Methodenartikel

Charakterisierung der Auswirkungen von Migrastatischen Inhibitoren auf die 3D-Tumorsphäroid-Invasion durch hochauflösende Konfokalmikroskopie

6.4K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/60273

⸱

16. September 2019

 ,  , 
1School of Applied Sciences, University of Huddersfield, 2Laboratory of Radiotherapy and Experimental Radiation Oncology, Humbertus Wald Tumorzentrum, University Cancer Center Hamburg, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Auswirkungen von migrastatischen Inhibitoren auf die Gliom-Krebszellmigration in dreidimensionalen (3D) Invasions-Assays mit einem Histon-Deacetylase-Inhibitor (HDAC) sind durch eine hochauflösende konfokale Mikroskopie gekennzeichnet.

Zusammenfassung

Die Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln in der Krebsforschung basiert zunehmend auf Medikamentenscreens im 3D-Format. Neuartige Inhibitoren, die auf das wandernde und invasive Potenzial von Krebszellen und damit auf die metastasierende Ausbreitung von Krankheiten abzielen, werden entdeckt und als ergänzende Behandlungen bei hochinvasiven Krebsarten wie Gliomen betrachtet. Daher ist die Generierung von Daten erforderlich, die die detaillierte Analyse von Zellen in einer 3D-Umgebung nach Zugabe eines Medikaments ermöglichen. Die hier beschriebene Methodik, die Sphäroid-Invasions-Assays mit hochauflösender Bilderfassung und Datenanalyse mittels konfokaler Laserscanmikroskopie (CLSM) kombiniert, ermöglichte eine detaillierte Charakterisierung der Auswirkungen des potenziellen Anti-Migrations-Inhibitors. MI-192 über Gliomzellen. Sphäroide wurden aus Zelllinien für Invasionstests in niedrig haftenden 96-Well-Platten erzeugt und dann für die CLSM-Analyse vorbereitet. Der beschriebene Workflow wurde aufgrund der Einfachheit und Reproduzierbarkeit gegenüber anderen häufig verwendeten Sphäroid-Erzeugungstechniken bevorzugt. In Kombination mit der verbesserten Bildauflösung, die durch konfokale Mikroskopie im Vergleich zu herkömmlichen Weitfeldansätzen erreicht wurde, ermöglichte dies die Identifizierung und Analyse unterschiedlicher morphologischer Veränderungen in Wanderzellen in einer 3D-Umgebung, Behandlung mit dem migrastatischen Medikament MI-192.

Einleitung

Dreidimensionale Sphäroid-Technologien für die präklinische Arzneimittelentdeckung und die Entwicklung potenzieller Krebsmedikamente werden zunehmend gegenüber herkömmlichen Arzneimittelscreens bevorzugt; daher gibt es mehr Entwicklung von migrastatischen — Migration und Invasionsprävention — Drogen. Die Gründe für diese Entwicklungen in der Krebsbehandlung sind klar: 3D-Sphäroid-Assays stellen einen realistischeren Ansatz für das Screening potenzieller Krebsmedikamente dar, da sie die 3D-Tumorarchitektur getreuer imitieren als Zellmonolayer-Kulturen, Wirkstoff-Tumor-Wechselwirkungen (Kinetik) genauer rekapitulieren und die Charakterisierung der Arzneimittelaktivität in einer tumorbedingten Umgebung ermöglichen. Darüber hinaus unterstützt der Anstieg der Resistenz gegen chemotoxische Medikamente bei vielen Krebsarten und die hohe Sterblichkeitsrate bei Krebspatienten aufgrund von Metastasen, die durch die Fähigkeit von Krebszellen potenziert werden, an entfernte Tumorstellen zu wandern, die Einbeziehung von Chemotherapeutika Ausrichtung auf das Migrationspotenzial von Krebszellen als adjuvante Behandlung in zukünftigen klinischen Krebsstudien1. Dies gilt insbesondere für hochinvasive Krebsarten wie hochgradige Glioblastome (GBM). GBM-Management umfasst Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie. Doch selbst bei einer Kombinationsbehandlung fallen die meisten Patienten innerhalb eines Jahres nach der Erstdiagnose mit einem medianen Überleben von 11-15 Monaten2,3zurück. In den letzten Jahren wurden enorme Fortschritte auf dem Gebiet der 3D-Technologie erzielt: Rotationssysteme, mikrofabrizierte Strukturen und 3D-Gerüste sowie andere Einzelprüfungen werden kontinuierlich verbessert, um Routinetests im großen Maßstab zu ermöglichen4, 5,6,7. Die ergebnisseweisen aus diesen Assays müssen jedoch sinnvoll analysiert werden, da die Dateninterpretation oft durch Versuche behindert wird, 3D-generierte Daten mit 2D-Bildanalysesystemen zu analysieren.

