Methodenartikel

Bakterielles Peptid-Display zur Auswahl neuartiger Biotinylatierungsenzyme

DOI:

10.3791/60266

⸱

3. Oktober 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Nephrology, Odense University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir eine Methode zur Auswahl neuartiger Varianten der E. coli-Biotin-Proteinligase BirA vor, die ein bestimmtes Zielpeptid biotinylatiert. Das Protokoll beschreibt die Konstruktion eines Plasmids zur bakteriellen Darstellung des Zielpeptids, die Erzeugung einer BirA-Bibliothek, die Auswahl und Charakterisierung von BirA-Varianten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biotin ist eine attraktive posttranslationale Modifikation von Proteinen, die ein leistungsstarkes Tag für die Isolierung und Detektion von Proteinen bietet. Die enzymatische Biotinylierung durch die E. coli-Biotin-Proteinligase BirA ist sehr spezifisch und ermöglicht die Biotinylierung von Zielproteinen in ihrer heimischen Umgebung; Die aktuelle Verwendung der von BirA vermittelten Biotinylierung erfordert jedoch das Vorhandensein eines synthetischen Akzeptorpeptids (AP) im Zielprotein. Daher ist seine Anwendung auf Proteine beschränkt, die entwickelt wurden, um den AP zu enthalten. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die bakterielle Darstellung eines Peptids aus einem unveränderten Zielprotein zu verwenden, um für BirA-Varianten auszuwählen, die das Peptid biotinylatieren. Das System basiert auf einem einzigen Plasmid, das die Koexpression von BirA-Varianten zusammen mit einem Gerüst für die Peptidanzeige auf der Bakterienoberfläche ermöglicht. Das Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Einbindung des Zielpeptids in das Displaygerüst, die Erstellung der BirA-Bibliothek, die Auswahl aktiver BirA-Varianten und die anfängliche Charakterisierung der isolierten BirA-Varianten. Das Verfahren bietet ein hochwirksames Selektionssystem zur Isolierung neuartiger BirA-Varianten, die für die weitergeleitete Weiterentwicklung von Biotin-Protein-Ligasen verwendet werden können, die ein natives Protein in komplexen Lösungen biotinylaten.

Einleitung

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Die Biotinylierung eines Proteins erzeugt ein leistungsstarkes Tag für seine Affinitätsisolierung und -detektion. Enzymatische Proteinbiotinylierung ist eine hochspezifische posttranslationale Modifikation, die durch Biotin-Protein-Ligasen katalysiert wird. Die E. coli Biotin-Protein-Ligase BirA ist extrem spezifisch und kovalent biotinylatiert nur eine begrenzte Anzahl natürlich vorkommender Proteine an spezifischen Lysinrückständen1. Die Vorteile der von BirA katalysierten Biotinylierung werden derzeit genutzt, indem das Zielprotein mit einem kleinen synthetischen 15-Aminosäure-Biotin-Akzeptid (AP) verschont wird, das effektiv biotinylatiert2 ist und die hochspezifische und effiziente In-vivo- und In-vitro-Biotinylierung durch Ko-Expression oder Zugabe von BirA3,4,5. Obwohl die in vivo und in vitro BirA katalysierte Biotin-Protein-Ligation eine attraktive Etikettierungsstrategie ist, beschränkt sich ihre Anwendung auf Proben, die AP-verschmolzene Proteine enthalten. Der Zweck dieser Methode ist die Entwicklung neuer Mutanten von Biotin-Protein-Ligasen, die selektiv native unveränderte Proteine biotinylaten und damit die Anzahl der Anwendungen erweitern, in denen die enzymatische Biotinylierungsstrategie eingesetzt werden kann.

