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Methodenartikel

Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands

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DOI:

10.3791/60218

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5. September 2019

 ,  , 
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Trennung und Sortierung einer bestimmten Zellpopulation von den Drosophila männlichen Zubehördrüsen (Sekundärzellen) für RNA-Sequenzierung und RT-qPCR vor. Die Zellisolation erfolgt durch FACS-Reinigung von GFP-exezierenden Sekundärzellen nach einem mehrstufigen Dissoziationsprozess, der Dissektion, Proteasenverdauung und mechanische Dispersion erfordert.

Zusammenfassung

Um die Funktion eines Organs zu verstehen, ist es oft nützlich, die Rolle seiner konstituierenden Zellpopulationen zu verstehen. Leider macht es die Seltenheit einzelner Zellpopulationen oft schwierig, genügend Material für molekulare Studien zu erhalten. Zum Beispiel enthält die Zubehördrüse des männlichen Fortpflanzungssystems Drosophila zwei verschiedene sekretore Zelltypen. Die Hauptzellen machen 96% der Sekretoniezellen der Drüse aus, während die Sekundärzellen (SC) die restlichen 4% der Zellen ausmachen (etwa 80 Zellen pro Männchen). Obwohl beide Zelltypen wichtige Bestandteile der Samenflüssigkeit produzieren, sind nur wenige Gene bekannt, die spezifisch für die SCs sind. Die Seltenheit von SCs hat bisher die transkriptomische Analyse dieses wichtigen Zelltyps behindert. Hier wird eine Methode vorgestellt, die die Reinigung von SCs zur RNA-Extraktion und -Sequenzierung ermöglicht. Das Protokoll besteht darin, zunächst Drüsen von Fliegen zu sezieren, die einen SC-spezifischen GFP-Reporter exezieren, und diese Drüsen dann der Proteaseverdauung und mechanischen Dissoziation zu unterziehen, um einzelne Zellen zu erhalten. Nach diesen Schritten werden einzelne, lebende, GFP-markierte Zellen mit einem fluoreszierenden aktivierten Zellsortierer (FACS) zur RNA-Reinigung sortiert. Dieses Verfahren ergibt SC-spezifische RNAs von 40 Mal pro Zustand für nachgeschaltete RT-qPCR und/oder RNA-Sequenzierung im Laufe eines Tages. Die Schnelligkeit und Einfachheit des Verfahrens ermöglicht es, die Transkriptome vieler verschiedener Fliegen, aus verschiedenen Genotypen oder Umgebungsbedingungen, in kurzer Zeit zu bestimmen.

Einleitung

Organe bestehen aus mehreren Zelltypen, die jeweils diskrete Funktionen haben und manchmal sehr unterschiedliche Gensätze ausdrücken. Um ein genaues Verständnis der Funktionsweise eines Organs zu erhalten, ist es oft wichtig, jeden einzelnen Zelltyp zu untersuchen, aus dem dieses Organ besteht. Eine der primären Methoden, die verwendet wird, um mögliche Funktionen zu untersuchen, ist die Transkriptomanalyse. Diese leistungsstarke Methode liefert eine Momentaufnahme der Genexpression in einer Zelle, um aktive Prozesse und Pfade aufzudecken. Diese Art der Analyse ist jedoch oft schwierig für seltene Zellpopulationen, die von weit reichlich erwachsener benachbarten Zellen gereinigt werden müssen. Zum Beispiel ist die Drosophila männliche Zubehördrüse ein Organ, das hauptsächlich aus zwei sekretochen Zelltypen besteht. Da der seltenere der beiden Zelltypen nur 4 % der Zellen dieser Drüse umfasst, wurde die Verwendung einer zelltypspezifischen Transkriptomanalyse nicht verwendet, um die Funktion dieser Zellen zu bestimmen.

