Methodenartikel

Zuverlässige Isolierung von Mikrogefäßen des zentralen Nervensystems über fünf Wirbeltiergruppen hinweg

DOI:

10.3791/60291

⸱

12. Januar 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ziel dieses Protokolls ist es, Mikrogefäße aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems von lissenzephalischen und gyrencephalen Wirbeltieren zu isolieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Isolierung von Mikrogefäßen aus dem Zentralnervensystem (ZNS) wird häufig durch die Kombination von kortikalem Gewebe von mehreren Tieren, meist Nagetieren, durchgeführt. Dieser Ansatz begrenzt die Abfrage von Eigenschaften der Blut- und Hirnschranke (BBB) auf den Kortex und lässt keinen individuellen Vergleich zu. Dieses Projekt konzentriert sich auf die Entwicklung einer Isolationsmethode, die den Vergleich der neurovaskulären Einheit (NVU) aus mehreren ZNS-Regionen ermöglicht: Kortex, Kleinhirn, Optiklappen, Hypothalamus, Hypophyse, Hirnstamm und Rückenmark. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll, das ursprünglich für murine Proben entwickelt wurde, erfolgreich für den Einsatz an ZNS-Geweben kleiner und großer Wirbeltierarten angepasst, von denen wir auch Mikrogefäße aus weißer Materie der Gehirnhälfte isolieren können. Diese Methode, in Kombination mit Immunolabeling, ermöglicht die Quantifizierung der Proteinexpression und einen statistischen Vergleich zwischen Individuen, Gewebetyp oder Behandlung. Wir haben diese Anwendbarkeit bewiesen, indem wir Veränderungen der Proteinexpression während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE), einem murinen Modell einer neuroinflammatorischen Erkrankung, Multipler Sklerose, bewertethaben. Zusätzlich könnten Mikrogefäße, die mit dieser Methode isoliert werden, unter anderem für nachgelagerte Anwendungen wie qPCR, RNA-seq und Western Blot eingesetzt werden. Auch wenn dies nicht der erste Versuch ist, ZNS-Mikrogefäße ohne den Einsatz von Ultrazentrifugation oder enzymatischer Dissoziation zu isolieren, ist es in seiner Fähigkeit für den Vergleich einzelner Individuen und mehrerer ZNS-Regionen einzigartig. Daher ermöglicht es die Untersuchung einer Reihe von Unterschieden, die sonst unklar bleiben können: ZNS-Teile (Cortex, Kleinhirn, optischer Lappen, Hirnstamm, Hypothalamus, Hypophyse und Rückenmark), ZNS-Gewebetyp (graue oder weiße Materie), Personen, experimentellen Behandlungsgruppen und Arten.

Einleitung

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Unser Gehirn ist das wichtigste Organ in unserem Körper. Aus diesem Grund ist es eine Priorität, die Homöostase des Gehirns trotz externer Faktoren zu halten, die eine Abweichung von der Normalität auslösen können. Einigen Gelehrten zufolge entwickelten Wirbeltierevoretwa 400 bis 500 Millionen Jahren das, was wir heute als Blut-Hirn-Schranke (BBB)2,3bezeichnen. Dieser schützende "Zaun" übt den größten Einfluss auf die Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) aus und wirkt, indem er den Transport von Ionen, Molekülen und Zellen zwischen Blut und ZNS-Parenchym streng reguliert. Wenn die BBB gestört ist, wird das Gehirn anfällig für toxische Exposition, Infektion, und Entzündungen. Daher, BBB Dysfunktion ist verbunden mit vielen, wenn nicht alle, neurologische und neuroentwicklungsbedingten Störungen4,5,6.

Die ausgeklügelte Funktion des BBB wird der einzigartigen ZNS-Mikrovaskulatur zugeschrieben, die von der neurovaskulären Einheit (NVU)2,3angepasst wird. Hochspezialisierte Endothelzellen, Pericyten und astrozytäre Endfüße sind die zellulären Komponenten der NVU2,3. Die von diesen Zellen erzeugte extrazelluläre Matrix ist auch für die NVU- und BBB-Physiologie2,3von wesentlicher Bedeutung. Obwohl wesentliche zelluläre und molekulare Komponenten der NVU unter Wirbeltieren konserviert werden, wird Heterogenität zwischen Ordnungen und Arten7,8berichtet. Technische Einschränkungen behindern jedoch unsere Fähigkeit, diese Unterschiede in der Neurobiologie, Biomedizin oder translationalen Forschung vollständig zu berücksichtigen.