Obwohl die Bildaufnahmegeschwindigkeit und die reduzierte Fototoxizität bevorzugt sind, bleiben die meisten Breitfeldsysteme durch Auflösung8begrenzt. Abgesehen von Datenauslesungen im Zusammenhang mit der Wirksamkeit von Arzneimitteln gehen detaillierte Auswirkungen der Arzneimittelwirkung auf 3D-Zellstrukturen wandernder Zellen unweigerlich verloren, wenn sie mit einem Weitfeldsystem abgebildet werden. Umgekehrt erfasst die konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) hochwertige, optisch geschnittene Bilder, die in der 3D-Nacherfassung mit Computersoftware rekonstruiert und gerendert werden können. So ist CLSM leicht auf die Abbildung komplexer 3D-Zellstrukturen anwendbar und ermöglicht so die Abfrage der Auswirkungen von anti-migrastatischen Inhibitoren auf 3D-Strukturen und eingehende Analysen von Zellmigrationsmechanismen. Dies wird zweifellos als Richtschnur für die zukünftige Entwicklung migrastatischer Arzneimittel dienen. Hier wird ein kombinierter Workflow aus Sphäroiderzeugung, medikamentöser Behandlung, Färbeprotokoll und Charakterisierung durch hochauflösende konfokale Mikroskopie beschrieben.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Erzeugung von Zellsphäriden

Tag 1

  1. Bereiten Sie das Standardkulturmedium entsprechend der zu untersuchenden Zellenlinie vor.
  2. Führen Sie alle gewebekulturassoziierten Schritte in einer Gewebekulturhaube mit sterilen Handhabungstechniken durch.
  3. Versuchen und zählen Sie Krebszellen. Verwenden Sie 20 ml Zellaufhängung pro Platte. Bewahren Sie die Zellsuspensionen in klar beschrifteten sterilen Universalröhren auf.
  4. Fügen Sie jedem Brunnen eine vordefinierte Anzahl von Zellen hinzu. Sowohl die anfängliche Anzahl der Zellen als auch die erforderliche endgültige Sphäroidgröße hängen von der Proliferationsrate der untersuchten Zelllinie ab.
    HINWEIS: Für etablierte Gliom-Zelllinien wie U251 und KNS429erzeugen10, 5 x 103 Zellen/ml nach 4 Tagen Inkubation ein mikroskopisch sichtbares Sphäroid (200 oder 800 m).
  5. Setzen Sie die Zellen in Universalröhren durch sanfte Inversion wieder auf, um Zellverklumpungen zu vermeiden. Pipette 200 l der Zellsuspension in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte. Wenn nicht alle Brunnen benötigt werden, ist es ratsam, jedem leeren Brunnen 200 l 1x PBS hinzuzufügen, um Verdunstung zu vermeiden.
  6. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator wie gewohnt bei 37 °C.
    HINWEIS: Zelllinien wie Gliom-Krebszelllinien bilden Sphäroide innerhalb von 24 h. Lassen Sie 3D-Zellarchitektur durch Inkubation des Sphäroids für 72 h entstehen.

Tag 2

  1. Überprüfen Sie Zellen durch Hellfeldmikroskopie nach 24 h. Je nach Zelllinie können Zellen ein Sphäroid gebildet haben, das im Boden des Brunnens nachweisbar ist.
    HINWEIS: Etablierte Gliom-Krebszelllinien bilden leicht Sphäroide innerhalb von 24 h. Patienten-abgeleitete Gliom-Krebszelllinien können bis zu 1-2 Wochen dauern.