Zubehördrüsen (AGs) sind Organe des männlichen Fortpflanzungstraktes bei Insekten. Sie sind verantwortlich für die Produktion der meisten Proteine der Samenflüssigkeit (Seminal fluid proteins (SFPs) und Accessory Drüsenproteine (ACPs)). Einige dieser SFPs sind dafür bekannt, die physiologischen und Verhaltensreaktionen bei gepaarten Weibchen zu induzieren, die gemeinhin als Post-Mating-Antwort (PMR) bezeichnet werden. Einige der PMRs sind: eine erhöhte Eisprung- und Eiablagerate, die Lagerung und Freisetzung von Spermien, eine Änderung der weiblichen Ernährung und eine Abnahme der weiblichen Empfänglichkeit gegenüber sekundären höflichen Männern1,2. Da Insekten viele wichtige gesellschaftliche Probleme beeinflussen, von der menschlichen Gesundheit (als Vektoren für tödliche Krankheiten) bis hin zur Landwirtschaft (Insekten können Schädlinge sein, aber für bestäubungsmittel und bodenqualität entscheidend sind), ist das Verständnis der Insektenvermehrung ein wichtiger Forschungsbereich. Die Untersuchung von AGs und ACPs wurde mit dem Modellorganismus Drosophila melanogaster signifikant weiterentwickelt. Diese Studien haben die Rolle von AGs und einigen der einzelnen Proteine, die sie bei der Schaffung der PMR produzieren, hervorgehoben, was die Arbeit bei anderen Arten wie dem Krankheitsvektor Aedes aegypti3,4und anderen Insekten beeinflusst1 ,5. Darüber hinaus werden aGs, wie AGs die Bestandteile der Samenflüssigkeit1,6 absondern, oft als funktionelles Analogon der Säugetierprostata und der Samenbläschen betrachtet. Diese Funktionsähnlichkeit kombiniert mit molekularen Ähnlichkeiten zwischen den beiden Gewebetypen haben die AGs zu einem Modell für die Prostata in Fliegen7gemacht.

Innerhalb der Drosophila Männchen, gibt es zwei Lappen von Zubehör Drüsen. Jeder Lappen kann als eine sackartige Struktur gesehen werden, die aus einer Monoschicht von Sekretorienzellen besteht, die ein zentrales Lumen umgeben, und von glatten Muskeln umwickelt wird. Wie oben erwähnt, gibt es zwei morphologisch, entwicklungs- und funktionell unterschiedliche sekretorische Zelltypen, aus denen diese Drüse besteht: die polygonalen Hauptzellen (die 96 % der Zellen ausmachen) und die größeren, runden Sekundärzellen (SC) (die die verbleibenden 4% der Zellen oder etwa 40 Zellen pro Lappen). Es wurde gezeigt, dass beide Zelltypen unterschiedliche Sätze von ACPs produzieren, um die PMR zu induzieren und aufrechtzuerhalten. Die meisten der bisher gewonnenen Daten unterstreichen die Rolle eines einzelnen Proteins bei der Auslösung der meisten charakteristischen Verhaltensweisen der PMR. Dieses Protein, das Sexpeptid, ist ein kleines, 36 Aminosäurepeptid, das von den Hauptzellen8,9,10abgesondert wird. Obwohl das Sexpeptid eine wichtige Rolle in der PMR zu spielen scheint, haben andere ACPs, die sowohl von der Haupt- als auch der Sekundärzelle produziert werden, auch verschiedene Aspekte der PMR11,12,13,14 beeinflusst ,15,16,17. Zum Beispiel scheinen die SCs, basierend auf unserem aktuellen Wissen, über die Proteine, die sie produzieren, für die Fortdauer der SP-Signalisierung nach dem ersten Tag18erforderlich zu sein.