Aus diesem Grund haben wir eine CNS-regionsspezifische Mikrogefäß-Isolationsmethode erweitert, um sie auf zahlreiche Arten aus allen fünf Wirbeltiergruppen anzuwenden: Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säugetiere. Das Protokoll wird für die Anwendung an klein-lissenzephalischen und großkreiselzephalen Wirbeltieren beschrieben, einschließlich Arten mit translationaler Relevanz9. Darüber hinaus schließen wir andere Regionen des ZNS ein, die in diesem Zusammenhang noch nicht untersucht wurden, aber für die Neurophysiologie relevant sind und enorme klinische Auswirkungen haben: Hypothalamus, Hypophyse und weiße Materie. Schließlich haben wir die Fähigkeit dieser Isolationsmethode als zuverlässiges Werkzeug getestet, um Veränderungen der Proteinexpression entlang der NVU und/oder BBB9,10,11zu identifizieren. Als Proof-of-Concept haben wir gezeigt, wie Veränderungen der VCAM-1- und JAM-B-Expression während der EAE mithilfe der Isolationsmethode gefolgt von Immunfluoreszenz bestimmt werden können.

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Protokoll

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Alle Verfahren der vorliegenden Studie entsprechen den Richtlinien der University of California (UC), davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Die Tierpflege an der UC Davis wird durch mehrere unabhängige Ressourcen reguliert und ist seit 1966 von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) voll akkreditiert. Porcine CNS Gewebe wurden von UCD Department of Animal Sciences, Meat Sciences Laboratory gewonnen. ZNS-Gewebe aus Rhesus-Makaken wurden vom California National Primate Research Center Pathology Department (NIH P51OD011107) gewonnen. Keine Anästhesie, Euthanasie oder Nekropsie wurde von Labormitarbeitern an Schweinen und Makaken durchgeführt. Daher gibt es keine besonderen Empfehlungen zu diesen Fragen.

HINWEIS: Diese Methode wurde für mehrere Arten validiert, aber das bereitgestellte Protokoll entspricht direkter Maus- und Schweinegewebe. Details zum Optischen Lappen gelten nicht bei der Verwendung von Säugetierproben. Alle biogefährlichen Stoffe müssen in einer geeigneten Biosicherheitseinrichtung (BSL) behandelt werden. Alle akut toxischen Materialien müssen unter einer Dunstabzugshaube behandelt werden. Alle biogefährlichen medizinischen Abfälle und akut giftigen Abfälle müssen ordnungsgemäß entsorgt werden.

1. Vorbereitung

  1. Bereiten Sie Lösungen(Tabelle 1) mindestens einen Tag im Voraus vor.
    HINWEIS: Es ist sehr schwierig, 70 kDa Molekulargewicht (MW) Dextran aufzulösen. Es ist effizienter, die Lösung über Nacht entweder mit Paraffinfolie oder Folie umrühren zu lassen. Das Protokoll erfordert die Verwendung von zwei verschiedenen MV-2-Lösungen, abhängig von der untersuchten Probe. Der 18% Dextran trennt das Myelin effizient vom Mikrogefäßpellet, wenn das Protokoll an kleinen lissenzephalen Proben ausgeführt wird. Es entwickelt jedoch einen Abstrich von Myelin innerhalb der Schnittstelle von ZNS-Geweben von großen gyrencephalen Proben, sowie dem Hypothalamus und der Hypophyse von kleinen Proben. Dieser Abstrich wird durch die Verwendung von 20% dextran verhindert.
  2. Bereiten Sie Well-Dias vor, indem Sie 50 l pro Bohrung von Poly-D-Lysin beladen und 2 h bei Raumtemperatur (RT), vorzugsweise in einem biologischen Sicherheitsschrank Klasse 2 (BSC-2), trocknen lassen. Nicht übertrocknen. Zweimal mit phosphatgepufferter Saline (PBS) abspülen und im Kühlschrank aufbewahren, bis er einsatzbereit ist.

2. ZNS Gewebesektion aus kleinen Lissenzephalic Vertebrate Specimen

HINWEIS: Der Artikel zeigt die Anwendung des Protokolls auf einer C57BL6/J, 10 Wochen alt, 25 g, männliche Maus.

