Bildgebung und Analyse der Gewebeorientierung und Wachstumsdynamik in der Entwicklung drosophila Epithelia während der Pupal-Stadien

Summary

Dieses Protokoll ist für die Bildgebung und Analyse der Dynamik der Zellorientierung und des Gewebewachstums in der Drosophila-Bauchepithelie konzipiert, während die Fruchtfliege einer Metamorphose unterzogen wird. Die hier beschriebene Methodik kann auf die Untersuchung verschiedener Entwicklungsstadien, Gewebe und subzellulärer Strukturen in Drosophila oder anderen Modellorganismen angewendet werden.

Abstract

Innerhalb mehrzelliger Organismen weisen reife Gewebe und Organe hohe Ordnungsgrade in den räumlichen Anordnungen ihrer Konstituentenzellen auf. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die sensorische Epithelie, bei der Zellen der gleichen oder unterschiedlichen Identitäten über die Zell-Zell-Adhäsion zusammengeführt werden, die hochorganisierte planare Muster zeigt. Zellen richten sich in der gleichen Richtung aneinander aus und zeigen über große Entfernungen eine äquivalente Polarität an. Diese Organisation der reifen Epithelie wird im Laufe der Morphogenese etabliert. Um zu verstehen, wie die planare Anordnung der reifen Epithelie erreicht wird, ist es entscheidend, die Zellorientierung und Wachstumsdynamik mit hoher raumzeitlicher Genauigkeit während der Entwicklung in vivo zu verfolgen. Robuste Analysetools sind auch unerlässlich, um lokale zu globale Übergänge zu identifizieren und zu charakterisieren. Die Drosophila-Pupa ist ein ideales System zur Bewertung orientierter Zellformveränderungen, die der epitheliaalen Morphogenese zugrunde liegen. Das pupal entwickelnde Epithel bildet die äußere Oberfläche des unbeweglichen Körpers und ermöglicht eine langfristige Bildgebung intakter Tiere. Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um Zellverhalten sowohl auf globaler als auch auf lokaler Ebene in der pupalen Abdominalepidermis zu abbilden und zu analysieren, während es wächst. Die beschriebene Methodik kann leicht an die Abbildung von Zellverhalten in anderen Entwicklungsstadien, Geweben, subzellulären Strukturen oder Modellorganismen angepasst werden.

Introduction

Um ihre Rolle zu erfüllen, verlassen sich Epithelgewebe voll und ganz auf die räumliche Organisation ihrer zellulären Komponenten. In den meisten Epithelien werden Zellen nicht nur gegeneinander gepackt, um eine präzise Kopfsteinpflasterschicht zu schaffen, sondern sie orientieren sich relativ zu den Körperachsen.

Die funktionelle Bedeutung einer präzisen Gewebeorganisation wird bei sensorischen Epithelien wie dem Wirbeltier-Innenohr und der Netzhaut deutlich. Im ersten Fall richten sich Haar- und Stützzellen in eine bestimmte axiale Richtung aus, um mechanische Eingänge wie Schall und Bewegung^1,

Protocol

HINWEIS: Dieses Protokoll ist in fünf Schritte unterteilt: (1) Inszenierung der Welpen, (2) Vorbereitung der Pupae für die Bildgebung, (3) Live-Bildgebung der wachsenden Bauchepithelie, (4) Generierung genetischer Mosaike, (5) Datenverarbeitung und -analyse (einschließlich Abschnitten, die beschreiben, wie die Zellorientierungsdynamik anhand von Zellknotenumrissen und Wachstumsdynamik enthoben wird).

1. Inszenierung von Drosophila-Welpen vor der Bildgebung

1. Kulturfliegen des entsprechenden Genotyps auf Standardmedium in Kunststofffläschchen bei 25 °C für 5 Tage (ca. 12 h) nach Dereiablage (AEL).
   HINWEIS: Die Metamorphos....

Results

Das oben beschriebene Protokoll umfasst die Vorbereitung von Drosophila-Pupae für die langfristige Live-Bildgebung und die Verfahren zur Analyse der Zellorientierung und Wachstumsdynamik der Abdominalepidermis. Durch die Anwendung dieser Methode ist es möglich, hochauflösende Filme der sich entwickelnden Pupae für Zeiträume von bis zu 48 h ohne signifikante Photobleichung oder Phototoxizität zu erzeugen. Schnappschüsse, die die Abdominalepidermis (z.B. Histoblasten und LECs) zu u.......

Discussion

Die Langfristige Ordnung ist ein wesentliches Merkmal der meisten funktionellen physiologischen Einheiten. Bei der Morphogenese wird Ordnung durch die Integration komplexer Instruktionen erreicht, die mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision umgesetzt werden. Mehrere und mehrstufige Konsprossen sind in stereotype Gewebeanordnungen integriert.

Polarität und Richtung sind entscheidend für eine geordnete räumliche Anordnung während der Entwicklung. Polarität impliziert Symmetriebruch während.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analyse	Software-ImageJ		Analyse von Daten
Drosophila<	em>Atpa::GFP	-	Stämme, die für die Datenerfassung eingesetzt werden
Drosophila<	em>hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Stämme für die Datenerfassung
Dumont 5 Pinzetten	FST	11251-20	1,5 mm Durchmesser für die Dissektion
Glasbodenplatten	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Eindeckpuppen für die Datenerfassung
Halogenkohlenwasserstoff Öl 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	Einbettpuppen
Inverses Konfokales Mikroskop	Zeiss	LSM700	Datenerfassung
Stereomikroskop	Leica	DFC365FX	Visualisierung der Puppen während der Dissektion