2. Kollagen Invasion Assay

Tag 3

  1. Kollagen, 5x Kulturmedium, 1 M NaOH und eine 20 ml Tube auf Eis legen.
  2. Sorgfältig und langsam 10,4 ml kaltes Kollagen in ein gekühltes Kulturrohr geben. Vermeiden Sie Blasen. Diese Menge an Kollagen reicht für eine 96-Well-Platte. Upscaling ist möglich, aber es wird empfohlen, dass jeweils ein 20 ml Rohr pro Platte vorbereitet wird.
  3. 1,52 ml kaltes steriles 5x Kulturmedium vorsichtig hinzufügen. Vermeiden Sie Blasen.
  4. Kurz vor Gebrauch 72 l kaltsteril 1 M NaOH vorsichtig hinzufügen. Halten Sie die Lösung auf Eis.
  5. Mischen Sie sanft durch Pipettieren. Vermeiden Sie Blasen. Effizientes Mischen führt zu einem Farbwechsel (von Rot zu Orange-Rot (pH 7.4) im Medium. Lassen Sie die Mischung auf Eis, bis sie verwendet wird.
  6. Entscheidender Schritt: Entfernen Sie 190 L Überstand aus der 96-Well-Platte, die am ersten Tag vorbereitet wurde. Achten Sie sehr darauf, die Sphäroide, die sich im Boden des Brunnens gebildet haben, nicht zu stören. Verwenden Sie die Pipette in einem Winkel zur Seite, nicht in die Mitte, des Brunnens.
  7. Fügen Sie jedem Brunnen vorsichtig 100 l der Kollagenmischung hinzu. Um eine Sphäroidstörung zu vermeiden, pipette die Mischung auf der Seite des Brunnens. Vermeiden Sie Blasen. Bewahren Sie die verbleibende Kollagenmischung im 20 ml-Rohr bei Raumtemperatur auf, um die Polymerisation zu bewerten.
  8. Inkubationsplatte im Inkubator für mindestens 10 min, damit das Kollagen polymerisieren kann. Als Richtschnur, wenn das übrig gebliebene Kollagen gesetzt hat, halbfest und schwammartig geworden ist, sind die Sphäroide bereit, mit Inhibitor behandelt zu werden.
  9. Fügen Sie die Medikamente oder Inhibitoren mit 2-facher Konzentration zum Kulturmedium hinzu. Fügen Sie das Medium sanft zu jedem Brunnen hinzu (100 l pro Brunnen). Auch hier pipette das Medium auf der Seite des Brunnens, um Sphäroidstörungen zu vermeiden.
  10. Beobachten und abbilden Sie jedes Sphäroid durch Hellfeldmikroskopie zu Zeiten T = 0 h, 24 h, 48 h und 72 h, um die Drogenaktivität zu bewerten. Dann geben Sie die Platte zum Inkubator zurück.
    HINWEIS: Je nach invasivem Verhalten der Zelllinie kann ab 24 H eine Migration vom ursprünglichen Sphäroidkern beobachtet werden.

