Blut - Hirn-Schranke Integrität ist entscheidend für die Funktion des Nervensystems. Bei Drosophila melanogasterwird die Blut-Hirn-Schranke bei der späten Embryogenese durch Gliazellen gebildet. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Bildung und Erhaltung von Blut-Hirn-Barrieren bei D. melanogaster Embryonen und dritten Instarlarven.
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Methodenartikel
Assay für Blut - Hirn-Barriere Integrität in Drosophila melanogaster
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die richtige Entwicklung des Nervensystems umfasst die Bildung der Blut- und Hirnschranke, der Diffusionsbarriere, die den Zugang zum Nervensystem streng reguliert und das Nervengewebe vor Giftstoffen und Krankheitserregern schützt. Defekte bei der Bildung dieser Barriere wurden mit Neuropathien korreliert, und der Abbau dieser Barriere wurde bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet. Daher ist es wichtig, die Gene zu identifizieren, die die Bildung und Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke regulieren, um potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Um die genaue Rolle dieser Gene bei der neuronalen Entwicklung zu verstehen, ist es notwendig, die Auswirkungen der veränderten Genexpression auf die Integrität der Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen. Viele der Moleküle, die bei der Etablierung der Blut - Hirn-Schranke funktionieren, wurden gefunden, um über eukaryotische Arten konserviert werden, einschließlich der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster. Fruchtfliegen haben sich als ausgezeichnetes Modellsystem zur Untersuchung der molekularen Mechanismen zur Regulierung der Entwicklung und Funktion des Nervensystems erwiesen. Dieses Protokoll beschreibt ein Schrittweiseverfahren zur Untersuchung der Integrität der Blut- und Hirnschranke während der embryonalen und larven endenden Stadien der D. melanogaster Entwicklung.
Einleitung
Während der Entwicklung sind Zell-Zell-Kommunikation und Wechselwirkungen entscheidend für die Etablierung von Gewebe- und Organstruktur und -funktion. In einigen Fällen versiegeln diese Zell-Zell-Wechselwirkungen Organe aus der Umgebung, um eine ordnungsgemäße Organfunktion zu gewährleisten. Dies gilt für das Nervensystem, das durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) isoliert wird. Dysfunktion der BBB beim Menschen wurde mit neurologischen Erkrankungen einschließlich Epilepsie verbunden, und Abbau der Barriere wurde bei neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich Multipler Sklerose und amyotrophe Lateralsklerose beobachtet1. Bei Säugetieren wird ....
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Protokoll
1. Entnahme von Proben
- Embryo-Sammlung
- Verwenden Sie in jedem Embryo-Entnahmekäfig mindestens 50 jungfräuliche Weibchen mit 20 bis 25 Männchen für Sammlungen. Inkubieren Sie diese Fliegen in einer Flasche mit Maismehl-Agar-Lebensmittel (Tabelle der Materialien) für 1 bis 2 Tage vor Beginn der Sammlungen23.
HINWEIS: Es können mehr Fliegen verwendet werden, aber das Verhältnis zwischen Frau und Mann sollte bei 2:1 gehalten werden. - Vorwarme Apfelsaft-Agar-Teller (Tabelle 1) bei 25 °C über Nacht.
HINWEIS: Dies ist für die ordnung....
- Verwenden Sie in jedem Embryo-Entnahmekäfig mindestens 50 jungfräuliche Weibchen mit 20 bis 25 Männchen für Sammlungen. Inkubieren Sie diese Fliegen in einer Flasche mit Maismehl-Agar-Lebensmittel (Tabelle der Materialien) für 1 bis 2 Tage vor Beginn der Sammlungen23.
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Ergebnisse
Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die Visualisierung der Integrität des BBB im gesamten ZNS in D. melanogaster Embryonen und Larven (Abbildung 1). Nach Abschluss der BBB-Bildung in der späten Embryogenese funktioniert das BBB, um große Moleküle aus dem Gehirn und VNC5auszuschließen. Dieses Protokoll nutzt diese Funktion, um die BBB-Bildung zu assayen. Als Wildtyp (Oregon R) spätes Stadium 17 (20-21 h alt) Embryonen mit 10 kDa Dextran konjugiert zu S.......
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Diskussion
Dieses Protokoll enthält eine umfassende Beschreibung der Schritte, die erforderlich sind, um die BBB-Integrität während der späten embryonalen und dritten instar larvalen Stadien der D. melanogaster Entwicklung zu assay. Ähnliche Ansätze wurden an anderer Stelle beschrieben, um die Integrität des BBB während der Entwicklung sowie in erwachsenen Stadien5,7,29,30zu bewerten. Die Beschre.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. F. Bryan Pickett und Dr. Rodney Dale für die Verwendung von Injektionsgeräten. Diese Arbeit wurde durch Forschungsgelder von der Loyola University Chicago an M.D., D.T. und J.J. finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10 kDa Sulforhodamin 101 saures Chlorid (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran sollte in autoklaviertem ddH2O auf eine Konzentration von 25 mg/ml verdünnt werden. |
| 20 μ L Gel-Loading Pipettenspitzen | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Luftkompressor | DeWalt | D55140 | |
| Apfelsaft | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Haushaltsbleiche | 1-5% Hypochlorit | |
| Borosilikatglas Kapillaren | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Flaschenstopfen | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Zellsiebe | BD Falcon | 352350 | |
| Konfokalmikroskop | Olympus | FV1000 | Proben aufgenommen mit einem 20-fach-Objektiv (UPlanSApo 20x/ 0,75) |
| Applikator mit Wattespitze | Puritan | 19-062614 | |
| Doppelseitiges Klebeband 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Pinzette; Muster #5; .05 x .01 mm Spitze | Roboz | RS-5015 | |
| Fliegenfutterflaschen | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fläschchen mit Fliegenfutter | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fußpedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glas Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerin | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Kristallzucker | Im Lebensmittelgeschäft gekauft. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Lichtquelle | Schott | Ace I | |
| Manipulator Ständer | World Precision Instruments | M10 | |
| Mikromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Mikropipettenabzieher | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Nadelhalter | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Elektronenmikroskopie Wissenschaft | SFA-LFS-CY | Zur Visualisierung von YFP |
| Nightsea Full Adapter System mit Royal Blue Color Light | Head Elektronenmikroskopie Wissenschaft | SFA-RB | Zur Visualisierung von GFP |
| Pinsel | Simply Simmons | Meißelmeißel Blender #6 | |
| Pipettierer | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatikpumpe | World Precision Instruments | PV830 | Dies wird auch als Mikroinjektor oder Druckregler bezeichnet. Da das in unserer Studie verwendete Modell nicht mehr verfügbar ist, ist dies eine Alternative. |
| Kaliumchlorid | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Kaliumphosphat dibasisch | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Kleine Käfige zur Embryonenentnahme | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Natriumchlorid | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Natriumphosphat dibasisch wasserfrei | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Stahlgrundplatte | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomikroskop | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Wird für die Gewebedissektion verwendet. |
| Stereomikroskop mit Durchlichtquelle | Baytronix | Wird für die Injektion verwendet. | |
| Tegosept (p-Hydroxybenzoesäure, Methylester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nichtionisches Tensid |
| Fläschchen Stopfen | Fisher Scientific | AS-273 |
Referenzen
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate br....
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Nachdrucke und Genehmigungen