Angesichts der Seltenheit der SCs (nur 80 Zellen pro Männchen) stammt unser gesamtes Wissen über diese Zellen und die Proteine, die sie produzieren, aus Genetik und Kandidatenansätzen. Bisher hat sich gezeigt, dass nur eine relativ kleine Liste von Genen SC-spezifisch ist. Diese Liste enthält das Homeodomain-Protein Defective proventriculus (Dve)19, die lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 und 1921, CG1656 und CG1757511, 15,21 und der Homeobox-Transkriptionsfaktor Abdominal-B (Abd-B)18. Zuvor haben wir gezeigt, dass ein mutierter Mangel sowohl für die Expression von Abd-B als auch für die lncRNA MSA in Sekundärzellen(iab-6cocuD1 Mutant) die Länge der PMR von 10 Tagen auf nur einen Tag12 verkürzt. , 18 , 20. Dieser Phänotyp scheint durch die unsachgemäße Lagerung von SP im weiblichen Fortpflanzungstrakt12,18,20verursacht zu werden. Auf zellulärer Ebene zeigen die Sekundärzellen dieser Mutante eine abnormale Morphologie und verlieren ihre charakteristischen vacuolähnlichen Strukturen18,20,21. Mit dieser mutierten Linie haben wir zuvor versucht, Gene zu identifizieren, die an der SC-Funktion beteiligt sind, indem wir die Transkriptionsprofile ganzer AGs entweder von Wildtyp- oder mutierten Zubehördrüsen12verglichen haben. Auch andere Labore zeigten, dass SC-Zahl, Morphologie und Vakuolargehalt von der männlichen Ernährung, dem Paarungsstatus und dem Altervon 21,25,26Abs. 1 abhängen.

Obwohl mit diesen Ansätzen positive Fortschritte erzielt wurden, war ein vollständiges SC-Transkriptom bei weitem nicht erreicht. Die Seltenheit dieser Zellen in diesem Organ machte es schwierig, auch von wilden Typzellen weiterzukommen. Für die Erprobung der Genexpression wären Veränderungen in diesen Zellen nach bestimmten Umweltreizen noch schwieriger. Daher war eine Methode zur Isolierung und Reinigung von SC-RNA erforderlich, die schnell und einfach genug war, um unter verschiedenen genetischen Hintergründen und Umweltbedingungen durchzuführen.

Sowohl die Abd-B- als auch die MSA-Gene benötigen einen spezifischen 1,1 kb Enhancer aus dem Drosophila Bithorax Complex (genannt D1 Enhancer) für ihre Expression in SCs18,20. Dieser Enhancer wurde zuvor verwendet, um einen GAL4-Treiber zu erstellen, der, wenn er mit einem UAS-GFPverknüpft ist, in der Lage ist, eine starke GFP-Expression speziell in SCs zu erzeugen. Daher haben wir diese Zeile als Grundlage für ein FACS-Protokoll verwendet, um diese Zellen sowohl von Wildtyp als auch von iab-6cocuD1 AGs zu isolieren). Da iab-6cocuD1 mutierte SCs eine andere zelluläre Morphologie aufweisen, zeigen wir, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um Zellen zur Bestimmung ihres Transkriptoms von diesem seltenen Zelltyp unter sehr unterschiedlichen Bedingungen zu isolieren.

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Protokoll

1. Drosophila Linien verwendet und Sammlung von Männern

  1. Verwenden Sie für dieses Protokoll Männchen, die GFP in den SCs und nicht in den Hauptzellen exemiten. Hierbei wird ein AbdB-GAL4-Treiber (beschrieben in Referenz18), rekombiniert mit UAS-GFP (auf Chromosom 2) verwendet. Andere geeignete Treiber können ebenfalls verwendet werden. Zur Isolierung von SCs unter verschiedenen mutierten Bedingungen, kreuzen Sie die Mutation in Linien, die die SC-spezifische GFP-Linie enthalten.
  2. Sammeln Sie zwei Chargen von etwa 25 gesunden, jungfräulichen Männchen für jeden Genotyp und altern sie bei 25 °C für 3-4 Tage in Fläschchen mit frisch zubereiteten Drosophila-Lebensmitteln.
    HINWEIS: Da Alter, Paarungsstatus, Ernährung und soziales Umfeld jeweils die Reproduktionsbiologie beeinflussen, müssen strenge Protokolle befolgt werden, um diese Parameter zu kontrollieren. Jungfrau Männchen sind für 3-4 Tage nach Pupal-Eclosion bei 25 °C mit einem 12 h/12 h Licht/Dunkel-Zyklus, auf Standard-Mais-Agar-Hefe-Nahrung, in Gruppen von 20-25 Männchen pro Durchstechflasche gereift.