Die Proteinfunktion kann durch iterative Runden der Genmutation, Selektion und Amplifikation von Genvarianten mit der gewünschten Funktion entwickelt werden. Eine starke und effiziente Selektionsstrategie ist entscheidend für die gezielte Evolution und die Biotin-Protein-Ligase-Aktivität ist aufgrund der starken Bindung zwischen Biotin und Streptavidin und seinen Homologen6leicht ausgewählt. Phage Display-Technologien ermöglichen die Auswahl von Phagen, die biotinylierte Peptide7,8zeigen. Da die Amplifikation isolierter Phagen eine Infektion eines bakteriellen Wirts erfordert, schafft die Phagenauswahl mit Streptavidin jedoch einen Engpass, da die hochaffine Bindung von Biotin an Streptavidin unter nicht-denaturierender Bedingungen. Um eine reversible Bindung von biotinylierten Phagen zu gewährleisten, wurden monomere Avidine mit geringerer Affinität verwendet, was zu einer bescheidenen Anreicherung von7. Wir haben vor kurzem eine bakterielle Anzeigemethode zur Isolierung neuartiger BirA-Varianten entwickelt, die die Notwendigkeit der Elution aus der Affinitätsmatrix eliminiert und damit einen Engpass aus früheren BirA-Selektionssystemen beseitigt9. Tatsächlich ermöglicht unser bakterielles Anzeigesystem eine >1.000.000-fache Anreicherung aktiver Klone in einem einzigen Selektionsschritt9und bietet so ein effektives Selektionssystem für die gezielte Weiterentwicklung neuartiger BirA-Varianten.

Unser bakterielles Anzeigesystem besteht aus zwei Komponenten, BirA mit einem C-Terminal 6xHis Tag und einem Gerüstprotein, das die Oberflächenanzeige eines Zielpeptids ermöglicht. Wir verwendeten das Gerüstprotein, das kreisförmig permutiertes äußeres Membranprotein X (eCPX) verstärkt hat, da die effektive Anzeige von Peptiden sowohl an den N- als auch an C-termini10,11beobachtet werden kann. Die Verschmelzung der Zielpeptidsequenz zum C-Terminus von eCPX gewährleistet die Biotinylierung von Bakterien, die aktive BirA-Varianten exdrücken. Die Bakterien ermöglichen die effektive Streptavidin-Auswahl, da das biotinylierte Peptid nun auf der Oberfläche angezeigt wird (Abbildung 1a).

Der Zweck dieser Methode ist es, für neuartige Varianten von BirA auszuwählen, die Peptidsequenzen in nativen Proteinen biotinylate. Das System wird durch Gene kodiert, die auf dem Plasmid pBAD-BirA-eCPX-AP vorhanden sind, das einen arabinose-induzierbaren Promotor enthält, der BirA (araBAD) kontrolliert, und einen T7-Promotor, der eCPX9 kontrolliert (Abbildung 1b). Das vorliegende Protokoll beschreibt das detaillierte Verfahren für die 1) Aufnahme eines Peptids aus einem Zielprotein in das C-Terminal von eCPX, 2) Die Erstellung einer Mutationsbibliothek von BirA durch fehleranfällige PCR, 3) Auswahl von Streptavidin-bindenden Bakterien durch magnetaktivierte Zellsortierung (MACS), 4) Quantifizierung der Bakterienanreicherung und 5) anfängliche Charakterisierung isolierter Klone.

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Protokoll

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1. Einfügen der Peptid-Codierungssequenz in pBAD BirA-eCPX-AP

HINWEIS: Um für BirA-Varianten auszuwählen, die ein natives Zielprotein biotinylaten, beginnen Sie mit der Identifizierung einer 15-Aminosäure-Peptidsequenz in der Primärsequenz der Proteine, die mindestens einen Lysin -Rückstand (K) enthält.

