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Einschränkungssequenzen nicht innerhalb der Sequenz selbst vorhanden sind.
    4. Für negative Kontrollen verwenden Sie 20-Nukleotid-Scrambled-Sequenzen, um die natürliche 20-Nukleotid-Sequenz jeder reifen miRNA zu ersetzen. Generieren Sie diese verschlüsselten Sequenzen mit einem Online-Tool wie https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
  3. Überprüfung der zweidimensionalen Struktur des Transgens
    1. Kopieren Sie die vollständige transgene Sequenz in das RNA-Strukturvorhersage-Softwareprogramm RNAweb Fold23.
    2. Klicken Sie unter Verwendung der Standardprogrammeinstellungen auf Fortfahren.
    3. Analysieren Sie die grafische Ausgabe, insbesondere für das Vorhandensein von gut definierten Haarnadeln und das Vorhandensein von doppelsträngigen Stammstrukturen mindestens 11 Nukleotide proximal zur Mikroprozessorspaltungsstelle. Achten Sie auch auf das Fehlen von Verzweigungspunkten innerhalb der Haarnadelsequenzen (Abbildung 4).

3. Erhalt von Transgenen durch DNA-Synthese

  1. Nach dem Entwurf und in der Silico-Validierung des chimeric miRNA Clusters erhalten Sie die Arbeitssequenz mittels DNA-Synthese von kommerziellen Anbietern24 und gehen Sie mit nachgelagertem Klonen in Vektoren und Transgenabgabe fort. Wir haben lentivirale Vektoren für die In-vitro-Verabreichung10 und Adeno-assoziierte Viren (AAVs) für die intrakranielle In-vivo-Verabreichung25verwendet.

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Ergebnisse

Diese Methode ermöglichte die Charakterisierung eines Moduls von drei miRNAs, die bei Hirntumoren konsequent downreguliert werden, die speziell während der neuronalen Differenzierung koexprimiert werden (Abbildung 1) und an der Tumorüberlebensreaktion nach Therapie (Abbildung 2). Dies wird durch die Regulierung eines komplexen onkogenen Chromatin-Repressionswegs erreicht. Dieses Co-Expressions-Muster deutete auf eine starke syner...

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Diskussion

Dieses Protokoll basiert auf der Vorstellung, dass miRNAs, anstatt isoliert zu funktionieren, biologisch relevant sind, indem sie in Gruppen arbeiten, und diese Gruppen werden transkriptionsweise durch spezifische zelluläre Kontexte bestimmt26. Um diesen Ansatz aus einer translationalen Perspektive zu rechtfertigen, wird ein Follow-up-Protokoll eingeführt, das die Nachbildung dieses Multi-miRNA-Musters in Zellen/Geweben ermöglicht. Dies ist möglich durch die relativ einfache Biogenese von miRNAs, ...

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Offenlegungen

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Danksagungen

Die Autoren bedanken sich bei den Mitgliedern des Harvey Cushing Neuro Oncology Laboratory für die Unterstützung und konstruktive Kritik. Diese Arbeit wurde durch die NINDS-Zuschüsse K12NS80223 und K08NS101091 an P. P. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,4% niedrige Schmelztemperatur Agarose IBI ScientificIB70058
0,45 &Mikro; M SterilfiltereinheitMerck MilliporeSLH033RS
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenEppendorf22431081
6-Well-Platten Greiner Bio-One657160
Athyme Mäuse (FoxN1 nu/nu)Envigo069(nu)/070(nu/+)
B-27 Ergänzung Thermo Fisher Scientific12587010
ZellkulturflascheGreiner Bio-One660175
Zellschaber, 16cmSarstedt83.1832
Cäsium 137 Bestrahlungsgerät JL Sheperd and AssociatesCore Facility (Harvard Medical School)
ChloroformSigma-Aldrich439142-4L
DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat Thermo Fisher Scientific11995040
Dulbecco s phosphatgepufferte Kochsalzlösung Gibco14190144
Eosin Y Lösung Sigma-AldrichE4009
Fötales Rinderserum Sigma-AldrichF9665
FormalinlösungSigma-AldrichHT501128
GlutaMAX Ergänzung Thermo Fisher Scientific35050061
HEK-293American Type Culture CollectiATCC CRL-1573
Hämatoxylin-LösungSigma-Aldrich1051750500
Humane primäre Gliom-Stammzellen (GBM62)Zur Verfügung gestellt von Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Humane primäre Gliom-Stammzellen (MGG4)Zur Verfügung gestellt von Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Lentiviraler Vektor pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPSystem BiosciencesCD511B-1
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific11668019
Mikrozentrifuge gekühltEppendorfModell Nr. 5424 R, Kat.-Nr.5404000138
Eindeckmedium Thermo Fisher Scientific4112APG
Nalgene Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat mit rundem Boden Thermo Fisher Scientific 3117-0380PK
NanoDropThermo Fisher Scientific2000c
Neuronale Vorläuferzellen (NPC)Zur Verfügung gestellt von Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Neurobasales Medium Thermo Fisher Scientific21103049
Nikon eclipse Ti motorisiertes FluoreszenzmikroskopsystemNikon, Japan14314
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985088
PCR-Röhren Sigma-AldrichCLS6571-960EA
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific15140122
Petrischalen 94/16 Greiner Bio-One632180
Poly-D-Lysin Sigma-AldrichP4707
Rekombinantes humanes EGF PeproTech AF-100-15
Rekombinante humane FGF-basisch PeproTech AF-100-18B
RetinsäureGibco12587-010 
RNA Miniprep KitDirect-zolR2050
S1000 Thermocycler Bio-Rad1852196
Kleintier-Mikrobestrahlung Xstrahal Life Sciences, GroßbritannienHaupteinrichtung (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultrazentrifuge Thermo Fisher Scientific 
StemPro Accutase Thermo Fisher ScientificA1110501
StepOne Echtzeit-PCR-Systemfür angewandte Biosysteme 
SterilGARD BiosicherheitswerkbankThe Baker CompanySG403A-HE
SaccharoseSigma-AldrichS9378
T98-GAmerican Type Culture CollectiATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Reverse Transkriptionskit Thermo FisherScientific 4366596
TaqMan Universal PCR Master MixThermo Fisher Scientific4324018
TemozolomidTocris Bioscience2706
Tissue-Tek optimale Schnitttemperatur Fisher ScientificNC9636948
TRIzol-Reagenz Thermo Fisher Scientific15596026Lysereagenz
U251-MGAmerican Type Culture CollectiATCC HTB-17
U87-MG American Type Culture CollectiATCC HTB-14
ViraPower Lentivector Expressionssystem Thermo Fisher ScientificK4970-00
Wasser, HPLC-QualitätFisherW54
Xylol Sigma-Aldrich534056
750001004376357

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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