2. Lösungen und Materialvorbereitung

  1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor.
    1. Serum Supplemented Medium (SSM): Schneiders Drosophila Medium ergänzt durch 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin.
    2. Aliquots des 1x Trypsin-Enzyms (z. B. TrypLE Express-Enzym) vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern.
    3. Bereiten Sie Aliquots von Papain [50 U/ml] vor (bei -20 °C gespeichert und nur einmal aufgetaut).
    4. 1x Phosphatpuffer-Saline (PBS, bei Raumtemperatur gelagert) vorbereiten.
  2. Bereiten Sie mehrere flammenabgerundete Pipettenspitzen für die physikalische Dissoziation von Zubehördrüsen vor.
    HINWEIS:     Verwenden Sie niedrige Retentionsspitzen für den Umgang mit Zubehördrüsen, da sie dazu neigen, an unbehandeltem Kunststoff zu haften. Der Prozess der Flammenrundung reduziert die Spitzenöffnung und glättet die Ränder der Spitze. Dies gewährleistet eine effiziente Dissoziation nach der Peptidase-Verdauung, ohne die Zellmembranen zu scheren.
    1. Schneiden Sie eine 200-L-Spitze mit einer scharfen Klinge und geben Sie sie vorsichtig über eine Flamme, um ihre Spitze abzurunden, so dass die Öffnung breiter, aber glatt für die Handhabung während Schritt 3.7 ist.
    2. Verengen Sie die Öffnung mehrerer 1.000 L-Spitzen, indem Sie die Spitzenöffnung in der Nähe einer Flamme für weniger als eine Sekunde passieren. Drehen Sie die Spitze leicht, um Überschmelzen oder Verstopfen zu vermeiden. Sortieren Sie die Tipps von schmaler nach breiter. Dies kann durch Timing der Geschwindigkeit der Aspiration getan werden. Versuchen Sie, eine kleine Maßstabsprobe von AGs zu trennen, um die Effizienz der engsten Spitzen zu testen.
      HINWEIS: Diese Spitzen sind entscheidend für die mechanische Rührung (Schritte 5.2 und 5.3). Hochwertige flammenabgerundete Pipettenspitzen ermöglichen eine vollständige Dissoziation bei gleichzeitiger Erhaltung der Zelllebensfähigkeit. Als solche werden diese Spitzen am Ende des Wiederverwendungsverfahrens gründlich mit Wasser gewaschen. Dies ermöglicht eine tägliche reproduzierbare Dissoziation.