3. Herstellung von Kollagen Embedded Spheroids und Migratory Cells für die konfokale Mikroskopie

  1. Legen Sie die Platte in eine Gewebekulturhaube und entfernen Sie vorsichtig den Überstand (200 l). Achten Sie auch hier darauf, das Sphäroid nicht zu stören und das Kollagen nicht zu berühren, da dies den Kollagenstecker stören kann.
  2. Ersetzen Sie den Überstand durch 100 l 1x PBS. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3x.
  3. Entfernen Sie die Endwäsche und ersetzen Sie sie durch 4% Formaldehyd in 1x PBS (100 l pro Brunnen).
    ACHTUNG: Formaldehyd ist ein potentielles Karzinogen. Behandeln Sie mit Sorgfalt in Übereinstimmung mit Dengesundheits- und Sicherheitsrichtlinien.
  4. Die 96-Well-Platte auf eine Laborbank legen, mit Folie abdecken und 24 h bei Raumtemperatur abstellen.
  5. Entfernen Sie das Formaldehyd vorsichtig und ersetzen Sie es durch 1x PBS. Wiederholen Sie diese 1x PBS Waschen 3x.
  6. Bereiten Sie 0.1% Triton X-100 in 1x PBS vor. Entfernen Sie die 1x PBS-Waschanlage und ersetzen Sie sie durch 100 l der Triton X-100-Lösung. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. In der Zwischenzeit die Sperrlösung mit 1x PBS und 0,05% Magermilchpulver vorbereiten und gründlich vermischen.
  7. Entfernen Sie Triton X-100 und waschen Sie 3x mit 1x PBS. Fügen Sie jedem Brunnen 100 l Blockierlösung hinzu und brüten Sie 15 min.
  8. Verdünnen Sie den erforderlichen Primärantikörper im Sperrpuffer bei der vorgegebenen Konzentration. Verwenden Sie hier Anti-Maus-IgG-Acetylaced-Tubulin-Antikörper (1:100).
  9. Zentrifugieren Sie den primären Antikörper-Blockierenden Puffermix für 5 min bei 15.682 x g. Entfernen Sie vorsichtig die Blockierlösung und fügen Sie den Überstand (25 x 50 l) zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 1 h.
  10. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie 3x mit 1x PBS (100 l pro Brunnen).
  11. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper im Sperrpuffer in der empfohlenen oder vorgegebenen Konzentration zusätzlich zu allen zusätzlichen fluoreszierenden Flecken. Verwenden Sie hier 1:500 Anti-Maus-Fluorophor-488 konjugierten Antikörper, Phalloidin-594 (1:500) für die Aktinfärbung und den DNA-Fleck (DAPI).
  12. Wiederum zentrifugieren Sie die sekundäre Antikörperlösung für 5 min bei 13.000 U/min.
  13. Entfernen Sie die Blockierlösung aus jedem Brunnen, und fügen Sie 25 x 50 L des sekundären Antikörpers/Phalloidin/DAPI-Mixes hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln für 1,5 h bei Raumtemperatur.
  14. Sekundäre Antikörper-Farbstoff-Lösung entfernen und 3x mit 1x PBS (100 l pro Brunnen) waschen.
  15. Heben Sie einzelne Kollagenstecker vorsichtig durch Absaugen mit einer Kunststoffpipette (200 l) auf die Mitte eines hochwertigen Klarglasschlittens.
  16. Fügen Sie einen Tropfen eines geeigneten Mountants auf den Kollagenstecker, um sicherzustellen, dass der Stecker vollständig abgedeckt ist. Vermeiden Sie Blasen.
  17. Tragen Sie den Deckelder der optimalen Dicke für das Mikroskopobjektiv auf, das für die Bildgebung verwendet wird und über Nacht eingestellt werden kann. Bewahren Sie die Dias bei Raumtemperatur im Dunkeln auf.

