Ein Kryo-Pulverisierungsprotokoll zur Verarbeitung von Mauspfoten zur Bewertung molekularer Wege von Gewebeentzündungen in einem Kollagen-induzierten Arthritis-Modell

Summary

Eine kryogene Pulverisierungsmethode zur Verarbeitung von murinen Pfoten mit einer flüssigen Stickstoff-Gefriermühle wurde entwickelt, um die Ausbeute und Qualität der aus den Geweben extrahierten RNA oder Proteine zu verbessern und die Analyse molekularer Profile im Zusammenhang mit entzündlichen Antworten.

Abstract

Die Profilierung molekularer Veränderungen in lokalen Geweben ist entscheidend, um den Wirkmechanismus(en) der therapeutischen Kandidaten in vivo zu verstehen. Im Bereich der Arthritisforschung konzentrieren sich viele Studien auf entzündete Gelenke, die aus einer komplexen Mischung aus Knochen, Knorpel, Muskel, Stromalzellen und Immunzellen bestehen. Hier haben wir eine zuverlässige und robuste mechanische Methode etabliert, um entzündete Mauspfoten in homogenpulverisierte Proben in einer kryogen kontrollierten Umgebung zu stören. Protein- und RNA-Lysate wurden verarbeitet, um proteomische und transkriptionelle Endpunkte und die molekulare Charakterisierung relevanter Krankheitswege im lokalen Gewebe zu ermöglichen.

Introduction

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch systemische entzündliche Erkrankung mit anhaltender symmetrischer Synovitis in den Gelenken und extra artikulärer Beteiligung von Organen wie Haut, Herz, Lunge und Augen¹. Obwohl die systemischen Manifestationen der Immunantwort bei menschlichen Patienten offensichtlich sind, ist eines der Kennzeichen der RA-Pathologie die Infiltration von Immunzellen im Synovialgewebe und die Proliferation von synovialen Fibroblastenzellen².

Ähnlich wie beim menschlichen RA löst das Modell der Mauskollagen-induzierten Arthritis (CIA) starke Gewebeentzündungen mit aktiven Immunantworten in Synovialgeweben und systemischen Fächern aus. Die Anfälligkeit verschiedener Mausstämme für CIA-Modellverbindungen mit DemInthek-Komplex (MHC) und antigenspezifischen T-Zell- und B-Zell-Wechselwirkungen^3,4. Darüber hinaus sind viele pathogene Wege in der menschlichen RA, einschließlich der Autoantikörperproduktion, immunkomplexer Ablagerung, myeloische Zellaktivierung, polyartikulärer Manifestationen und Pannusbildung mit synovialer Immuninfiltration, in diesem Modell ebenfalls zu sehen. ^5,6. Die Ermittler haben dieses etablierte CIA-Modell verwendet, um die Auswirkungen entzündungshemmender Zytokinbehandlungen zu untersuchen⁷. Viele Biologika, die für Autoimmun- oder entzündliche Erkrankungen zugelassen sind, wie Z.B. Anti-TNF und Anti-IL-6, werden im CIA-Modell^8,9als wirksam befunden.

Die Profilierung der Wechselwirkungen des Immunsystems im Synovialgewebe ist entscheidend, um molekulare Mechanismen im Zusammenhang mit der Pathogenese von RA aufzuklären. Im klinischen Umfeld des Menschen ist es gängige Praxis, Nadelsynovialbiopsien unter Anleitung der Ultraschall-Bildgebung durchzuführen. In den präklinischen Umgebungen erschwert die kleinere Architektur der murinen Gelenke die Biopsieverfahren viel schwieriger, wenn nicht gar unmöglich. Kürzlich haben wir die Verwendung des murinen CIA-Modells demonstriert, um Kombinationen von Medikamenten zu bewerten, um unterschiedliche Endpunkte zu beeinflussen und Krankheiten in einem kombinatorischen Ansatz zu lösen¹⁰. Eine kryogene Gefrierwalzen-Pulverisierungsmethode wurde eingesetzt, um entzündete murine Pfoten zu homogenen Feinenpulvern zu verarbeiten und nachgelagerte Prozesse zur Extraktion von RNA und Proteinen zu etablieren. Diese Methode schützt RNA und Protein vor enzymatischen und chemischen Degrativen Prozessen und ermöglicht es uns, mehrere Analysemethoden auf eine einzige homogenisierte Probenquelle anzuwenden.

Protocol

Alle Tierversuche wurden im Einklang mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Janssen R&D durchgeführt.