3. Dissektion der Accessory Drüsen

  1. 20 bis 25 männliche Drosophila in eine Glasschale auf Eis legen.
  2. Sezieren Sie 1 Männchen in SSM. Nehmen Sie seinen Fortpflanzungstrakt ab und löschen Sie das Zubehör Drüsenpaar von allen anderen Geweben außer dem Ejakulationskanal.
    HINWEIS: Entfernen Sie Hoden, weil die freigesetzten Spermien Klumpen erzeugen und den Dissoziationsprozess stören können. Entfernen Sie die Ejakulationslampe, die die Handhabung schwierig macht, wenn sie schwimmt.
  3. Mit Zangen Zubehördrüsen auf eine mit SSM gefüllte Glasplatte bei Raumtemperatur übertragen. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.3 20 mal, um eine Charge von 20 Drüsenpaaren in SSM zu erhalten.
    HINWEIS: Diese Schritte werden in 15 bis 20 min erreicht. AGs sollten gesund aussehen, und die peristaltischen Bewegungen der Muskelschicht um Drüsen sollten sichtbar sein. GFP kann mit einem Fluoreszenzmikroskop überwacht werden.
  4. Zubehördrüsen auf 1x PBS für eine 1-2 min Waschen bei Raumtemperatur übertragen.
    HINWEIS: Für eine bessere Dissoziation ist es unerlässlich, die Drüsen mit PBS zu spülen. Die Dauer dieses Schritts sollte jedoch begrenzt sein, da die Zellen Anzeichen von Stress in PBS aufweisen; dissoziierte Sekundärzellen in PBS schwellen schnell an und sterben ab.
  5. Verdünnen Sie 20 l Papain [50 U/ml] in 180 l 1x Trypsin-Enzym, um die Dissoziationslösung zu erhalten (um die Dissoziationslösung zu skalieren oder zu halten, halten Sie 9 l Trypsin-Enzym und 1 l Papain für jedes Männchen). Mit Zangen, übertragen Zubehördrüsen auf diese Lösung.
  6. Isolieren Sie die Spitze der Zubehördrüsen (die Sekundärzellen enthalten) vom proximalen Teil. Verwenden Sie feine Zange fest in der Mitte eines Drüsenlappens kneifen und schneiden Sie mit der scharfen Spitze einer zweiten Zange. Entfernen Sie den proximalen Teil der Zubehördrüsen und den Ejakulationskanal, um die Dissoziation zu verbessern und die Zellsortierzeit zu reduzieren.
    HINWEIS: Die Zerlegung des distalen Teils von 20 Drüsenpaaren dauert 15 bis 20 min und die Verdauung durch Peptidasen beginnt somit bei Raumtemperatur.
  7. Nachdem alle Drüsenspitzen seziert wurden, übertragen Sie sie in ein 1,5 ml-Rohr mit einer speziellen 200-L-Pipettenspitze, die in Schritt 2.2.1 vorbereitet wurde. Es sollte breit, abgerundet und nass sein, bevor man Drüsen behandelt.
    HINWEIS: Für Pipetten-Zubehör-Drüsengewebe sollten Spitzen immer mit geeigneter Lösung vornass sein (Trypsin-Enzym oder SSM, halten Sie jeweils eine Röhre für diesen Zweck). Spülen Sie die Spitzen zwischen den Proben vorsichtig aus, um eine Kontamination zu vermeiden.

4. Gewebeverdauung

  1. Das Mikrorohr 60 min in einen 37 °C-Shaker geben und bei 1.000 U/min schaukeln.
    HINWEIS: Sowohl Agitation als auch Verdauungszeit sind entscheidend für eine erfolgreiche Dissoziation. Kürzere oder regungslose Verdauung wird schlechte Dissoziation geben, wahrscheinlich, weil die äußere Muskelschicht und innere viskose Samenflüssigkeit Zubehör Drüsenzellen vor Peptidasen schützen.
  2. Fügen Sie 1 ml SSM bei Raumtemperatur hinzu, um die Verdauung zu stoppen und fahren Sie sofort mit Schritt 5 fort.

