Methodenartikel

Überwachung des extrazellulären pH-Werts in cross-kingdom Biofilmen mit Konfokalmikroskopie

DOI:

10.3791/60270

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30. Januar 2020

 , 
1Department of Dentistry and Oral Health, Aarhus University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Protokoll beschreibt den Anbau von königreichübergreifenden Biofilmen, die aus Candida-Albicans und Streptococcus-Mutanen bestehen, und stellt eine konfokale Mikroskopie-basierte Methode zur Überwachung des extrazellulären pH-Werts in diesen Biofilmen dar.

Zusammenfassung

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Reichübergreifende Biofilme, die aus Pilz- und Bakterienzellen bestehen, sind an einer Vielzahl von Oralerkrankungen beteiligt, wie endodontische Infektionen, Parodontitis, Schleimhautinfektionen und vor allem frühkindliche Karies. Unter all diesen Bedingungen wirkt sich der pH-Wert in der Biofilmmatrix auf Mikroben-Wirt-Wechselwirkungen und damit auf das Krankheitsverlauf aus. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine konfokale Mikroskopie-basierte Methode zur Überwachung der pH-Dynamik innerhalb königreichübergreifender Biofilme, die Candida-Albicans und Streptococcus-Mutane umfassen. Das pH-abhängige Dual-Emissions-Spektrum und die Färbeeigenschaften der ratiometrischen Sonde C-SNARF-4 werden genutzt, um pH-Tropfen in extrazellulären Bereichen der Biofilme zu bestimmen. Die Verwendung der pH-Ratiometrie mit der Sonde erfordert eine sorgfältige Auswahl der bildgebenden Parameter, eine gründliche Kalibrierung des Farbstoffs und eine sorgfältige, schwellenbasierte Nachbearbeitung der Bilddaten. Bei richtiger Verwendung ermöglicht die Technik die schnelle Beurteilung des extrazellulären pH-Werts in verschiedenen Bereichen eines Biofilms und damit die Überwachung von horizontalen und vertikalen pH-Gradienten im Zeitverlauf. Während die Verwendung der konfokalen Mikroskopie die Z-Profilierung auf dünne Biofilme von 75 m oder weniger beschränkt, eignet sich die Verwendung der pH-Ratiometrie ideal für die nichtinvasive Untersuchung eines wichtigen Virulenzfaktors in reichübergreifenden Biofilmen.

Einleitung

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Reichübergreifende Biofilme, die sowohl Pilz- als auch Bakterienarten umfassen, sind an mehreren pathologischen Erkrankungen in der Mundhöhle beteiligt. Candida spp. wurden häufig von endodontischen Infektionenisoliert 1 und von parodontalen Läsionen2,3. Bei Schleimhautinfektionen haben Streptokokkenarten aus der Mitis-Gruppe gezeigt, dass sie die Bildung von Pilzbiofilm, die Gewebeinvasion und die Verbreitung in den In-vitro- und Murine-Modellen4,5,6,7verbessern. Am interessantesten ist, mündliche Beförderung von Candida spp. hat sich als mit der Prävalenz von Karies bei Kindernverbunden 8. Wie in Nagetiermodellen gezeigt, erhöht eine symbiotische Beziehung zwischen Streptococcus mutans und Candidas albicans die Produktion von extrazellulären Polysacchariden und führt zur Bildung dickerer und karogener Biofilme9,10.