  1. Bereiten Sie zwei 15 ml konische Rohre und ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr mit 5 ml bzw. 1 ml MV-1 Lösung pro Probe vor. Rohre auf Eis halten.
  2. Anästhesisierung
    1. Anästhesisieren Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion eines Ketamin-, Xylazin- und Acepromazin-Anästhetikum-Cocktails bei 100/10/3 mg pro kg Körpergewicht und sprühen Sie mit 70% Ethanol. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie das Fehlen von palpebralen und Pedalreflexen bewerten, indem Sie ein Auge berühren bzw. einen Fuß kneifen.
    2. Tauben durch Einatmen von 5% Isofluran mit einem Induktionsanästhesiekasten anästhesieren.
    3. Anästhetisieren Sie Fische und Frösche in 1% Tricaine entweder in einem Fisch, der Wassertank oder Amphibienringer-Lösung(Tabelle der Materialien) hält.
    4. Eidechsen durch Abkühlen bei 4 °C vor der Euthanasie anästhesieren.
  3. Enthaupten Sie das Tier mit einer chirurgischen Schere, schälen Sie die Haut mit Zangen, um den Schädel freizulegen, und schneiden Sie mit LaGrange Schere durch das Foramen magnum (Abbildung 1A).
  4. Sezieren Sie das Gehirn mit einem Spachtel und übertragen Sie auf ein 15 ml konisches Rohr mit MV-1-Lösung. Halten Sie Dieröhre auf Eis.
  5. Holen Sie die Hypophyse aus der Sella-Turcica des Schädels mit Zange und übertragen Sie auf ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr mit MV-1-Lösung. Halten Sie Dieröhre auf Eis.
  6. Entfernen Sie die Haut und den Muskel, um die Wirbelsäule freizulegen. Gliedmaßen, Rippenkäfig und innere Organe ausschneiden (Abbildung 1B).
  7. Sezieren Sie das Rückenmark durch eine der beiden unten beschriebenen Methoden. Dann in ein 5 ml konisches Rohr mit MV-1 Lösung übertragen. Halten Sie Dieröhre auf Eis.
    1. Führen Sie die Laminektomie durch Schneiden in eine rostrale bis kaudale Richtung mit laGrange Schere, beginnend durch den Halswirbel Foramen, bis zum Erreichen der Lendenschnur.
    2. Spülung in kaudaler bis rostraler Richtung im Lendenwirbelforamen mit einer 18 G Nadel und einer 10 ml Spritze, die mit MV-1-Lösung beladen ist (Abbildung 1C,D).
      HINWEIS: Diese Methode funktioniert nur mit sehr kleinen Proben, meist Nagetieren (<100 g).
  8. Schneiden Sie mit einem Sezieren den Dur-Sack mit einer Federschere aus dem Rückenmark und entfernen Sie die restlichen Meningen mit einem doppelzackigen Pick (Abbildung 2).
  9. Übertragen Sie das Gehirn auf eine Petrischale und entfernen Sie die Meningen mit einem doppelzackigen Pick (Abbildung 2A-C).
  10. Die Olfaktor-Glühbirnen und thalamus mit Zangen, Irisschere und Federschere verbrauchen. Entfernen Sie den Aderhautplexus mit dem doppelzackigen Pick aus allen Hirnventrikeln. Achten Sie darauf, alle Aderhaut plexus zu entfernen.
    HINWEIS: Der Aderhautplexus und die Olfaktor-Lampen sind eine massive Kontaminationsquelle. Im Gegensatz zum BBB sind diese Kapillaren stark verfälscht und die Ergebnisse der nachfolgenden Experimente werden kompromittiert, wenn sie nicht entfernt werden.
  11. Mit Zangen, trennen Sie die verschiedenen ZNS-Regionen: Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm, Sehlappen (nicht auf Säugetierproben) und Hypothalamus.

3. ZNS Gewebesektion aus einem großen gyrencephalen Wirbeltier

HINWEIS: In diesem Protokoll werden zindertiertes Zinngewebe aus einem Schlachthof verwendet. Daher wird hier keine Anästhesie, Euthanasie oder Nekropsie beschrieben oder gezeigt.

  1. Transport von ZNS-Geweben mit Schweinen in einem 0,946 L (32 oz) Histologiebehälter, der mit MV-1-Lösung beladen ist, in einer Eistruhe/Eimer.
  2. Entfernen Sie die Meningen mit einem doppelzackigen Pick, Zangen, Irisschere und Federschere aus jedem ZNS-Gewebe. Achten Sie darauf, alle Stücke von Aderhautplexus aus dem Gehirn Ventrikeln zu entfernen.

4. ZNS Gewebehomogenisierung

HINWEIS: Es ist effizienter, wenn zwei Forscher in den Homogenisierungsprozess einsteigen: einer seziert die Meningen unter dem Stereoskop und der andere homogenisiert das Hackfleisch. Auf diese Weise werden die Gewebe schnell in den Eiskübel zurückgeführt und kalt gehalten.