5. Mechanische Dissoziation der Zellen

  1. Übertragen Sie die Probe mit einer weit gerundeten 1.000-L-Spitze, vornass mit SSM, auf eine 24-Well-Platte. GfP-Fluoreszenz unter dem Mikroskop überwachen: Die meisten Drüsenspitzen sollten intakt aussehen und ein paar SC ablösen.
  2. Mit einer abgerundeten schmalen Pipettenspitze, die bei Schritt 2.2.2 erzeugt wird, wird 3 bis 5 Mal die Pipetten nach oben und unten verwendet, um das Zubehördrüsengewebe zu stören.
    HINWEIS: Überwachen Sie die Fluoreszenz, um sicherzustellen, dass große Gewebeflecken aufgebrochen wurden. Wiederholen Sie Schritt 5.2, wenn dies nicht der Fall ist.
  3. Mit einer sehr schmalen abgerundeten Pipettenspitze (erzeugt bei Schritt 2.2.2), Pipet 1-2 mal.
    HINWEIS: Nach Schritt 5.3 sollten nur einzelne Zellen sichtbar sein. Die Verwendung von 24-Well-Platten wird empfohlen, da sie eine einfache Überwachung des Prozesses ermöglichen. Wenn einige Proben verarbeitet wurden und zufriedenstellende Ergebnisse lieferten (gesund aussehende Sekundärzellen perfekt dissoziiert), werden die Pipettierschritte im Mikrorohr durchgeführt.
  4. Warten Sie mindestens 15 min, damit sich die Zellen am boden des Brunnens absetzen und entfernen Sie das überschüssige SSM, um die Sortierzeit zu reduzieren.
    HINWEIS: Die Ansiedlung von Zellen erwies sich als überlegen gegenüber alternativen Methoden wie der Zentrifugation und ermöglicht eine letzte visuelle Inspektion der Zellen kurz vor FACS.
  5. Pipetten Sie die Zellen in ein sauberes 1,5 ml Rohr und Pool identische Proben (zwei Chargen von 20 Männchen für jede Bedingung). Spülen Sie Brunnen mit SSM, um die letzten Zellen wiederherzustellen, und pipen Sie sie in das Rohr (verwenden Sie ein kleines Volumen).
  6. In 1,5 ml Mikroröhren 300 l Zelllyselösung und 1 L Proteinase K [50 g/l] (Lösungen im RNA-Reinigungskit, siehe Schritt 7) hinzufügen. Bereiten Sie zwei Rohre für jede Probe vor (eine für MCs und eine für SCs).

6. FACS (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung)

  1. Fügen Sie jeder Probe, die einige Minuten vor dem Sortieren sortiert werden soll, einen Machbarkeitsmarker hinzu (0,3 mM Draq7).
    ACHTUNG: Draq7 sollte mit Vorsicht behandelt werden.
  2. Sortieren Sie eine homogene Population lebender Sekundärzellen (GFP-positive, Draq7-negative Zellen). In einem anderen Mikrorohr sortieren Sie eine Population von Hauptzellen (kleinere, GFP-negative, Draq7-negative Zellen). Verwenden Sie die folgende FACS-Gating-Strategie:
    HINWEIS:     Stellen Sie den Zellsortierdruck auf 25 PSI ein und leiten Sie Zellen durch eine 100-m-Düse. Die Sortierrate beträgt etwa 2.000 Zellen/s.
    1. Beseitigen Sie Schutt und wählen Sie Gesamtzellen auf der Grundlage von FSC-SSC (Abbildung 2E), um Schmutz auszuschließen.
    2. Schließen Sie abgestorbene Zellen aus. Erregen Sie Draq7 mit einem 640 nm Laser und sammeln Sie emittierte Fluoreszenz mit einem 795/70 Band-Pass-Filter. Gate Draq7-positive Zellen heraus (Abbildung 2F).
    3. Entfernen Sie Doublets mit einem doppel-gating auf SSC-H gegen SSC-W und FSC-A vs FSC-H (Abbildung 2H).
      HINWEIS: Schließen Sie Zelldoppelungen streng mit Doppel-Gating aus, um die Hauptzellkontamination zu reduzieren.
    4. Sortieren Sie 550 GFP-positive Zellen in ein 1,5 ml Mikrotube mit Lysispuffer und Proteinase K. Diese Grundgesamtheit wird als Sekundärzellen betrachtet (SC, Abbildung 2G). GFP bei 488 nm exzitieren und emittierte Fluoreszenz mit einem 526/52 Bandpassfilter sammeln.
    5. Sortieren Sie 1.000 GFP-negative Zellen, homogen und klein, in ein 1,5 ml Mikrorohr mit Lysispuffer und Proteinase K. Diese Population wird als Hauptzellen betrachtet (MC, Abbildung 2G).
    6. Wirbel alle Proben.
      HINWEIS: Von 40 Männchen (40 x 80 SC = 3.200 Sekundärzellen) werden 600 bis 800 lebende Singlet-Sekundärzellen erhalten (ca. 20-25% Abruf). Beenden Sie die Sortierung von 550 SC und 1.000 MC, um Proben zu normalisieren.