  1. Wechseln Sie zur Sequenzmanipulationssuite12.
  2. Fügen Sie die identifizierte 15 Aminosäure-Peptidsequenz in die Eingabebox im FASTA-Format ein und drücken Sie Submit.
  3. Wählen sie die 45 Nukleotid-Reverse-Übersetzung der Peptidsequenz aus und kopieren Sie sie.
  4. Laden Sie die GenBank-Datei für pBAD-BirA-eCPX-AP von http://n2t.net/addgene:121907 herunter.
  5. Laden Sie die Datei in einen Plasmid-Editor (z. B. ApE) und wählen Sie im Feature-Fenster die AP-Sequenz mit der Bezeichnung "AviTag(TM)" aus.
  6. Klicken Sie im DNA-Sequenzfenster mit der rechten Maustaste auf die markierte AP-Sequenz, und wählen Sie Rev-Com im Kontextmenü einfügen aus.
    HINWEIS: Die Codierungssequenz von eCPX befindet sich in umgekehrter Richtung und die Peptid-Codierungssequenz sollte daher als umgekehrte Ergänzung eingefügt werden.
  7. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die hervorgehobene Sequenz, und wählen Sie Neues Feature aus.
  8. Fügen Sie einen beschreibenden Namen der eingefügten Sequenz hinzu, und drücken Sie OK.
  9. Wählen Sie Speichern unter im Menü Datei aus, um die geänderte Datei zu speichern.
  10. Entwerfen Sie die Vorwärtsgrundierung so, dass sie die letzten 30 Nukleotide der umgekehrten Komplementierung der Peptid-Codierungssequenz enthält, und fügen Sie die Plasmidbindungsnukleotidsequenz (3'-GCGGCCGCCTGC-5') zu ihrem 5'-Ende hinzu.
  11. Entwerfen Sie die Reverse-Primer so, dass sie die ersten 30 Nukleotide der umgekehrten Komplementierung der Peptid-Codierungssequenz enthält, und fügen Sie die Plasmidbindungsnukleotidsequenz (3'- CTTAAGTAATGTTTAAACGAATTCGAG-5') zu ihrem 5'-Ende hinzu.
  12. Richten Sie eine 20-L-PCR-Reaktion in einem dünnwandigen PCR-Rohr ein, indem Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien hinzufügen.
  13. Übertragen Sie das Rohr auf einen thermischen Cycler und führen Sie PCR mit einem Programm mit einer anfänglichen Denaturierung bei 98 °C für 30 s, 30 Zyklen von [15 s bei 98 °C, 15 s bei 60 °C und 3 min bei 72 °C] durch, Endverlängerung für 2 min bei 72 °C und halten bei 4 °C.
  14. Führen Sie die PCR-Reaktion mit einem 1% Agarose-Gel aus, um die Amplifikation eines PCR-Produkts mit einer Größe von 6 kb zu bestätigen.
    HINWEIS: Wenn kein PCR-Produkt beobachtet wird, optimieren Sie den PCR-Zustand gemäß den Anweisungen des Herstellers. Das Protokoll kann hier angehalten werden.
  15. Der PCR-Reaktion 1 L DpnI hinzufügen und 1 h bei 37 °C inkubieren
  16. Transformieren Sie die kompetente E. coli mit 2 l DpnI verdautPCR-Reaktion und Platte auf Lysogenic Brühe (LB)/Amp-Platten. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  17. Impfen Sie 5 ml mit 100 g/ml Ampicillin mit einer einzigen Kolonie. Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen/min inkubieren.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, mindestens 6 Kolonien zu testen.
  18. Machen Sie Gefrierbestände von 850 L jeder Nachtkultur, indem Sie der Kultur eine Endkonzentration von 15 % zug. Bei -80 °C lagern.
  19. Extrahieren Sie die Plasmid-DNA aus der verbleibenden 4 ml-Kultur durch Mini-Prep-DNA-Extraktionskit.
  20. Bestätigen Sie die korrekte Einfügung der Peptid-Codierungssequenz durch DNA-Sequenzierung mit T7 Terminal Primer (GCTAGTTATTGCTCAGCGG).

2. Generierung einer BirA-Bibliothek

HINWEIS: Die anfängliche BirA-Mutationsbibliothek (Abbildung 1c, Schritt 1) wird durch fehleranfällige PCR erstellt. Andere Methoden zur Generierung der BirA-Mutationsbibliothek werden wahrscheinlich auch funktionieren.