  1. Platzieren Sie jede CNS-Region auf einer Petrischale mit einer MV-1-Lösung von 1 ml. Mit einer einschneidigen Klinge das Gewebe zerkleinern, um 1–2 mm Stücke zu erhalten.
    1. Für eine kleine Wirbeltierprobe eine 100 mm x 20 mm Petrischale verwenden.
    2. Für eine große Wirbeltierprobe verwenden Sie eine 150 mm x 15 mm Petrischale.
  2. Homogenisierung eines kleinen Wirbeltiers (Tabelle 2 und Tabelle 3)
    1. Übertragen Sie den Kortex, das Kleinhirn, das Hirnstamm, den Sehlappen und das Rückenmark in eine individuelle 10 ml Potter-Elvehjem Glasgewebeschleifmaschine mit einem PTFE-Stößel mit einer Transferpipette von 1 ml MV-1-Lösung. Fügen Sie 5 ml MV-1-Lösung hinzu und homogenisieren Sie jedes Gewebe (ca. 10 Striche). Transfer in einzelne 15 ml konische Rohre. Rohre auf Eis halten.
      HINWEIS: Für ein kleines Wirbeltier, 5 oder 4, mit oder ohne Sehlappen, werden jeweils 10 ml Potter-Elvehjem-Schleifmaschinen und 15 ml konische Röhren benötigt.
    2. Hypothalamus und Hypophyse mit Zangen in ein individuelles 1,7 ml-Rohr mit Zangen in eine MV-1-Lösung mit 100 l übertragen und mit einem Glasmikropestle sorgfältig homogenisieren. Spülen Sie jede Mikropestle mit einer MV-1-Lösung von 1 ml. Halten Sie Dieröhre auf Eis.
      HINWEIS: Für ein kleines Wirbeltier werden 2 Glasmikroschädlinge und 1,7 ml Röhren benötigt.
  3. Homogenisierung eines großen Wirbeltiers (Tabelle 4 und Tabelle 5)
    1. Mit einer Transferpipette das Hackfleisch auf einen 55 ml Potter-Elvehjem Glasgewebeschleifer mit einem PTFE-Stößel übertragen und an einem Oberrührer befestigen. Fügen Sie die Hälfte des empfohlenen Volumens der MV-1-Lösung je nach dem zu homogenisierenden ZNS-Teil hinzu (Tabelle 5).
    2. Schalten Sie den Oberrührer bei sehr niedriger Geschwindigkeit (ca. 150 U/min) ein und bewegen Sie das Glasrohr vorsichtig für ca. 30 s nach oben und unten.
    3. Schalten Sie den Overheadrührer aus, fügen Sie weitere MV-1-Lösung hinzu und wiederholen Sie Schritt 4.3.2, bis Sie eine homogene Gülle erhalten.
    4. Transfer in ein 50 ml konisches Rohr. Halten Sie Dieröhre auf Eis.
    5. Waschen Sie den Schleifer mit entionisiertem Wasser zwischen jeder ZNS-Gewebehomogenisierung.
      HINWEIS: Für ein großes Wirbeltier 5 oder 4, mit oder ohne weiße Materie, werden jeweils 50 ml konische Röhren benötigt. Ebenso werden zwei (2) 15 ml konische Röhren für den Hypothalamus und die Hypophyse benötigt.

5. Mikrogefäßreinigung

  1. Zentrifugengewebe homogenate aus Schritt 4.2.1, 4.2.2 oder 4.3.4 bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C. Auf der Oberseite der Pellets der rötlichen Mikrogefäße bildet sich eine große weiße Schnittstelle von Myelin. Entsorgen Sie die Überräube.
    1. Kleine Wirbeltierprobe (Tabelle 2 und Tabelle 3)
      1. Setzen Sie die Kortex-, Kleinhirn-, Hirnstamm-, Sehlappen- und Rückenmarkspellets in 5 ml eiskalter MV-2-Lösung mit einer 5 ml serologischen Pipette (10 Spülungen) wieder auf. Fügen Sie 5 ml eiskalte MV-2-Lösung zu jeder Suspension hinzu und mischen Sie sorgfältig, indem Sie die Rohre umdrehen.
      2. Den Hypothalamus und die Hypophysenpellets mit 1 ml MV-2-Lösung aussetzen.
    2. Große Wirbeltierprobe (Tabelle 4 und Tabelle 5)
      1. Fügen Sie 20 ml eiskalte MV-2-Lösung in die Kortex-, Kleinhirn-, Hirnstamm- und Rückenmarksmikrovessel-Pellets. Setzen Sie die Pellets durch Mischen auf einem Röhrenrevolver-Shaker wieder auf, rühren Sie bei 40 U/min für 5 min. Gleichgewichten sie die Volumen der konischen Röhren von Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm und Rückenmarkssuspensionen, indem Sie weitere MV-2-Lösung hinzufügen.
      2. Den Hypothalamus und die Hypophysenmikrovesselpellets in 5 ml MV-2-Lösung mit einer 5 ml serologischen Pipette (10 Spülungen) wieder aufsetzen. Fügen Sie 5 ml eiskalte MV-2-Lösung zu den Suspensionen hinzu und mischen Sie sorgfältig, indem Sie das Rohr umdrehen.
  2. Zentrifuge bei 4.400 x g für 15 min bei 4 °C.
  3. Lösen Sie vorsichtig die dicke und dichte Myelinschicht an der Flüssigkeitsschnittstelle von den Wänden jedes Rohrs, indem Sie die Rohre langsam drehen und den Überstand an den Wänden entlang bewegen lassen.
  4. Entsorgen Sie die Myelin- und Flüssigkeitsschnittstelle und bauchen Sie die Innenwand jedes Rohres mit einem Spachtel, der mit einem papierarmen Papiertuch umwickelt ist. Bei kleinen Wirbeltierproben entfernen Sie die Myelinschicht aus jedem Hypothalamus und Hypophysenrohr, indem Sie sorgfältig mit einer Transferpipette absaugen.
  5. Überschüssige Flüssigkeit mit einem verdrehten Low-Lint-Papierabwischen auswischen. Setzen Sie jedes Pellet mit 1 ml MV-3-Lösung mit niedrigbindenden Spitzen aus. Rohre auf Eis halten.