Unter allen oben genannten Bedingungen, insbesondere frühkindlichen Karies, ist der pH-Wert des Biofilms von Bedeutung für die Krankheitsprogression, und die herausragende Rolle der Biofilmmatrix für die Entwicklung von säureogenen Mikroumgebungen11 erfordert Methoden, die die Untersuchung von pH-Veränderungen innerhalb von bio-kingdomübergreifenden Biofilmen ermöglichen. Es wurden einfache und genaue konfokale Mikroskopie-basierte Ansätze zur Überwachung des pH-Werts in bakteriellen12 undPilz13 Biofilmen entwickelt. Mit dem ratiometrischen Farbstoff C-SNARF-4 und der schwellenbasierten Bildnachbearbeitung kann der extrazelluläre pH in Echtzeit in allen drei Dimensionen eines Biofilms14bestimmt werden. Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Techniken zur mikroskopischen pH-Überwachung in Biofilmen ist die pH-Ratiometrie mit C-SNARF-4 einfach und kostengünstig, da sie nicht die Synthese von Partikeln oder Verbindungen erfordert, die einen Referenzfarbstoff15 oder die Verwendung von Zwei-Photonen-Erregung16enthalten. Die Verwendung von nur einem Farbstoff verhindert Probleme mit der Sondenkomdtalisation, fluoreszierenden Durchblutungen und selektivem Bleichen16,17,18 und ermöglicht gleichzeitig eine zuverlässige Differenzierung zwischen intra- und extrazellulärem pH-Wert. Schließlich erfolgt die Inkubation mit dem Farbstoff nach dem Biofilmwachstum, das es ermöglicht, sowohl Labor- als auch in situ-gewachsene Biofilme zu untersuchen.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Verwendung der pH-Ratiometrie zu erweitern und eine Methode zur Untersuchung von pH-Veränderungen in grenzüberschreitenden Biofilmen bereitzustellen. Als Proof of Concept wird die Methode zur Überwachung des pH-Werts in Biofilmen mit zwei Arten, bestehend aus S. Mutans und C. albicans, die Glukose ausgesetzt sind, verwendet.

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Protokoll

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Das Protokoll zur Speichelsammlung wurde von der Ethikkommission des Kreises Aarhus (M-20100032) überprüft und genehmigt.

1. Kultivierung von cross-kingdom Biofilmen

  1. Wachsen Sie S. mutans DSM 20523 und C. albicans NCPF 3179 auf Blut-Agar-Platten bei 37 °C unter aeroben Bedingungen.
  2. Übertragen Sie einzelne Kolonien jedes Organismus auf Reagenzgläser, die mit 5 ml Hirninfusion (BHI) gefüllt sind. 18 stunden unter aeroben Bedingungen bei 37 °C wachsen.
  3. Zentrifugieren Sie die Nachtkulturen bei 1.200 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in physiologischer Salzlinie wieder auf und passen Sie die OD550 nm auf 0,5 für C. Albicans (ca. 107 Zellen/ml) und S. Mutane (ca. 108 Zellen/ml) an. Verdünnen Sie die Suspension der S. Mutans 1:10 mit steriler physiologischer Salzin (ca. 107 Zellen/ml).
  4. Pipette 50 l sterile Speicheldrüsenlösung, hergestellt nach der Methode de Jong et al.19, in die Brunnen einer optischen bodenförmigen 96-Well-Platte für die Mikroskopie. 30 min bei 37 °C inkubieren. Waschen Sie die Brunnen 3x mit 100 l steriler physiologischer Salzin. Leeren Sie die Brunnen.
  5. Fügen Sie jedem Brunnen 100 L C. albicans Suspension hinzu. Bei 37 °C für 90 min inkubieren. 3x mit steriler physiologischer Salzin waschen.
    HINWEIS:Leeren Sie die Brunnen während des Waschens nicht vollständig. Lassen Sie ein Reservoir von 20 l, um übermäßige Scherkräfte zu vermeiden.
  6. Fügen Sie jedem Brunnen 100 l wärmeinaktiviertes fetales Rinderserum (bei 56 °C für 30 min inaktiviert) hinzu. Bei 37 °C für 2 h inkubieren. 3x mit steriler physiologischer Salzinwaschen waschen. Entleeren Sie die Brunnen, so dass ein Reservoir von 20 L.
  7. Fügen Sie jedem Brunnen 100 L S. Mutans Suspension (in Schritt 1.3) hinzu. Fügen Sie 150 l BHI mit 5% Saccharose hinzu. Bei 37 °C für 24 h oder länger inkubieren. Wenn Sie ältere Biofilme kultivieren, wechseln Sie das Medium täglich in frisches BHI. Am Ende der reichübergreifenden Biofilm-Wachstumsphase 5x mit steriler physiologischer Salzlinie waschen.

2. Ratiometrische pH-Bildgebung

ANMERKUNG:Die ratiometrische pH-Bildgebung muss unmittelbar nach Abschluss des Biofilmwachstums durchgeführt werden.