  1. Synthetisieren Sie die mutierten Megaprimer mit BirA-6xHis forward (ATGAAGGATAACACCGTGCC) und reverse (TCAATGATGATGATGATGATGTTTTT) Primer mit 1 ng pBAD-BirA-eCPX mit der Zielpeptidsequenz (vorbereitet und bestätigt in Schritt 1.20) als Vorlage und 35 PCR-Zyklen mit einer Glühtemperatur von 60 °C nach Herstelleranweisung.
  2. Führen Sie die Amplifikationsreaktion mit einem 1% Agarose-Gel aus, um die Amplifikation eines 984 bp PCR-Produkts zu überprüfen.
  3. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem kommerziellen PCR-Reinigungskit aus den verbleibenden 45 L der Amplifikationsreaktion und verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die DNA-Ausbeute zu quantitieren.
    HINWEIS: Die Reinigung durch eine einzelne 45-L-Amplifikationsreaktion ergibt in der Regel eine ausreichende Ausbeute (>250 ng).
  4. Bereiten Sie die Probenreaktion in einem dünnwandigen PCR-Rohr vor, indem Sie die in Tabelle 2aufgeführten Reagenzien hinzufügen.
  5. Übertragen Sie das Reaktionsgemisch auf einen thermischen Cycler und führen Sie die PCR mit den in Schritt 2.3 hergestellten mutierten Megaprimern mit folgenden Parametern aus: 1 min bei 95 °C und 25 Zyklen von 50 s bei 95 °C, 50 s bei 60 °C und 12 min bei 68 °C. Bewahren Sie die Reaktion bei 4 °C auf.
  6. Fügen Sie der Amplifikationsreaktion direkt 1 L dpnI-Restriktionsenzym hinzu und mischen Sie sie vorsichtig.
  7. Das Reaktionsgemisch abdrehen und 2 h bei 37 °C inkubieren.
  8. Transformieren Sie T7 Express lysY/Iq kompetente E. coli-Zellen mit 2 L der DpnI-Reaktion.
  9. 100 ml mit 100 g/ml Ampicillin mit den transformierten Zellen impfen und über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
  10. Herstellung von Gefriervorräten mit 10 ml der Übernachtungskultur in LB mit 15% Glycerin und Lagern Sie bei -80 °C.

3. Auswahl von Bakterien, die biotinyliertes Peptid ausdrücken

HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls behandelt Schritt 2-5 von Abbildung 1c. Es wird dringend empfohlen, den Auswahlansatz mit pBAD-BirA-eCPX-AP und pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) als positive und negative Kontrollen einzurichten.