4. Fluoreszenzmikroskopie

  1. Erfassen Sie fluoreszierende Bilder mit einem geeigneten konfokalen Mikroskop.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die dreidimensionale Sphäroidtechnologie fördert das Verständnis von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Tumoren, da sie repräsentativer für die krebsspezifische Umgebung ist. Die Erzeugung von Sphäroiden kann auf verschiedene Weise erreicht werden; in diesem Protokoll wurden 96-Well-Platten verwendet. Nach der Prüfung mehrerer Produkte verschiedener Hersteller wurden die hier verwendeten Platten ausgewählt, da sie hinsichtlich erfolgreicher Sphäroidproduktion und Homogenität konst...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Eine neue Möglichkeit, Krebszellsphäride zur Identifizierung der migrastatischen Arzneimittelaktivität mittels hochauflösender konfokaler Mikroskopie zu erstellen, wird beschrieben. Die Verwendung von niedrig haftenden Platten gegenüber anderen Techniken, wie hängende Tropfen15, hat ein Mittel zur Erzeugung reproduzierbarer und gleichmäßiger Sphäroide für den Einsatz in der Kollagenmigration und Invasion Assays erleichtert. Die kritischen Punkte in diesem Protokoll sind die Entfernung des Wachstum...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken Professor Chris Jones für den Beitrag zur KNS42-Zelllinie. Das Konfokalmikroskop Zeiss LSM880 mit AiryScan ist Teil des Huddersfield Innovation and Incubation Project (HIIP), das durch den Wachstumsdeal der Leeds City Region Enterprise Partnership (LEP) finanziert wird. Bild bildweise 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, microscopy@zeiss.com.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kollagen I, Rattenschwanz, 100 mgCorning354236für den Gliom-Invasions-Assay; dieser wird von vielen Händlern/Herstellern angeboten und muss sowohl für die Art des beabsichtigten Assays als auch für die verwendeten Zelllinien bestimmt werden. Für Gliom-Krebszelllinien ist Kollagen-Rattenschwanz Typ 1 (z. B. Corning) die bevorzugte Wahl. Kollagen sollte bei 4 & Grad gelagert werden; C, im Dunkeln, bis zur Bedarf. Es ist nicht ratsam, Kollagen aus verschiedenen Chargen zu mischen, da dies die Konsistenz des polymerisierten Kollagens beeinträchtigen kann.    
Deckgläserverschiedeneverschiedenefür die Mikroskopie-Bildgebung
DMEM-PulverSigmaD5648in 5-facher Konzentration für Kollagenlösung für den Gliom-Invasions-Assay benötigt;   Es kann in Pulverform erworben werden, in doppelt destilliertem Wasser aufbereitet und je nach endgültiger Zusammensetzung des Nährsubstrats mit den erforderlichen Zusätzen ergänzt werden. Die komplette 5x-Lösung sollte durch ein Spritzenfiltersystem (0,22 μ m) vor Gebrauch.
Fötales KälberserumSigmaF7524-500MLwird für die Zellkultur von Gliomzelllinien benötigt
Glasobjektträgerverschiedeneverschiedene für die Mikroskopie Bildgebung
DMEM mit hohem GlukosegehaltGibco41965062für die Zellkultur von Gliomzelllinien benötigt
InhibitorTocrisverschiedeneverschieden - nach Versuchsdesign; Inhibitoren können von Herstellern wie Selleckchem und Tocris bezogen werden. Diese Hersteller bieten eine detaillierte Beschreibung der Inhibitoreigenschaften, Links zu zugehörigen Referenzen und Vorschläge für Arbeitskonzentrationen. Wie alle Inhibitoren können sie potenziell toxisch sein und sollten gemäß den Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien gehandhabt werden. Inhibitoren werden als Stammlösungen hergestellt, wie vom Hersteller empfohlen. Als Beispiel haben wir den migrastatischen Inhibitor MI-192 verwendet, um den Einsatz solcher Inhibitoren zu demonstrieren. Wir haben auf diese Weise eine Reihe von migrastatischen Hemmern mit vergleichbaren Ergebnissen getestet.
Eindeckmittelverschiedenes fürdie mikroskopische Bildgebung
NaOH (1 M)verschiedene VerschiedeneNaOH können entweder in der erforderlichen Molarität gekauft oder in fester Form hergestellt werden. Die vorbereitete Lösung sollte mit einem Spritzenfiltersystem filtriert werden. Ein M NaOH ist korrosiv und bei der Herstellung der Lösung ist Vorsicht geboten.
Paraformaldehyd verschiedeneverschiedene zur Fixierung von Sphäroiden und Zellen; machen 4% aus, Vorsicht Gesundheitsgefahr, stellen Sie sicher, dass Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften eingehalten werden für Kollagenlösung für Invasionsassay
Pastetten (graduierte Pipette, 3 mL)verschiedeneverschiedenefür Invasionsassay, Lösungsentfernung
PBS, steril für GewebekulturSigmaD1408-500ML   wird für die Zellkultur von Gliomzelllinien und Waschungen zum Färben benötigt
Pen/Streptokokken (Antibiotika)SigmaP4333wird für die Zellkultur von Gliom-Zelllinien benötigt
Primärantikörper, Sekundärantikörper, DAPI, PhalloidinverschiedeneverschiedeneEs gibt viele Hersteller für diese Reagenzien, für sekundär markierte Antikörper empfehlen wir Alexa Fluor (Molekulare Sonden). Hier verwendeten wir als Primärantikörper Maus anti-acetylierte Tubulin-Antikörper (1/100, Abcam). Als Sekundärantikörper verwendeten wir 1/500 Anti-Maus-Alexa Fluor 488 konjugierte Antikörper, Molecular Probes. Für die Kernfärbung haben wir DAPI (viele Hersteller) und die Aktinfärbung Phalloidin (viele Hersteller) verwendet, die beide in einer empfohlenen Verdünnung von 1/500 verwendet werden.