6. Mikrogefäß-Elution und Filtration

  1. Gießen Sie eiskalte MV-3-Lösung in einzelne Becher für jede ZNS-Region. Bei 4 °C aufbewahren.
    1. Für kleine Wirbeltierproben 10 ml MV-3 Lösung pro 50 ml Becher verwenden. Insgesamt 6–7 Becher sind notwendig, je nachdem, ob der optische Lappen enthalten ist oder nicht.
    2. Verwenden Sie für große Wirbeltierproben 30 ml MV-3 Lösung pro 100 ml Becher. Insgesamt 6–7 Becher sind notwendig, je nachdem, ob weiße Materie enthalten ist oder nicht.
  2. Legen Sie ein Zellsieb auf ein 50 ml konisches Rohr. Verwenden Sie eine pro CNS-Region. Verwenden Sie ein 100-m-Sieb für den Kortex, den Hirnstamm, den Sehlappen, das Rückenmark und die Hypophyse. Verwenden Sie ein 70-m-Zellsieb für Kleinhirn und Hypothalamus.
  3. Befeuchten Sie jedes Sieb mit 1 ml eiskalte MV-3 Lösung.
  4. Fügen Sie den in Schritt 5.5 vorbereiteten Suspensionen mit einer serologischen Pipette beim Mischen weitere MV-3-Lösungen hinzu, um Aggregate zu vermeiden. Laden Sie Mikrogefäße vorsichtig auf das Sieb. Mit eiskalter MV-3-Lösung abspülen.
    1. Für kleine Wirbeltierproben(Tabelle 2 und Tabelle 3)10–15 ml MV-3-Lösung mit einer serologischen Pipette hinzufügen und mit 5 ml MV-3-Lösung abspülen.
    2. Für große Wirbeltierproben 20 ml MV-3-Lösung mit einer serologischen Pipette hinzufügen und mit 10 ml MV-3-Lösung abspülen.
  5. Montieren Sie die Filtereinheit, indem Sie einen 20-mm-Nylonnetzfilter auf einen modifizierten Filterhalter (Abbildung 2D), einen pro CNS-Bereich, legen.
    1. Für kleine Wirbeltierproben(Tabelle 2 und Tabelle 3)verwenden Sie 25 mm modifizierte Filterhalter für Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm, Sehlappen und Rückenmark. Verwenden Sie 13 mm modifizierte Filterhalter für den Hypothalamus und die Hypophyse.
    2. Für große Wirbeltierproben(Tabelle 4 und Tabelle 5)verwenden Sie modifizierte 47 mm Filterhalter für Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm und Rückenmark. Verwenden Sie 25 mm für den Hypothalamus und die Hypophyse.
  6. Platzieren Sie den Filter auf ein 50 ml kegelförmiges Rohr und einen Nassfilter mit 5 ml eiskalter MV-3-Lösung, um sicherzustellen, dass der Puffer den Filterhalter auf das konische Rohr heruntergießt.
  7. Übertragen Sie die eluierten Mikrogefäße (ab Schritt 6.4) auf den 20-m-Nylonnetzfilter und spülen Sie die Mikrogefäße mit 5–10 ml eiskalter MV-3-Lösung.
  8. Den Filter mit sauberen Zangen wiederherstellen und in den Becher eintauchen, der die eiskalte MV-3-Lösung enthält, die in Schritt 6.1 vorbereitet wurde.
  9. Lösen Sie die Mikrogefäße aus dem Filter, indem Sie sie für ca. 30 s sanft schütteln. Für kleine Wirbeltierproben den Bechergehalt in ein 15 ml konisches Rohr gießen. Für große Wirbeltierproben den Bechergehalt in ein 50 ml konisches Rohr gießen.
  10. Zentrifugieren Sie bei 2.000 x g für 5 min bei 4 °C und setzen Sie das Pellet in 1 ml eiskalter MV-3-Lösung mit einer bindungsarmen Pipettenspitze wieder auf.
    1. Bei kleinen Wirbeltierproben die Suspension (ab Schritt 6.10) in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 20.000 x g für 5 min bei 4 °C übertragen.
      HINWEIS: Dieser Spin wird auf einer Tischzentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit (20.000 x g) durchgeführt, um eine robuste Ausbeute zu gewährleisten.
    2. Bei großen Wirbeltierproben die Suspension von Schritt 6,10 in ein 5,0 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen, 4 ml MV-3-Lösung und Zentrifuge bei 2.000 x g für 5 min bei 4 °C hinzufügen.