  1. 100 ml LB mit 1% Glukose und 100 g/ml Ampicillin mit 1 ml BirA-Bibliothek impfen und über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
  2. Impfen Sie 5 ml LB mit 1% Glukose und 100 g/ml Ampicillin mit 100 l der Übernachtungskultur.
  3. Inkubieren Sie für 2 h und 30 min, bis die Kultur eine OD600 von ca. 0,5 erreicht.
  4. Induzieren Sie eCPX- und BirA-Expression mit 0,2 % w/v L-Arabinose, 100 M Isopropyl-D-1-Thiogalactopyranosid (IPTG) und 100 M Biotin und schütteln Sie die Kultur bei 200 Umdrehungen pro Minute für 1 h bei 37 °C.
  5. Zentrifugieren Sie die Kultur für 10 min bei 5.000 x g und entfernen Sie den Überstand.
  6. Die Zellen in 1 ml des eiskalten PBS und zentrifugieren bei 5.000 x g für 5 min wieder aussetzen.
  7. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 400 l eiskaltem PBS wieder auf und speichern Sie Zellen auf dem Eis.
  8. Entfernen Sie 10 l resuspendierte Zellen und lagern Sie auf dem Eis in einem 1,5 ml Rohr mit der Bezeichnung "Input".
  9. Waschen Sie 20 L Streptavidin-Magnetperlen in 1 ml eiskaltem PBS und legen Sie das Rohr in einen magnetischen Partikelabscheider auf der Bankspitze, bevor Sie den Überstand vorsichtig entfernen.
  10. Setzen Sie die Streptavidin-Magnetperlen in 20 l eiskaltem PBS wieder auf und übertragen Sie sie ab Schritt 3.8 auf die 390 l resuspendierten Zellen.
  11. Durch sanftes Pipetieren mischen und dann 30 min bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: Wirbeln Sie nicht, da dies die Zellen lysieren kann. Die Aggregation von Perlen wird oft mit einer hohen Fülle von Bakterien beobachtet, die ein biotinyliertes Peptid zeigen.
  12. Legen Sie eine Säule mit ferromagnetischen Kugeln in einen magnetischen Partikelabscheider und waschen Sie sie mit 5 ml eiskaltem PBS.
  13. Übertragen Sie Zellen und Streptavidin-Magnetperlen auf die im Separator befestigte Säule.
  14. Sobald das Säulenreservoir leer ist, fügen Sie 500 l eiskalte PBS hinzu und wiederholen Sie sie, bis die Säule mit einem Gesamtvolumen von 5 ml eiskaltem PBS gewaschen wurde.
  15. Entfernen Sie die Säule aus dem Trennzeichen und legen Sie sie in ein 1,5 ml-Rohr.
  16. 1 ml des eiskalten PBS auf die Säule pfeifen und die magnetisch beschrifteten Zellen durch Auftragen des mit der Säule gelieferten Kolbens auftragen.
  17. Das 1,5 ml-Rohr auf einen Sitzabscheider übertragen und die magnetisch beschriftete Zelle mit 1 ml eiskaltem PBS waschen.
  18. Die magnetisch beschrifteten Zellen in 1 ml des eiskalten PBS vor dem Entfernen und Lagern von 10 l der Resuspension in einem 1,5 ml-Rohr mit der Bezeichnung "Output" vorsichtig wieder aufhängen.
  19. 100 ml LB mit 1% Glukose und 100 g/ml Ampicillin mit den magnetisch markierten Zellen impfen und über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
  20. Verwenden Sie am nächsten Tag 10 ml der Übernachtungskultur, um Gefriervorräte mit Zellen in LB mit 15% Glycerin herzustellen und bei -80 °C und 1 ml der Übernachtungskultur für die nächste Auswahlrunde, d.h. Schritt 3.2, aufzubewahren.
    HINWEIS: In der Regel werden 3-5 Selektionsrunden für die Anreicherung von Streptavidin-bindenden Bakterien empfohlen.

4. Quantifizierung der Anreicherung

HINWEIS: Die Quantifizierung der lebenden Bakterien in den Proben "Input" und "Output" erfolgt nach jeder Selektionsrunde durch Plattieren der seriellen Verdünnungen der Proben und anschließende Zählung von koloniebildenden Einheiten (KBE).

  1. Fügen Sie 990 l eiskalte PBS zu den Eingangs(ab Schritt 3.8) und Ausgangsmustern (ab Schritt 3.18) hinzu und beschriften Sie die Röhren "Input 10-2"bzw. "Output 10-2".
  2. Machen Sie 10-fache serielle Verdünnungen der "Input 10-2" und "Output 10-2" Proben in eiskalten PBS, bis eine endgültige Verdünnung von 10-10 in der Eingangsprobe und 10-4 in der Ausgangsprobe erreicht ist.
  3. Die Platte 100 l der Proben aus "Input 10-6", "Input 10-8", "Input 10-10", "Output 10-2", "Output 10-3" und "Output 10-4" auf LB/Amp-Platten und inkubieren über Nacht bei 37 °C.
  4. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf den Platten mit klar getrennten Kolonien. Multiplizieren Sie die Koloniezahl mit dem Verdünnungsfaktor, um die bakterielle Konzentrationszahl/100 l zu erhalten.
  5. Berechnen Sie die gesamte Bakterienzahl in den Input- und Output-Proben, indem Sie die Zellkonzentration mit dem Input (400 l) bzw. dem Ausgangsvolumen (1 ml) multiplizieren, und schätzen Sie die Anreicherung, indem Sie die Ausgabe mit der Anzahl der Eingangszellen dividieren.
    HINWEIS: Eine signifikante Bereicherung sollte nach 3-5 Auswahlrunden sichtbar sein

5. Charakterisierung der ausgewählten BirA-Variante

HINWEIS: Die Charakterisierung kann nach Auswahl von BirA-Varianten aus der ersten BirA-Bibliothek durchgeführt werden. Die BirA-Varianten haben jedoch in der Regel eine geringe Aktivität gegenüber dem Peptid. Daher kann vor der Charakterisierung auch eine zusätzliche Mutations- und Selektionsrunde durchgeführt werden. Normalerweise werden 10 Klone aus der finalen Auswahlrunde für die weitere Charakterisierung isoliert.