  1. Verwenden Sie für die ratiometrische pH-Bildgebung ein invertiertes konfokales Laserscanning-Mikroskop mit einer 63-fachen Öl- oder Wasser-Tauchlinse, einer 543 nm-Laserlinie und einem spektralen Bildgebungssystem (d. h. META-Detektor), um die Bildgebung überlappender Fluoreszenzsignale zu ermöglichen. Verwenden Sie einen Inkubator, um die Mikroskopstufe auf 35 °C zu erwärmen.
  2. Stellen Sie den Detektor ein, um die Detektion von grüner Fluoreszenz von 576 bis 608 nm und die gleichzeitige Detektion von roter Fluoreszenz von 629 bis 661 nm zu gewährleisten. Wählen Sie eine geeignete Laserleistung und Verstärkung, um Über- und Unterbelichtung zu vermeiden.
    HINWEIS: Die Belichtung der Bilder ist am besten in Palettenbildern mit falscher Färbung zu sehen.
  3. Stellen Sie die Lochgröße auf 1 Luftige Einheit oder ein optisches Stück von 0,8 m ein. Stellen Sie die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel und die Scangeschwindigkeit auf 2. Wählen Sie einen Zeilendurchschnitt von 2 mit der Option Mittelwert aus.
    HINWEIS:Überprüfen Sie zu Beginn einer Reihe von Experimenten, ob die gewählten Mikroskopeinstellungen einen klaren Kontrast zwischen Bakterienzellen, Pilzzellwänden, Biofilmmatrix und Pilzzytoplasma bieten.
  4. Bereiten Sie 100 l sterile physiologische Salzin mit 0,4% (w/v) Glukose vor, titiert auf pH 7. Bereiten Sie eine Stammlösung von C-SNARF-4 (1 mM in Dimethylsulfoxid) vor. Fügen Sie den Farbstoff auf eine Endkonzentration von 30 m hinzu.
    VORSICHT: Tragen Sie Nitrilhandschuhe, wenn Sie den ratiometrischen Farbstoff handhaben.
  5. Leeren Sie einen der Brunnen mit einem reichübergreifenden Biofilm, so dass ein Reservoir von 20 l. Fügen Sie die sterile Saline enthalten den Glukose und den ratiometrischen Farbstoff. Stellen Sie die 96-Well-Platte auf die Mikroskopstufe und beginnen Sie mit der Bildgebung des Biofilms.
  6. Erfassen Sie Einzelbilder oder Z-Stacks an verschiedenen Stellen des Biofilms. Markieren Sie die X-Y-Position in der Mikroskopsoftware, um pH-Änderungen in bestimmten Sichtfeldern im Laufe der Zeit zu verfolgen. Nehmen Sie in regelmäßigen Abständen Bilder auf, bei dem der Laser ausgeschaltet ist, um den Detektorversatz zu korrigieren.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 2.4–2.6 für die Analyse jedes Biofilms, der in einem anderen Brunnen angebaut wird.

3. Kalibrierung des Ratiometrischen Farbstoffs

HINWEIS: Die Kalibrierung des Farbstoffs und die Anpassung einer Kalibrierkurve kann an einem anderen Tag als der ratiometrischen pH-Bildgebung durchgeführt werden.