1. Kryogene Gefrierwerk Mühlen-basierte Pulverisierungsmethode

1. Nach Beendigung der CIA-Studie opfern Mäuse mit 1,5% Isofluran, gefolgt von zervikaler Dislokation.
2. Am Tag der Gewebeverarbeitung alle Instrumente (Spatzer, Schleiffläschchen usw.) auf Trockeneis für mindestens 10 min vorkühlen. Thermische Handschuhe tragen, um Frostschäden zu vermeiden.
3. Hinterpfoten mit einer Schere an der Felllinie schneiden, wie in Abbildung 1Adargestellt.
4. Jede Pfote in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr geben, sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und gefrorene Pfoten bei -80 °C lagern. Halten Sie Proben nicht mehr als eine Woche eingefroren.
5. Gefriermühle mit flüssigem Stickstoff füllen, wie in Abbildung 1B dargestellt, und lassen Sie es für mindestens 10 min ausdemieren.
6. Unverarbeitete Probe auf Trockeneis aufbewahren und Gefrier-Tau-Zyklen vermeiden.
7. Eine Hinterpfote in vorgekühlte große Polycarbonat-Schleifflasche mit einem unteren Stahlstecker übertragen, den vorgekühlten Stahlstoßer einsetzen und die Polycarbonat-Schleifflasche mit dem vorgekühlten Stahlstopfen schließen (Abbildung 1C).
8. Übertragen Sie große Polycarbonat-Schleiffläschchen mit den Proben in die mit Flüssigkeit vorgefüllte Gefriermühle und schließen Sie den Deckel mit dem Gummiverschluss an der Vorderseite des Instruments.
9. Lassen Sie die Proben 1 Minute in flüssigem Stickstoff abkühlen.
10. Stellen Sie die Gefriermühle mit 10 Zyklen pro Sekunde auf das 1-Minuten-Programm und drücken Sie die Starttaste. Warten Sie, bis die Gefriermühle ihren Zyklus abgeschlossen hat.
    HINWEIS: Die Maschine macht einen Trommelklang, während sich der Stahlstoßer hin und her bewegt. Verwenden Sie Ohrstöpsel, um Hörverlust zu vermeiden.
11. Öffnen Sie den Deckel der Gefriermühle, nehmen Sie die große Polycarbonat-Schleifflasche heraus und legen Sie sie in einen Extraktor gemäß Abbildung 1D. Entfernen Sie den oberen Stahlstecker, indem Sie den schwarzen Griff nach unten drücken, bis der Stahlstecker aus dem Polycarbonatrohr gleitet.
12. Übertragen Sie die geöffnete große Polycarbonat-Schleifflasche auf Trockeneis. Entfernen Sie den Stahlstoßmitschlag mit vorgekühlten Zangen.
13. Das gefrorene Pulver in vorgekühlte 50 ml konische Röhre geben.
14. Gewicht 30-50 mg gefrorenes Pulver in eine geteerte gefrorene 1,5 ml Mikrozentrifugenröhre für die RNA-Extraktion und 100-200 mg gefrorenes Pulver für die Proteinextraktion.
    HINWEIS: Das gefrorene Pulver sollte wie weißer oder hellrosa feiner Sand aussehen, wie in Abbildung 1Edargestellt.
15. Pulverisierte Proben bei -80 °C lagern und innerhalb von 24 h zu RNA- und Proteinisolationen übergehen.

2. RNA-Extraktion

1. Fügen Sie 10 l Von -Mercaptoethanol (-ME) pro 1 ml RLT-Puffer hinzu.
2. Berechnen Sie das Volumen des RLT-Puffers, das einem Verhältnis von 23,3 ml/mg Gewebe entspricht, und fügen Sie das entsprechende Volumen des RLT-Puffers mit dem Röhrchen mit gefrorenem Pulver in das Rohr ein. Dieses Verhältnis wurde empirisch als ideal für Mauspfoten ermittelt.
3. Wirbeln Sie die Probe bei 3.000 RPM für 10 s.
4. Mit einem 1 ml Pipettor gut mischen, indem man 10 Mal kräftig nach oben und unten pipet.
5. Wirbeln Sie die Probe wieder bei 3.000 RPM für 20 s.
6. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 13.000 x g für 2 min.
7. Übertragen Sie 700 l der Überstande in ein frisches Rohr und fügen Sie 700 l 70% Ethanol hinzu.
   HINWEIS: Wenn <700 l in der Röhre ist, ist es akzeptabel, fortzufahren und immer noch ein äquivalentes Volumen von 70% Ethanol hinzuzufügen.
8. Laden Sie 700 l der Probe auf eine RNA-Reinigungskolonne.
9. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 10.000 x g für 30 s.
10. Verwerfen Sie den Durchfluss und laden Sie den verbleibenden Teil der Probe in die RNeasy-Spalte.
11. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 10.000 x g für 30 s.
12. Entsorgen Sie den Durchfluss und waschen Sie die Säule, indem Sie 700 L RW1-Puffer mit einer Zentrifugierung von 10.000 x g für 30 s hinzufügen. Bei der Durchführung der Option DNASE-Verdauung werden vor der DNASE-Behandlung 350 l RW1 hinzugefügt.  Und nach der DNASE-Behandlung kommen weitere 350 L RW1 hinzu.
13. Optional) Führen Sie einen DNase-Verdauungsschritt nach den Anweisungen des Herstellers.
14. Waschen Sie das Rohr zweimal, indem Sie 500 l RPE-Puffer hinzufügen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 x g für 30 s. Entsorgen Sie den Durchfluss jedes Mal.
15. Trocknen Sie die Säule durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 2 min.
16. Elute-RNA durch Zugabe von 50 l Wasser mit Zentrifugation bei 10.000 x g für 2 min. Sammeln Sie den Durchfluss und übertragen Sie es in ein neues 1,5 ml-Rohr.
17. Bestimmen Sie die RNA-Menge mit der Methode der Wahl des Forschers und lagern Sie sie bei -80 °C vor der weiteren Analyse.