  1. Impfen Sie 5 ml lb mit 100 g/ml Ampicillin mit ausgewählten Klonen aus der endletzten Auswahlrunde. Zusätzlich werden 5 ml mL lb mit 100 g/ml Ampicillin mit T7 Express lysY/Iq E. coli mit pBAD-BirA-eCPX-AP transformiert, das als positiv für den unten beschriebenen westlichen Fleck verwendet wird.
  2. Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen/min inkubieren.
  3. Machen Sie Gefrierbestände von 850 L jeder Nachtkultur, indem Sie der Kultur eine Endkonzentration von 15 % zug. Bei -80 °C lagern.
  4. 5 ml LB mit 100 g/ml Ampicillin mit 100 l Übernachtungskultur impfen und bei 37 °C mit Schütteln bei 200 U/min für 2 h inkubieren.
  5. Extrahieren Sie die Plasmid-DNA aus der verbleibenden 4 ml-Kultur durch s kommerziell Mini-Prep-DNA-Extraktionskit. Führen Sie die DNA-Sequenz in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung der BirA-Varianten mit pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) und pTrcHis rev (CTTCTGTGTTCTGATTTAATCTG) Primern durch.
  6. Fügen Sie 0,2 % w/v L-Arabinose und 100 M IPTG und 100 M Biotin zu Kulturen ab Schritt 5.4 hinzu und schütteln Sie die Kultur bei 200 Umdrehungen pro Minute für 1 h bei 37 °C, um die Expression von eCPX- und BirA-Varianten zu induzieren.
  7. Übertragen Sie 65 l der Kultur in 1,5 ml-Rohre, die 25 l des Probenladepuffers und 10 l des Reduktionsmittels enthalten.
  8. Bei 95 °C für 5 min inkubieren.
  9. Die Probe (einschließlich der Positivkontrolle) auf ein 12% SDS-Polyacrylamid-Gel zusammen mit einem Größenmarker laden und die Gelelektrophorese bei 200 V ca. 45 min durchführen, bis die 20, 25 und 37 kDa Standardbänder klar voneinander getrennt sind.
  10. Lassen Sie das Gel aus der Kassette und montieren Sie das Sandwich zum Bloten des Gels auf eine PVDF-Membran.
  11. Elektroblot bei 35 V für 2 h auf Eis.
  12. Entfernen Sie die PVDF-Membran und inkubieren Sie im Sperrpuffer [PBS, 0.05% Tween-20, 3% Magermilchpulver] für 1 h bei Raumtemperatur mit Schütteln.
  13. Bereiten Sie die Biotin-Detektionslösung vor, indem Sie Streptavidin-HRP 1:1.000 in PBST verdünnen.
    HINWEIS: Der Sperrpuffer enthält Biotin und sollte daher nicht als Verdünnungspuffer für Streptavidin-HRP verwendet werden.
  14. Entsorgen Sie den Sperrpuffer, waschen Sie die Membran schnell in PBST [PBS, 0.05% Tween-20] und fügen Sie die Biotin-Detektionslösung hinzu. 1 h bei Raumtemperatur mit Schütteln bebrüten.
  15. Entsorgen Sie die Biotin-Detektionslösung und waschen Sie die Membran zweimal zweimal und 10 min bei sanftem Schütteln bei Raumtemperatur 5 min lang gründlich in PBST.
  16. Entsorgen Sie den PBST, fügen Sie 2 ml ECL-Mix hinzu und brüten Sie 1 min mit Schütteln.
  17. Trocknen Sie die Membran schnell auf einem Tissuepapier und entwickeln Sie das Bild auf einem Röntgenfilm oder in einem digitalen Gel-Bildgebungssystem.
    HINWEIS: In der mit der Positivkontrolle beladenen Spur sollten zwei unterschiedliche Streptavidin-Reaktionsbänder deutlich sichtbar sein: ein 30 kDa biotinyliertes endogen exprimiertes Protein und das 22 kDa eCXP-AP-Band. Wenn die 10 ausgewählten Kolonien das angezeigte Peptid biotinylatieren können, sollte ein Band bei 22 kDa sichtbar sein. Die Intensität dieser Bänder ist im Allgemeinen niedriger als die Positivkontrolle und kann daher längere Belichtungszeiten erfordern.