7. RNA-Extraktion

HINWEIS: Wir verwendeten Epicentre MasterPure RNA Purification Kit für die RNA-Extraktion, mit den folgenden Anpassungen. Andere Kits können verwendet werden, solange die Ausbeute hoch genug ist, um eine Bibliothek für die Sequenzierung aus 500 Zellen vorzubereiten (2 ng RNAs wurde hier verwendet).

  1. Wärmeproben bei 65 °C für 15 min und Wirbel alle 5 min, um die Zelllyse abzuschließen.
  2. Legen Sie Proben für 5 min auf Eis. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers für Nukleinsäurefällungen (Teile "Fällung der gesamten Nukleinsäuren" und "Entfernung von kontaminierender DNA aus Nukleinsäurepräparaten").
  3. Suspend-RNA-Pellet in 10 l RNase-freiem TE-Puffer.
  4. RNase-Inhibitor hinzufügen (optional).
  5. Proben bei -80 °C lagern.

8. Qualitätskontrolle von RNA-Menge, Qualität und Spezifität

  1. Schätzen Sie die Qualität und Konzentration der RNA. Aufgrund des geringen Volumens und der Konzentration verwenden Sie hier RNA 6000 Pico Chips. RNA von guter Qualität ist definiert als nicht degradiert, sichtbar als niedrige Ausgangsbasis mit scharfen Spitzen, die rRNAs entsprechen.
  2. RT-qPCR zur Steuerung der Identität sortierter Zellen
    1. Führen Sie die umgekehrte Transkription mit 2 ng der gesamten RNAs mit zufälligen Hexamern als Primer durch. Führen Sie RT auf sekundärzelliger RNA und Hauptzell-RNA durch.
      HINWEIS: cDNAs können verdünnt, aliquoted und für die spätere Verwendung eingefroren werden.
    2. Führen Sie quantitative PCR in Echtzeit mit geeigneten Primerpaaren durch, um Haushaltsgene (Alpha-Tubulin, 18S rRNA), sekundäre zellspezifische Gene (MSA, Rab19, Abd-B) und das hauptzellspezifische Gen (Sexpeptid) zu quantifizieren.

9. Sequenzierung (cDNA-Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und Datenanalyse)

  1. Verwenden Sie 2 ng der gesamten RNAs, um cDNAs mit PolydT-Primern zu synthetisieren. Verwenden Sie die SMARTer-Technologie, um sie für die Verstärkung zu verstärken.
  2. Verwenden Sie ein Nextera XT-Kit, um die Bibliothek vorzubereiten.
  3. Sequenz mit Multiplex, 100 Nukleotide einzelne liest Sequenzierung (obwohl 50 Nukleotide Liest sind für die meisten Zwecke geeignet), um rund 30 Millionen Lesevorgänge für jede Probe zu liefern.