NatriumbicarbonatSigmaS5761wird für die Kollagenlösung für den Gliom-Invasions-Assay bei 5-facher Konzentration
NatriumpyruvatSigmaP5280wird für die Kollagenlösung für den Gliom-Invasions-Assay bei 5-facher Konzentration
TrypsinSigmaT4049für die Trypsinisierung
Platten mit extrem niedrigem AttachmentSigma/NuncCLS7007-24EAfür den Gliominvasions-Assay; Es ist eine Platte mit geringer Adhärentanz erforderlich, wobei 96-Well-Platten bevorzugt werden, um ein groß angelegtes Screening der zu untersuchenden Verbindungen zu ermöglichen. Es gibt mehrere Platten mit geringer Adhärenz, die im Handel erhältlich sind. Es empfiehlt sich, eine Vielzahl von Platten auf eine optimale Sphäroidbildung zu testen. Unserer Erfahrung nach eignet sich Costar Ultra Low Cluster mit Deckel und rundem Boden am besten für die Erzeugung von Sphäroiden aus Gliomkrebszellen in Bezug auf 100% Sphäroidbildung und Reproduzierbarkeit. Diese Platten wurden in unserem Labor auch erfolgreich für die Erzeugung von Gliom-Sphäroiden aus patientengewonnenem Material, Blasen- und Eierstockkrebszellen eingesetzt. Darüber hinaus können Stamm- oder Vorläufer-Neurosphären in diesen Platten verwendet werden, um die Erzeugung standardisierter Neurosphären-Sphäroide zu erleichtern
Stripettes (serologische Pipetten, steril, 5 mL und 10 mL),verschiedene z. B. CostarCLS4488-50; CLS4487-50für Gewebekulturen und Kollagenpräparation
Verschiedene Mehrkanal (50 - 250 μ L) und Einkanalpipetten (10 μ L, 50 μ L, 200 μ L 1 mL)verschiedeneverschiedenefür die Handhabung von Zellen und Sphäroiden
Weitfeldmikroskopieverschiedene verschiedenefür die Beobachtung der Sphäroiderzeugung und der Sphäroid-Bildgebung; hier wurden Weitfeld-Fluoreszenzbilder mit einem EVOS FL Cell Imaging System (Thermo Fisher Scientific) aufgenommen.Zeiss
LSM 880 CLSM ausgestattet mit einem Plan Apochromat 63x 1,4 NA ÖlobjektivZeissZitat des HerstellersKonfokale Bilder wurden mit einem Zeiss LSM 880 CLSM aufgenommen, der mit einem Plan Apochromat 63x 1,4 NA Ölobjektiv ausgestattet war. Diodenlaser mit 405 nm, 458/488/514 nm Argon Multiline und HeNe 594 nm wurden verwendet, um Phalloidin 594, Alexa Fluor 488 bzw. DAPI anzuregen. Für jedes Bild wurde ein einzelner repräsentativer optischer Ausschnitt aufgenommen, wobei alle Einstellungen, sowohl vor als auch nach der Bildaufnahme, zu Vergleichszwecken beibehalten wurden. Alle Bilder wurden anschließend mit der zugehörigen Imaging-Software Zen und Adobe Photoshop bearbeitet.
benötigt benötigt

Referenzen

  1. Gandalovičová, A., et al. Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges. Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).
  2. Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18, 1062(2016).
  3. Foreman, P. M., et al. Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma. Neurotherapeutics. 14, 333(2017).
  4. Rodrigues, T., et al. Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling. Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).
  5. Sirenko, O., et al. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).
  6. Wu, Q., et al. Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening. Biomedical Microdevices. 20, 82(2018).
  7. Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform. Scientific Reports. 8, 253(2018).
  8. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
  9. Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. Human Tumor Cells in Vitro. , Springer US. Boston. 175-206 (1975).
  10. Takeshita, I., et al. Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42. Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).
  11. Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration. Journal of Cell Science. 132, (2019).
  12. Bacon, T., et al. Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation. Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).
  13. Jackman, L., et al. Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach. Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).
  14. Bhandal, K., et al. Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192. Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).
  15. Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).
  16. Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays. Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).
  17. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  18. Härmä, V., et al. Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis. PLOS ONE. 9 (5), e96426(2014).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

3D Tumorsph roidSph roid InvasionsassayKollagen PolymerisationProtokoll zur MedikamentenbehandlungAnalyse der ZellmorphologieMikrotubuli AcetylierungGliom Zelllinienhochaufl sende Bildgebung

Verwandte Artikel