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Ergebnisse

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Westlicher Fleck von pBAD-BirA-eCPX-AP-exemitten Bakterien erzeugt ein 22 kDa-Streptavidin-reagierendes Band, das mit dem Molekulargewicht von eCPX übereinstimmt (Abbildung 2a). Im Gegensatz zu BirA-6xHis war biotinyliertee eCPX-AP sowohl in nicht induzierten als auch in induzierten Kulturen vorhanden(Abbildung 2a) aufgrund einer geringen T7-Promotoraktivität auch in nicht induzierten Kulturen und anschließender Biotinylierung d...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wie bei allen Selektionsmethoden ist die Strenge der Waschschritte von größter Bedeutung. Da Bakterien vor der Verstärkung der ausgewählten Klone nicht aus den Perlen eluiert werden müssen, kann die hohe Affinitätsbindung zwischen Biotin und Streptavidin anstelle von avidinen mit geringerer Affinität, wie bisher mit dem Phagenanzeigesystem, für die Auswahl der BirA-Varianten7,8. Dadurch wird sichergestellt, dass seltene Klone ausgewählt werden und nicht biotinyli...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Mohamed Abdullahi Ahmed für die kompetente Technikerhilfe. Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Lundbeck-Stiftung, der Novo Nordisk Foundation, der Danish Kidney Association, der Aase og Ejnar Danielsen Foundation, der A.P. M.Ller Foundation for the Advancement of Medical Science sowie Von Knud und Edith Eriksen unterstützt. Memorial Foundation.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10% vorgefertigtes Polyacrylamid-GelBio-Rad4561033
AmpicilinSigma-AldrichA1593
ApE - Ein Plasmid-Editor v2.0NANAheruntergeladen von http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
ArabinoseSigma-AldrichA3256
BiotinSigma-AldrichB4501
DMSOSigma-AldrichD2650
DPBS (10x), kein Kalzium, kein MagnesiumThermoFischer Scientific14200083
New England BioLabsR0176
Dynabeads MyOne Streptavidin C1ThermoFischer Scientific65001
GenElute Plasmid Miniprep KitSigma-AldrichPLN350
GeneMorph II EZClone Domain Mutagense KitAgilent Technologies200552
GlucoseSigma-AldrichG8270
GlycerolSigma-AldrichG5516
Immobilon-P PVDF MembranMilliporeIPVH15150
IPTGSigma-AldrichI6758
LS SäulenMiltenyi Biotec130-042-401
NaClSigma-AldrichS7653
NEB 5-alpha Kompetent E. coliNew England BioLabsC2987
NuPAGE LDS Probenpuffer (4x)ThermoFischer ScientificNP0007
NuPAGE Probenreduktionsmittel (10x)ThermoFischer ScientificNP0009
pBAD-BirA-eCPX-APAddgene121907Verwendete ein Template und eine Positivkontrolle
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)Addgene121908Negativkontrolle
Q5 High-Fidelity DNA-PolymeraseNew England BioLabsM0491Für die Insertion der Peptidsequenz in pBAD-BirA-eCPX-AP wird jede High-Fidelity-Polymerase tun
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976
Magermilch PulverSigma-Aldrich70166
Streptavidin-HRPAgilent TechnologiesP0397
T7 Express lysY/Iq Kompetent E. coliNew England BioLabsC3013
TryptonMilliporeT9410
Tween-20Sigma-AldrichP9416
Western Lightning Plus-ECLPerkinElmerNEL103001EA
HefeextraktSigma-AldrichY1625
DpnI-Restriktionsenzym

Referenzen

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