10. Datenanalyse

  1. Führen Sie FastQC aus.
  2. Verwenden Sie den STAR-Aligner, um die Lesevorgänge auf dem UCSC dm6 Drosophila Referenzgenom zuzuordnen und Bam-Dateien zu generieren. Verwenden Sie Integrative Genomics Viewer (IGV), um Lesevorgänge im Genombrowser zu visualisieren.
  3. Verwenden Sie HTSeq, um Genzählungen durchzuführen.
  4. Verwenden Sie die Methode Trimmed Mean of M-values (TMM), um die Genanzahl22zu normalisieren. Verwenden Sie edgeR, um statistische Analysen von Differentialausdruck, MA-Plots und PCA durchzuführen.
  5. Für Die Analyse und Statistik von Genexpressionverwenden verwenden Sie General Linear Model, Quasi-Likelihood F-Test mit False Detection Rate (FDR) und Benjamini & Hochberg Correction (BH).

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Ergebnisse

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht es einem Experimentator, Sekundärzellen aus Drosophila männlichen Zubehördrüsen zu isolieren und ihre RNA im Laufe eines tages zu extrahieren (Abbildung 1).

Wir verwenden das Abd-B-GAL4-Konstrukt 18, um sekundäre Zellen (SC) zu kennzeichnen, aber nicht Hauptzellen (MC) mit GFP (Abbildung 2

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Diskussion

Methoden zur Zelldissoziation aus Drosophila-Gewebe wie imaginäre Scheiben sind bereits beschrieben23. Unsere Versuche, diese Verfahren einfach auf Zubehördrüsen anzuwenden, sind gescheitert und haben uns ermutigt, dieses neue Protokoll zu entwickeln. Protease-Verdauung und mechanische Trituration waren kritische Schritte, die wir für den Erfolg des Verfahrens in Schwierigkeiten gebracht haben, und so haben wir viele Hinweise in die Abschnitte 2 bis 5 platziert, um Experimentatoren zu hel...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Offenlegung.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern des Karch-Labors, der iGE3 Genomik-Plattenform, der Flow Cytometry Kernanlage der Universität Genf und Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye, der das Protokoll für FACS festgelegt hat. Wir danken Luca Stickley für seine Hilfe bei der Visualisierung der Lesungen auf IGV. Wir danken uns für die sanfte Erlaubnis, Figuren wiederzuverwenden, und die Redakteure dafür, dass sie uns dazu aufgefordert haben, kreativ mit dem Schreiben umzustehen.

Diese Forschung wurde vom Land Genf (CI, RKM, FK), dem Schweizerischen Nationalfonds für Forschung (www.snf.ch) (FK und RKM) und Spenden der Claraz-Stiftung (FK) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
24-Wells GewebekulturplatteVWR734-2325
Binokulares Mikroskop zum Sezieren
Binokular mit Lichtquelle für GFP
Bunsen
Draq7 0,3 mMBioStatusDR71000
Kunststoff-Mikroröhrchen 1,5 mLEppendorf
FACSBeckman CoulterMoFlo Astrios
Feine Dissektionszange
Fötales RinderserumGibco10270-106vor Gebrauch hitzeinaktiviert
Glasschalen zum Sezieren
Eiskübel
ImProm-II Reverse TranskriptionssystemPromegaA3800
MasterPure RNA-AufreinigungskitEpizentrumMCR85102
Nextera XT Kitilluminahttps://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000Gilson
P20Gilson
P200Gilson
Papain50U/mL Lager
PBShausgemachtes
Penicillin-StreptomycinGibco15070-063
PolydT Primer
Zufällige Hexamer Primer
RNA 6000 Pico KitAgilent
Schneider" s Drosophila MediumGibco21720-001
SMARTer cDNA-SynthesekitTakarahttps://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Mastermix für CFXangewendet biosystems4472942
ThermoschüttlerHangzhou Allsheng InstrumenteMS-100
Tipone 1250 μ L graduierte SpitzeStarlabS1161-1820
Tipone 200 μ L abgeschrägte SpitzeStarlabS1161-1800
TrypLE Express EnzymGibco12604013
Vortex

Referenzen

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Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands
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