Das Protokoll beschreibt den Anbau von königreichübergreifenden Biofilmen, die aus Candida-Albicans und Streptococcus-Mutanen bestehen, und stellt eine konfokale Mikroskopie-basierte Methode zur Überwachung des extrazellulären pH-Werts in diesen Biofilmen dar.
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Methodenartikel
Überwachung des extrazellulären pH-Werts in cross-kingdom Biofilmen mit Konfokalmikroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Reichübergreifende Biofilme, die aus Pilz- und Bakterienzellen bestehen, sind an einer Vielzahl von Oralerkrankungen beteiligt, wie endodontische Infektionen, Parodontitis, Schleimhautinfektionen und vor allem frühkindliche Karies. Unter all diesen Bedingungen wirkt sich der pH-Wert in der Biofilmmatrix auf Mikroben-Wirt-Wechselwirkungen und damit auf das Krankheitsverlauf aus. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine konfokale Mikroskopie-basierte Methode zur Überwachung der pH-Dynamik innerhalb königreichübergreifender Biofilme, die Candida-Albicans und Streptococcus-Mutane umfassen. Das pH-abhängige Dual-Emissions-Spektrum und die Färbeeigenschaften der ratiometrischen Sonde C-SNARF-4 werden genutzt, um pH-Tropfen in extrazellulären Bereichen der Biofilme zu bestimmen. Die Verwendung der pH-Ratiometrie mit der Sonde erfordert eine sorgfältige Auswahl der bildgebenden Parameter, eine gründliche Kalibrierung des Farbstoffs und eine sorgfältige, schwellenbasierte Nachbearbeitung der Bilddaten. Bei richtiger Verwendung ermöglicht die Technik die schnelle Beurteilung des extrazellulären pH-Werts in verschiedenen Bereichen eines Biofilms und damit die Überwachung von horizontalen und vertikalen pH-Gradienten im Zeitverlauf. Während die Verwendung der konfokalen Mikroskopie die Z-Profilierung auf dünne Biofilme von 75 m oder weniger beschränkt, eignet sich die Verwendung der pH-Ratiometrie ideal für die nichtinvasive Untersuchung eines wichtigen Virulenzfaktors in reichübergreifenden Biofilmen.
Einleitung
Reichübergreifende Biofilme, die sowohl Pilz- als auch Bakterienarten umfassen, sind an mehreren pathologischen Erkrankungen in der Mundhöhle beteiligt. Candida spp. wurden häufig von endodontischen Infektionenisoliert 1 und von parodontalen Läsionen2,3. Bei Schleimhautinfektionen haben Streptokokkenarten aus der Mitis-Gruppe gezeigt, dass sie die Bildung von Pilzbiofilm, die Gewebeinvasion und die Verbreitung in den In-vitro- und Murine-Modellen4,5,6,7
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Protokoll
Das Protokoll zur Speichelsammlung wurde von der Ethikkommission des Kreises Aarhus (M-20100032) überprüft und genehmigt.
1. Kultivierung von cross-kingdom Biofilmen
- Wachsen Sie S. mutans DSM 20523 und C. albicans NCPF 3179 auf Blut-Agar-Platten bei 37 °C unter aeroben Bedingungen.
- Übertragen Sie einzelne Kolonien jedes Organismus auf Reagenzgläser, die mit 5 ml Hirninfusion (BHI) gefüllt sind. 18 stunden unter aeroben Bedingungen bei 37 °C wachsen.
- Zentrifugieren Sie die Nachtkulturen bei 1.200 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in physiologischer Salzl....
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Ergebnisse
Nach 24 h und 48 h entwickelten sich in den Brunnenplatten robuste, reichübergreifende Biofilme. C. Albicans zeigten unterschiedliche Grade des fadenförmigen Wachstums, und S. Mutane bildeten dichte Cluster von bis zu 35 m Höhe. Einzelne Zellen und Ketten von S. Mutanen, gruppiert um Pilzhyphen, und große interzelluläre Räume zeigten das Vorhandensein einer voluminösen Matrix an (Abbildung S1).
Die Kalibrierung des ratiometrischen Farbstoffs ergibt e.......
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Diskussion
Verschiedene Protokolle für den Anbau von königreichübergreifenden Biofilmen mit C. albicans und Streptococcus spp. wurdenzuvor9,22,23,24,25beschrieben. Das derzeitige Setup konzentriert sich jedoch auf einfache Wachstumsbedingungen, einen Zeitplan, der mit regulären Arbeitstagen kompatibel ist, eine ausgewogene Artenzusammensetzung .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Für den hervorragenden technischen Support wurden Anette Aakjér Thomsen und Javier E. Garcia ausgezeichnet. Die Autoren danken Rubens Spin-Neto für fruchtbare Diskussionen zur Bildanalyse.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Blut-Agar-Platten | Statens Serum Institut | 677 | |
| Hirn-Herz-Infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Hirn-Herz-Infusion + 5 % Saccharose | BDH Laborbedarf | 10274 | |
| Candida albicans | Nationale Sammlung pathogener Pilze | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glukose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: Digitale Bildanalyse in der mikrobiellen Ökologie | Universitä t Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethylsulfoxid | Life Technologies | D12345 | |
| Fötales Rinderserum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| GS-6R gekühlte Zentrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware notwendig zum Ausführen von ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Schwarz | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)-Puffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-Meter | Radiometer | ||
| 63x Öl-Immersionsobjektiv | Zeiss | N/A | NA=1,4 |
| SNARF®-4F 5-(und-6)-Carbonsäure | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiologische Kochsalzlösung | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-Spektralphotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Inkubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
Referenzen
- Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
- Matic Petrovic, S., et al. Subgin....
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Nachdrucke und Genehmigungen