7. Immunostaining

HINWEIS: Hematoxylin- und Eosinfärbung (H&E) wurde an Reptilien-, Amphibien- und Fischproben als Proof-of-Concept der Protokolldurchführbarkeit durchgeführt. Daher gibt es keine Empfehlung für die Immunkennzeichnung für diese Proben.

  1. Entfernen Sie den Überstand aus den Mikrozentrifugenrohren.
  2. Das Pellet in 1x sterilem PBS mit einer bindungsarmen Pipettenspitze (Materialtabelle )wieder aufsetzen Halten Sie die Mikrogefäße vor der Bildung von Aggregaten durch mehrere Pipetten mehrere Male. Für kleine Wirbeltierproben (Tabelle 3)verwenden Sie je nach Pelletgröße 100 l–2.000 l. Für große Wirbeltierproben (Tabelle 5)verwenden Sie je nach Pelletgröße 1.000 l–4.000 l.
  3. Übertragen Sie die Mikrogefäße mit einer niedrigbindenden Pipettenspitze auf Brunnenschlitten, wobei Sie darauf achten, sie in die Mitte jedes Brunnens zu stellen und die Seitenwände zu vermeiden.
  4. Stellen Sie die Brunnenrutschen, unbedeckt, in einem BSC-2, und lassen Sie für 20 bis 30 min bei RT trocknen.
    HINWEIS: Ein relativ hohes Volumen von 1x PBS wird verwendet, um die Aggregatbildung zu vermeiden. Aus diesem Grund ist es notwendig, die Dias vor der Fixierung trocknen zu lassen, um sicherzustellen, dass die Mikrogefäße von der Poly-D-Lysin-Beschichtung gehalten werden.
  5. Reste 1x PBS entfernen, indem sie mit einer Transferpipette herauspipettieren, 200 L Mit4% Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen und 30 min bei RT brüten.
  6. Pipette aus der fixativen Lösung und waschen 3x mit 200 l 1x PBS für 5 min bei RT.
    HINWEIS: An dieser Stelle wurde eine H&E-Färbung von Fisch-, Amphibien- und Reptilien-ZNS-Mikrogefäßen durchgeführt.
  7. Fügen Sie dem Bohrspeicher 200 L Blockierpuffer hinzu und brüten Sie 60 min bei 37 °C.
  8. Entfernen Sie den Sperrpuffer mit einer Transferpipette und fügen Sie 200 L des primären Antikörpercocktails in das Antikörperverdünnungsmittel(Materialtabelle )ein. Bei 4 °C über Nacht inkubieren.
  9. Den primären Antikörpercocktail auspfeifen und 3x mit 200 l 1x PBS für 5 min bei RT waschen.
  10. Den sekundären Antikörpercocktail (Tabelle der Materialien) in 1x PBS verdünnt und 2 h bei RT inkubieren, vor Licht geschützt.
  11. Den Sekundärantikörper-Cocktail auspfeifen und 3x mit 200 l 1x PBS für 5 min bei RT waschen, lichtgeschützt. Nach der letzten Wäsche lösen Sie den Rahmen des Brunnenschlittens und blot-dry überschüssige 1x PBS mit einem niedrigen Fusselpapiertuch.
  12. Fügen Sie ein Coverslip, flüssiges Antifade-Mountant-Medium und 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für die kernnukleare Färbung hinzu. Über Nacht bei RT vor Licht geschützt trocknen lassen.
  13. Nach dem Trocknen bei 4 °C vor Licht geschützt halten, bis sie für die konfokale Mikroskopie und Datenerfassung bereit sind.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrogefäße, die aus muriner ZNS isoliert wurden, zeigten alle intrinsischen zellulären Komponenten der neurovaskulären Einheit2,3. Verwendung von Thrombozyten-Endothelzelladhäsionsmolekül-1 (PECAM, auch bekannt als CD31) oder Isolectin IB4 (ein Glykoprotein, das die Endothelzelle Glycocalyx bindet) für Endothelzellen, Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGFR) oder neuron-gliales Antigen 2 (NG2) für Pericyte und Aquaporin-...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die BBB enthält die einzigartigen Eigenschaften der Gehirn Mikrovaskulatur Endothelzellen gekoppelt durch eine anspruchsvolle Architektur von engen-, Adheren-, "Peg-Socket"-Kreuzungen und Haftungs-Plaques kritisch für ZNS-Homöostase2,3,19. Endothelzellen Eigenschaften werden induziert und gepflegt durch Pericyten und die umgebenden Astroglia Endfußprozesse2,3,...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Cruz-Orengo wurde von der University of California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10X PBSThermoFisherBP39920Wird zum Blockieren und Antikörperverdünnungsmittel verwendet.
20% PFAElektronenmikroskopie Sciences15713-SWird als Fixiermittel verwendet (4% PFA)