3. Proteinextraktion

1. Verdünnen Sie die 10x Zelllyse-Stammlösung in 1x Zelllyse-Stammlösung mit Zellkultur-Wasser.
2. Rekonstituieren Sie den Protease Inhibitor Cocktail Set I mit 1 ml Wasser, um einen 100-fachen Protease-Hemmer-Bestand zu bilden.
3. Fügen Sie 100 l Protease-Inhibitor zu 9,9 ml 1x Zelllyse hinzu, um eine 1x-Endstofflösung herzustellen.
4. Fügen Sie 4 l eiskalten 1x Zelllysispuffer pro mg-Gewebepulver hinzu (z. B. 800 l Lysepuffer auf 200 mg Gewebepulver).
5. Fügen Sie eine 5 mm Edelstahlperle in das Rohr ein.
6. Wirbeln Sie das Rohr bei 3.000 U/min für 60 s. Übertragen Sie das Rohr auf nasses Eis und fahren Sie mit der nächsten Probe fort.
7. Alle Probenröhrchen in eine Box geben und die Zentrifugenbox bei 1.000 U/min, 4 °C für 1 h auf eine Wippe schütteln.
   HINWEIS: Forscher können feststellen, dass das Platzieren der Box vertikal kann eine bessere Vermischung mit der Perle erleichtern.
8. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 10.000 x g und 4 °C für 15 min.
9. Übertragen Sie die Überräube in ein frisches Rohr und vermeiden Sie die Fettschicht auf der Oberseite.
10. Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration. 10- bis 30-fache Verdünnungen von Proteinlysat sind ideal für einen BCA-Test.
11. Aliquot die Probe in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren und lagern Sie bei -80 °C vor einer weiteren Analyse.

Results

Hier zeigen wir eine repräsentative Gelbildvisualisierung von RNA, die aus Vorderpfoten von CIA-Mäusen extrahiert wurde, in Abbildung 2A. Die 28S rRNA und das 18S rRNA-Band zeigen an, dass alle Proben eine ausreichende Menge an intakter RNA haben. Als Nächstes zeigen wir in Abbildung 2Beine repräsentative Streuungsdiagramm der gesamten Proteinkonzentrationen auf der Grundlage der Protein-BCA-Anal...

Discussion

Obwohl es starke wissenschaftliche Gründe für die Bewertung molekularer Pfade in Synovialgeweben gibt, konzentrierten sich viele Berichte über die Immunprofilierung des murinen CIA-Modells auf peripheres Blut, während Protein- und RNA-Analysedaten von entzündeten Pfoten eher begrenzt sind. Es gibt mehrere mögliche Gründe für diese Voreingenommenheit: murine Sprunggelenke sind nicht größer als 2 cm; Die betroffenen Bereiche bestehen aus Haut-, Knochen- und Bindegeweben, die mit traditionellen Methoden wie Gewebeschleifer,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm Edelstahlperle	Qiagen	69989
Beta-Mercaptoethanol	Sigma	M6250	Probenreduktionsmittel, das RNASE-Enzyme hemmt
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA-Qualifizierungskit
b-Mercaptoethanol	Sigma	M6250
Wasser in Zellkulturqualität	Corning	25-055-CI	Wasser
Zelllyse Stammlösung	Cell Signaling	9803
Eppendorf Röhrchen	Eppendorf	22363204	Microfuge Röhrchen
Eppendorf Röhrchenzentrifugenbox	Nalgene	5055	Kasten zum Halten von Eppendorf Röhrchen in horizontaler Röhrchenanordnung
Everlast 247 Wippe mit variabler Drehzahl	Benchmark Scientific	BR5000
Tiefkühlmühle	Spex Sample Prep	6875	Gefrierschrank/Mühle für die Verarbeitung von Pfoten zu pulverisiertem
Pulver Mahlfläschchen	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonat-Fläschchen für die Verarbeitung von Pfoten zu pulverisiertem
Pulver Pierce BCA-Kit	Pierce	23225	Kit für die Totalproteinquantifizierung
Proteaseinhibitor Cocktail-Set 1	Calbiochem	539131	Proteaseinhibitoren
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA-Analyse-Kit
Gekühlte Mikrozentrifuge	Eppendorf	5417R	Zentrifugation
RLT-Puffer	Qiagen	79216	RNA-Extraktionspuffer
RNeasy Mini-Kit	Qiagen	74104	inklusive RNeasy-Säule, RLT-Puffer und RW1-Puffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Wippe/
Shaker Spatel	VWR	10806-412	Spatel für den Pulvertransfer
Edelstahlperle	Qiagen	69989	Perle zum Mischen während der Proteinextraktion
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extraktor zum Entfernen der Oberseite des Mahlfläschchens
Vortexer	VWR	10153-838	Mischen von Proben