  1. Bereiten Sie eine Reihe von 50 mM 2-Morpholinoethansäure (MES) Puffer auf pH 4,0 bis 7,8 in Schritten von 0,2 pH-Einheiten bei 35 °C titriert. Pipette 150 l jeder Pufferlösung in die Brunnen einer optisch-unteren 96-Well-Platte für die Mikroskopie.
  2. Den Farbstoff in die puffergefüllten Brunnen der 96-Well-Platte auf eine Endkonzentration von 30 m geben. Lassen Sie für 5 min ausstellen.
  3. Erwärmen Sie die Mikroskopstufe auf 35 °C. Wählen Sie die gleichen Mikroskopeinstellungen wie für die ratiometrische pH-Bildgebung. Stellen Sie die 96-Well-Platte auf die Mikroskopstufe. Konzentrieren Sie sich auf den Boden der Brunnen. Erfassen Sie zwei Bilder (grüner und roter Kanal) für alle Pufferlösungen, 5 m über der Unterseite des Brunnens. Nehmen Sie in regelmäßigen Abständen Bilder auf, bei dem der Laser ausgeschaltet ist, um den Detektorversatz zu korrigieren.
  4. Führen Sie das Kalibrierungsexperiment in dreifacher Ausführung durch.
  5. Exportieren Sie alle Bilder als TIF-Dateien. Importieren Sie sie in eine dedizierte Bildanalysesoftware (z. B. ImageJ20). Subtrahieren Sie die mit dem ausgeschalteten Laser aufgenommenen Bilder von den jeweiligen Bildern der Pufferlösungen, indem Sie auf Prozess | Bildrechner | Subtrahieren).
    ANMERKUNG: Schneiden Sie die Bilder ggf. zu, um Artefakte an den Bildrändern zu entfernen, indem Sie eine rechteckige Auswahl mit Bild | Ernte.
  6. Teilen Sie die Bilder des grünen Kanals durch die Bilder des roten Kanals und berechnen Sie die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten in den resultierenden Bildern, indem Sie auf Analysieren | Histogramm.
  7. Zeichnen Sie aus den dreifachen Experimenten die durchschnittlichen grün-roten Verhältnisse gegen den pH-Wert. Verwenden Sie eine spezielle Software, um eine Funktion an die Kalibrierdaten anzupassen (z. B. MyCurveFit).

4. Digitale Bildanalyse

HINWEIS:Digitale Bildanalyse kann jederzeit nach der Kalibrierung der Farb- und ratiometrischen pH-Bildgebung durchgeführt werden.

  1. Speichern Sie die Biofilmbilder mit grünem und rotem Kanal in separaten Ordnern und benennen Sie beide Dateireihen mit fortlaufenden Nummern um (z. B. GREEN_0001). Importieren Sie die Bilder in eine dedizierte Bildanalysesoftware (d. h. ImageJ). Klicken Sie auf Analysieren | Histogramm zur Bestimmung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität in den Bildern, die mit dem Laser ausgenommen gemacht werden, und Subtraktion des Wertes von den Biofilmbildern durch Klicken auf Prozess | Mathe | Subtrahierenvon .
  2. Importieren Sie die 2 Bildserien in eine dedizierte Bildanalysesoftware (d. h. daime21). Führen Sie eine schwellenwertbasierte Segmentierung der Roten Kanalbilder (Segment | Automatische Segmentierung | Benutzerdefinierter Schwellenwert). Stellen Sie die "niedrige" Schwelle über der Fluoreszenzintensität des Pilzzytoplasmas und die "hohe" Schwelle unterhalb der Intensität der Pilzzellwände und der Bakterien ein.
    HINWEIS:Wenn entsprechende Schwellenwerte ausgewählt wurden, werden nur extrazelluläre Bereiche als Objekte erkannt.
  3. Übertragen Sie die Objektebene der segmentierten Bildserie in die Grüne Kanal-Bildreihe. Klicken Sie dazu auf Segment | Objektebene übertragen.
    ANMERKUNG: Wenn der Kontrast zwischen extrazellulären Bereichen und Pilzzytoplasma in den einzelnen Farbkanälen zu schwach ist, fügen Sie die Grüne Kanalbildreihe der Roten Kanalserie vor der Segmentierung hinzu, indem Sie auf Bearbeiten | Bildrechner | Addition. Führen Sie die Unterabschnittsserie wie unter 4.2 beschriebene Segmentierung durch, und übertragen Sie die Objektebene der segmentierten Bildserie auf die grüne und die rote Kanalbildreihe.
  4. Verwenden Sie den Objekteditor, um Nicht-Objektpixel in der Bildreihe des roten und grünen Kanals zu löschen (Visualizer | Objekteditor | In allen Bildern | Nicht-Objektpixel löschen). Nun werden die Biofilmbilder sowohl aus Bakterien- als auch aus Pilzzellen gelöscht. Exportieren Sie die verarbeiteten Bildserien als TIF-Dateien.
  5. Importieren Sie beide Bildserien in ImageJ. ImageJ weist allen Nicht-Objektpixeln eine Intensität von 0 zu. Entfernen Sie diese Pixel, indem Sie die rote Bildreihe (R1) durch sich selbst dividieren (Prozess | Bildrechner | Bild 1: R1; Bedienung: Teilen; Bild 2: R1) und Multiplikation der resultierenden Bildserie (R2) mit der ursprünglichen roten Bildserie (Prozess | Bildrechner | Bild 1: R1; Operation: Multiplizieren; Bild 2: R2). Es wird eine dritte Bildreihe (R3) erstellt, die mit R1 identisch ist, mit Ausnahme der Tatsache, dass NaN allen Pixeln mit einer Intensität von 0 in R1 zugewiesen ist. Gehen Sie genauso mit der grünen Bildserie vor.
  6. Verwenden Sie den Filter 'Mean' (Prozess | Filter | Mittelwert | Radius | 1 Pixel) auf der roten und grünen Kanalbildserie, um Detektorgeräusche zu kompensieren. Dividieren Sie die grüne Kanal-Bildserie durch die Rote-Kanal-Bildreihe (Prozess | Bildrechner | Bild 1: G3; Bedienung: Teilen; Bild 2: R3). Die resultierende Bildreihe (G3/R3) zeigt das grün-rote Verhältnis für alle Objektpixel an.
  7. Berechnen Sie das Durchschnittsverhältnis für jedes Bild(Analysieren | Histogramm). Falsche Färbung anwenden, um die Verhältnisse in den Bildern besser visuell zu reist (Bild | Nachschlagenstabellen). Konvertieren Sie die grün-roten Verhältnisse in pH-Werte, wobei die unter 3,6 angepasste Funktion verwendet wird.