70.000 MW DextranMillipore Sigma9004-54-0Wird für MV-2-Lösung verwendet
Adson ForcepsFine Science Tools (FST)11006-12Wird zur Entfernung von Muskeln und Haut
Adson-Pinzette, StudentenqualitätFST91106-12Wie oben, aber billigeres
Rinderserum Albumin (BSA)Millipore SigmaA7906-100GWird für MV-3-Lösung, Blockierung und Antikörperverdünnungsmittel
verwendet Corning 100 μ m Cell SiebMillipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 μ m Cell SiebMillipore SigmaCLS431751-50EA
Corning Deskwork Low-Binding SpitzenMillipore SigmaCLS4151Wie unten, aber günstiger.
Cultrex Poly-D-LysinF& Technik D3439-100-01Wird für die Objektträgerbeschichtung
Esel Anti-Ziegen IgG-ALEXA 555ThermoA21432Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Esel Anti-Maus IgG-ALEXA 488ThermoA21202Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Esel Anti-Kaninchen IgG-ALEXA 488ThermoA21206Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Esel Anti-Kaninchen IgG-ALEXA 647ThermoA31573Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Esel Anti-Ratte IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Doppelzinkiger GewebepickelFST18067-11Wird zur Entfernung von Hirnhäuten und Aderhautplexus
verwendet Dumont #3c PinzetteFST11231-20Wird für die Handhabung von empfindlicherem und/oder kleinerem ZNS-Gewebe (wie Hypophyse) verwendet.Dumont
#7 PinzetteFST11274-20Wird für die Dissektion und Handhabung von ZNS-Geweben
verwendet Dumont #7 Pinzette, StudentFST91197-00Wie oben, aber billiger
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention TipsEppendorf22493008Bessere Qualität als die oben genannten Tips (teurer).
Extra feine Graefe Pinzette, gezahntFST11151-10Wird für die Knochenentfernung
verwendet Feine Schere, scharfFST14060-09Wird zur Entfernung von Schweine- und Makaken-Duralsack
Glasstößel 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen Tissue Grinder Homogenisator, Packung mit 10Chang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10Wird für kleine Tiere, Hypothalus und Hypophyse verwendet.
Ziegen-Anti-CXCL12, biotinyliertesPeproTech500-P87BGBTWird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Verdünnung: 1:20.
Ziege Anti-JAM-BR& DAF1074Wird als primärer Antikörper zur Beurteilung der Neuroinflammation verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 μ g/ml.
Anti-Maus-Ziege IgG-ALEXA 488ThermoA11001Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Ziegen-Anti-Maus IgG-ALEXA 555ThermoA21424Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Ziege anti-PDGFRβForschung & Forschung DAF1042Wird als Primärantikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 μ g/ml.
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-ALEXA 555ThermoA21249Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Ziege Anti-Kaninchen IgG-DyLight 488Thermo35552Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Ziegen-Anti-Ratte IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Graefe Pinzette, gebogene Spitze, 1X2 ZähneFST11054-10Verwendung zum Halten und Schütteln von Nylonfilternetzen
HBSS, 1X Puffer mit Calcium und MagnesiumCorning21-022-CMVerwendet für MV-1 Lösung
HEPES, 1M FlüssigpufferCorning25-060-CIVerwendet für MV-1 Lösung
Isolectin GS-IB4-Biotin-XXThermoFisher Scientific (Thermo)I21414Glykoprotein, isoliert aus der Hülsenfrucht Griffonia simplicifolia, das D-Galactosylreste der Glykokalysx der Endothelzellen bindet. Wird für ZNS-Mikrogefäße von Vögeln und Schweinen verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 μ g/ml.
LaGrange Schere, gezahntFST14173-12Zur Schädeldissektion und Laminektomie (außer bei Schweinen und Makaken)
Millicell EZ Objektträger 8-Well-GerätMillipore SigmaPEZGS0816
Maus anti-CLDN5Thermo35-2500Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäße aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 μ g/ml.
Maus anti-GGT1Abcamab55138Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 μ g/ml.
Maus Anti-Human-CD31R& DBBA7Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen von Primaten verwendet. Empfohlene Konzentration: 16,5 μ g/ml.
Maus Anti-NFMThermoRMO-270Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 μ g/ml.
