Makrophagen-phagozytische Aktivität gegen Krebszellen, insbesondere 4T1 Maus-Mammakarzinom-Zellen, wurde in dieser Studie abgebildet. Das Modell der Kokultur von Lebenden Zellen wurde mit einer Kombination aus fluoreszierender und differentialer Interferenzkontrastmikroskopie erstellt und beobachtet. Diese Bewertung wurde mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware zur Entwicklung von Multipoint-Zeitraffervideos abget/die sich erstellt haben.
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Methodenartikel
Time-Lapse 2D Imaging der phagozytischen Aktivität in M1 Macrophage-4T1 Maus-Mammary Karzinom-Zellen in Kokulturen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) wurden als wichtiger Bestandteil für Tumorwachstum, Invasion, Metastasierung und Resistenz gegen Krebstherapien identifiziert. Tumorassoziierte Makrophagen können jedoch je nach Tumormikroumgebung schädlich für den Tumor sein und ihre phänotypischen Eigenschaften reversibel verändern, indem sie entweder die zytotoxische Aktivität von Immunzellen antagonisieren oder die Anti-Tumor-Reaktion verbessern. Die molekularen Aktionen von Makrophagen und ihre Wechselwirkungen mit Tumorzellen (z.B. Phagozytose) wurden nicht umfassend untersucht. Daher steht die Interaktion zwischen Immunzellen (M1/M2-Subtyp TAM) und Krebszellen in der Tumormikroumgebung heute im Fokus der Krebsimmuntherapieforschung. In der vorliegenden Studie wurde ein Live-Zell-Kokulturmodell von induzierten M1-Makrophagen und Maus-Mamma-4T1-Karzinomzellen entwickelt, um die phagozytische Aktivität von Makrophagen mithilfe einer Zeitraffer-Videofunktion mithilfe von Phasenkontrast-, Fluoreszenz- und Differentialinterferenzkontrast(DIC)-Mikroskopie zu bewerten. Die vorliegende Methode kann die Mehrpunkt-Livezellbildgebung der Phagozytose beobachten und dokumentieren. Die Phagozytose von 4T1-Zellen durch M1-Makrophagen kann mittels fluoreszierender Mikroskopie beobachtet werden, bevor 4T1-Zellen mit Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) gefärbt werden. Die aktuelle Publikation beschreibt, wie Makrophagen und Tumorzellen in einer einzigen bildgebenden Schale kokultiviert werden, M1-Makrophagen polarisieren und Multipoint-Ereignisse von Makrophagen aufzeichnen, die 4T1-Zellen während 13 h Cokultur verschlingen.
Einleitung
Makrophagen sind die erste Linie der Immunabwehr und spielen eine Rolle bei der Orchestrierung von Immunreaktionen gegen Krankheitserreger und Fremdstoffe, einschließlich Krebszellen. Sie sind eine spezialisierte Phagozyte, die unerwünschte Partikel im Körper zerstört und loswird. Makrophagen tragen zu Abwehrfunktionen wie der Clearance von apoptotischen Zellen und Mikroorganismen und der Rekrutierung anderer Immunzellenbei 1. Makrophagen können sich als Reaktion auf Umweltsignale2in zwei verschiedene Typen unterscheiden, M1- und M2-Makrophagen. M1-polarisierte Makrophagen (d.h. klassisch aktivierte Makrophagen) werden d....
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Protokoll
HINWEIS: In den Abschnitten 1-6 wird das Cokulturmodell von 4T1-Maus-Mammakarzinomzellen und RAW 264.7-Mausmakrophagen beschrieben. Abschnitt 7 beschreibt die Zeitrafferbewertung von M1-Makrophagen, die 4T1-Zellen gephagogiert haben.
1. Culturing 4T1 Maus Mammakarzinom-Zellen und RAW 264.7 Maus Makrophagen
- Eine Durchstechflasche mit kryogen konservierten 4T1 und RAW 264.7 Durchgang 6 Zellen durch sanftes Rühren in einem Wasserbad bei 37 °C oder die normale Wachstumstemperatur für die Zelllinien auftauen.
HINWEIS: Das Auftauen sollte schnell erfolgen, ungefähr innerhalb von 2 min. Um eine Kontamination zu vermeiden, entfernen Si....
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Ergebnisse
Die zeitraffigen zweidimensionalen (2D) Bilder des Cokulturmodells von 4T1 Maus-Mammakarzinom-Zelllinien zeigen die 4T1-Zellen, die während eines 13-Stunden-Zeitraums von M1-Makrophagen verschlungen werden. Es ist wichtig, eine vollständige Polarisation der M1-Makrophagen durch Immunfärbung zu gewährleisten. Die Ergebnisse (Abbildung 1) zeigen, dass die Konzentration von 100 ng/ml Lipopolysacchariden (LPS) und 20 ng/mL IFN--polarisierten RAW 264.7 Makrophagen in den M1-Zustand. Die Kennzeich.......
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Diskussion
Das beschriebene Protokoll erfordert zwei Schritte: 1) Kokultur von 4T1 Maus-Mammakarzinomzellen und M1-polarisierten Makrophagen und 2) Bewertung der phagozytischen Makrophagenaktivität mittels Zeitraffermikroskopie. Live-Zell-Kokultur ist weit verbreitet in Phagozytose und Migration Assays verwendet. Das Live-Zell-Kokulturmodell ist hier ein einfaches, anpassungsfähiges In-vitro-Verfahren (Abbildung 2), das einen fluoreszierenden Farbstoff CFSE verwendet, der zur Kennzeichnung der 4T1-Ziel.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800 finanziert. Wir danken dem Agro-Biotechnology Institute, Malaysia (ABI) Laboratorien und Mikroskopie-Bildgebungsanlage. Besonderer Dank geht an Mohd Daniel Hazim für die Hilfe bei der Bearbeitung und Aufnahme des experimentellen Videos für diese Arbeit.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anti-INOS-Antikörper konjugiert FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 & micro; g in 1 ml |
| Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/HyClone mit hohem Glukosegehalt | SH30003,04 | 670,0 g | |
| Fötales Rinderserum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 ml |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| rekombinante Interferon-gamma-Stammzellentechnologien für Mäuse | 78021 | 100 & micro; g | |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphat gepufferte Kochsalzlösung | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 Packung |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 & Mikro; L Pipettenspitzen | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 Spitzen/Karton |
| 2 mL serologische Pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Nicht-pryogen |
| 200 & micro; L Pipettenspitzen | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20.000 tps/Karton |
| 25 cm2 Zellkulturkolben | Corning | CLS430639 | mit Gewebekulturen behandelt |
| Tischzentrifuge | Dynamica | FA15C | Modell: Velocity 14R |
| Abzug für biologische Sicherheit | Nuaire | NU-565-400 | Modell: Startseite/ LabGard® ES TE NU-565 Klasse II, Typ B2 Biosicherheitsabzug |
| CO2-/Luftmischer | Chamlide (Lebendzelleninstrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Luftmischer) mit dem Durchflussmesser |
| Zellabstreifer | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2-Zellinkubator | Panasonic | N/A | Modell: MCO-19M(UV) |
| Konfokalmikroskop | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glasbodenschale | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS Elements Software | Nikon Instruments Inc. | Online verfügbar download | |
| Pipettensteuergerät | CappAid | PA-100 | CappController Pipettensteuergerät, 0,1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Abgekündigt | JCS-33A 48 x 48 x 96,5 mm |
Referenzen
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