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Ergebnisse

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Nach 24 h und 48 h entwickelten sich in den Brunnenplatten robuste, reichübergreifende Biofilme. C. Albicans zeigten unterschiedliche Grade des fadenförmigen Wachstums, und S. Mutane bildeten dichte Cluster von bis zu 35 m Höhe. Einzelne Zellen und Ketten von S. Mutanen, gruppiert um Pilzhyphen, und große interzelluläre Räume zeigten das Vorhandensein einer voluminösen Matrix an (Abbildung S1).

Die Kalibrierung des ratiometrischen Farbstoffs ergibt e...

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Diskussion

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Verschiedene Protokolle für den Anbau von königreichübergreifenden Biofilmen mit C. albicans und Streptococcus spp. wurdenzuvor9,22,23,24,25beschrieben. Das derzeitige Setup konzentriert sich jedoch auf einfache Wachstumsbedingungen, einen Zeitplan, der mit regulären Arbeitstagen kompatibel ist, eine ausgewogene Artenzusammensetzung ...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Für den hervorragenden technischen Support wurden Anette Aakjér Thomsen und Javier E. Garcia ausgezeichnet. Die Autoren danken Rubens Spin-Neto für fruchtbare Diskussionen zur Bildanalyse.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Blut-Agar-PlattenStatens Serum Institut677
Hirn-Herz-InfusionOxoidCM1135
Hirn-Herz-Infusion + 5 % SaccharoseBDH Laborbedarf10274
Candida albicansNationale Sammlung pathogener PilzeNCPF 3179
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichG8270
daime: Digitale Bildanalyse in der mikrobiellen ÖkologieUniversitä t WienN/AFreeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
DimethylsulfoxidLife TechnologiesD12345
Fötales RinderserumGibco Life Technologies10270
GS-6R gekühlte ZentrifugeBeckmanN/A
ImageJNational Institutes of HealthN/AFreeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
JavaOracleN/AFreeware notwendig zum Ausführen von ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well SchwarzIbidi89626
MyCurveFitMyAssays Ltd.N/A
2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)-PufferBioworld700728
PHM210 pH-MeterRadiometer
63x Öl-ImmersionsobjektivZeissN/ANA=1,4
SNARF®-4F 5-(und-6)-CarbonsäureLife TechnologiesS23920
Sterile physiologische KochsalzlösungVWR6404
Streptococcus mutansDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenDSM 20523
Vis-Spektralphotometer V-3000PCVWRN/A
XL InkubatorPeCONN/A
Zeiss LSM 510 METAZeissN/A
Analyseplan-Apochromat

Referenzen

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