Maus anti-αSMAThermoMA5-11547Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäße aus allen Proben verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Nylon-Filternetz, RolleMillipore SigmaNY6000010Lasergeschnittene Filternetzscheiben mit einem Durchmesser von 13 mm. Wird für kleine Tiere, Hypothalus und Hypophyse verwendet.
Nylon-Filternetze, 25 mmMillipore SigmaNY2002500Wird für die meisten kleinen Wirbeltiere im ZNS-Gewebe verwendet, außer Hypothalamus und Hypophyse. Wird für Makaken und Schweine, Hypothalamus und Hypophyse verwendet.
Nylon-Filternetze, 47 mmMillipore SigmaNY2004700Wird für ZNS-Gewebe von Makaken und Schweinen verwendet, außer Hypothalamus und Hypophyse.
ProLong Gold Antifading-Reagenz mit DAPIThermoFisherP36935Wird zum Eindecken von Objektträgern verwendet.
Kaninchen-Anti-AQP4Millipore SigmaA5971Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäße aus allen Proben verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Kaninchen-Anti-LSRMillipore Sigma SAB2107967Wird als Primärantikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 μ g/ml.
Kaninchen Anti-NG2Millipore SigmaAB5320Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäße aus allen Proben verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Kaninchen-Anti-OSPAbcamab53041Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 1 μ g/ml.
Kaninchen-Anti-VE-CadherinAbcamab33168Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 μ g/ml.
Kaninchen anti-ZO-1Thermo61-7300Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 μ g/ml.
Ratten-Anti-CD31Becton Dickinson BD550274Wird als primärer Antikörper für murine ZNS-Mikrogefäße verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 μ g/ml.
Ratten-Anti-GFAPThermo13-0300Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.
Ratten-Anti-VCAM-1Becton Dickinson BD553329Wird als primärer Antikörper zur Beurteilung der Neuroinflammation verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 μ g/ml.
Sterile Ringer's Solution, FrogAldon CorporationIS5066Wird für die Amfibianästhesie
verwendet Streptavidin-ALEXA 555ThermoS32355Wird als Sekundärantikörper zur Markierung biotinylierter Primärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647ThermoS32357Wird als Sekundärantikörper zur Markierung biotinylierter Primärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:500.
Chirurgische Schere, scharfFST14002-12Wird zur Entfernung von Muskeln und Haut
Chirurgische Schere, scharf-stumpfFST14001-16Wird zur Enthauptung verwendet (außer Schweine und Makaken)
Swinnex Filterhalter, 13 mmMillipore SigmaSX0001300Modifiziert durch Lasercut. Wird für kleine Tiere, Hypothalus und Hypophyse verwendet.
Swinnex Filterhalter, 25 mmMillipore SigmaSX0002500Modifiziert durch Lasercut. Wird bei den meisten kleinen Wirbeltieren im ZNS-Gewebe verwendet, mit Ausnahme von Hypothalamus und Hypophyse. Wird für Makaken und Schweine, Hypothalamus und Hypophyse verwendet.
Swinnex Filterhalter, 47 mmMillipore SigmaSX0004700Durch Laserschneiden modifiziert. Wird für ZNS-Gewebe von Makaken und Schweinen verwendet, außer Hypothalamus und Hypophyse.
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277Wird als Blockierungs- und Antikörperverdünnungsmittel verwendet.
Wheaton 120 Vac ÜberkopfrührerVWR (Lieferant DWK Life Sciences)62400-904 (DWK #903475)Wird für ZNS-Gewebe von Makaken und Schweinen mit 55 mL Gewebeschleifer verwendet, außer Hypothalamus und Hypophyse.
Wheaton Potter-Elvehjem Gewebeschleifer mit PTFE-Stößel, 10 mLVWR (Lieferant DWK Life Sciences)14231-384 (DWK #357979)Wird für die meisten kleinen Wirbeltiere im ZNS-Gewebe verwendet, außer Hypothalamus und Hypophyse. Wird für Makaken und Schweine, Hypothalamus und Hypophyse verwendet.
Wheaton Potter-Elvehjem Gewebemühle mit PTFE-Stößel, 55 mLVWR (Lieferant DWK Life Sciences)14231-372 (DWK #357994)Wird für ZNS-Gewebe von Makaken und Schweinen verwendet, außer Hypothalamus und Hypophyse.
verwendet verwendet verwendet Stück verwendet

Referenzen

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