Methodenartikel

DNA Origami-vermittelte Substrat Nanomusterung von anorganischen Strukturen für Sensoranwendungen

DOI:

10.3791/60313

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27. September 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biohybrid Materials, Department of Bioproducts and Biosystems, Aalto University, 2University of Jyväskylä, Nanoscience Center, Department of Biological and Environmental Science, University of Jyväskylä, 3University of Jyväskylä, Nanoscience Center, Department of Physics, University of Jyväskylä, 4HYBER Center of Excellence, Department of Applied Physics, Aalto University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erstellung diskreter und genauer anorganischer Nanostrukturen auf Substraten, die DNA-Origami-Formen als Leitmotive verwenden. Die Methode wird durch die Erstellung von plasmonischen Gold-Bowtie-förmigen Antennen auf einem transparenten Substrat (Saphir) demonstriert.

Zusammenfassung

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Die strukturelle DNA-Nanotechnologie bietet einen gangbaren Weg, um von unten nach oben mit DNA als Baumaterial zu bauen. Die gängigste DNA-Nanofabrikationstechnik heißt DNA-Origami und ermöglicht eine hochdurchsatzhohe Synthese präziser und äußerst vielseitiger Strukturen mit Nanometer-Präzision. Hier wird gezeigt, wie die räumlichen Informationen von DNA-Origami auf metallische Nanostrukturen übertragen werden können, indem die Bottom-up-DNA-Origami mit den konventionell verwendeten Top-Down-Lithographieansätzen kombiniert werden. Dies ermöglicht die Herstellung von Milliarden winziger Nanostrukturen in einem Schritt auf ausgewählte Substrate. Das Verfahren wird mit Bowtie-DNA-Origami demonstriert, um metallische, bogenförmige Antennenstrukturen auf Siliziumnitrid- oder Saphirsubstraten zu erzeugen. Das Verfahren beruht auf dem selektiven Wachstum einer Siliziumoxidschicht auf dem Origami-Abscheidungssubstrat, was zu einer Mustermaske für die folgenden lithographischen Schritte führt. Diese mit Nanostrukturen ausgestatteten Oberflächen können aufgrund der geringen Funktionsgrößen (unter 10 nm) weiter als molekulare Sensoren (z.B. oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS)) und in verschiedenen anderen optischen Anwendungen im sichtbaren Wellenlängenbereich eingesetzt werden. Die Technik kann durch methodische Modifikationen auf andere Materialien ausgedehnt werden; Daher können die resultierenden optisch aktiven Oberflächen bei der Entwicklung von Metamaterialien und Metaoberflächen zum Einsatz kommen.

Einleitung

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Strukturelle DNA-Nanotechnologie hat sich in den letzten zehn Jahren rasant entwickelt1,2, und die einflussreichste Entwicklung auf diesem Gebiet war wohl die Erfindung von DNA-Origami3,4. Die DNA-Origami-Technik ermöglicht die Herstellung praktisch jeder Nanoform mit genauen Strukturmerkmalen3,4. Diese leistungsstarke Methode kann in (sub)nanometerpräzisen räumlichen Anordnungen und Verankerungen anderer Nanoobjekte wie Kohlenstoffnanoröhren5, Metallnanopartikel6,7,8, 9, Enzyme/Proteine10,11,12,13 und therapeutische Materialien14,15,16,17 . Wichtig ist, dass diese Strukturen nicht nur statisch sind, sondern auch so programmiert werden können, dass sie dynamisch wirken18,19. Die unzähligen Anwendungen von DNA-Origami reichen von der Medikamentenabgabe20,21,22 bis hin zu Molekularelektronik/Plasmonik5,23,24, 25 und von der Materialwissenschaft26,27 zu neuartigen Bildgebungs- und Kalibriertechniken28.

Neben den oben genannten Anwendungen könnte die extreme räumliche Auflösung der DNA-Origami-Formen in der Nanomusterung und der filigranen Nanolithographie29,30genutzt werden. Dieses Protokoll beschreibt eine Lithographiemethode zur Erstellung diskreter und genauer anorganischer Nanostrukturen auf Substraten mit DNA-Origami-Vorlagen. Diese Schablonen können effizient in verschiedenen Formen und in großen Mengen31hergestellt und mühelos auf ausgewählten Substraten in großen Maßstäben32abgelagert werden. Diese Eigenschaften ermöglichen eine hochgradig parallele Herstellung von Milliarden von Nanostrukturen in einem Schritt im Gegensatz zu häufig verwendeten, aber eher langsamen Elektronenstrahllithographie oder anderen scanning-basierten Nanofabrikationstechniken.

Hierbei wird der Herstellungsprozess durch die Schaffung von goldförmigen, bogenförmigen Strukturen auf Siliziumnitrid- und Saphirsubstraten demonstriert; Mit anderen Worten, die räumliche Information von DNA-Origami wird auf vollständig metallische Nanostrukturen übertragen. Wie hier erläutert, ist die Technik nicht auf die ausgewählte Bowtie-DNA-Origami-Struktur beschränkt, da die Methode die Verwendung praktisch jeder DNA-Origami-Form ermöglicht. Darüber hinaus kann die Technik mit methodischen Modifikationen auf verschiedene Metalle und Substrate erweitert werden, die den Weg zur Herstellung von Metaoberflächen ebnen33.

Die oberflächengemusterten mit der DNA Origami-vermittelten Fertigung können als vielseitige Sensoren dienen; Sie können beispielsweise in der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie (SERS) eingesetzt werden. Aufgrund der geringen Abmessungen der einzelnen Nanoformen können die erstellten Oberflächen in optischen und plasmonischen Anwendungen im sichtbaren Wellenlängenbereich eingesetzt werden.

Protokoll

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1. Design von DNA-Origami

HINWEIS: In diesem Protokoll wird ein Nanomusterungsprozess mit einer zweidimensionalen (2D) Bowtie-DNA-Origami-Struktur beschrieben (Abbildung 1)34. Um eine neue DNA-Origami-Form zu entwerfen, befolgen Sie die folgenden Richtlinien:

  1. Entwerfen Sie die gewünschte Form und die erforderlichen Heftstrangsequenzen des DNA-Origami mit caDNAno35. Um ein flaches, einlagiges Origami zu erzeugen, verwenden Sie die quadratische Gitteroption von caDNAno und passen Sie den Crossover-Abstand manuell an, indem Sie einige Basen im Design überspringen (siehe Abbildung 1 und die ergänzende caDNAno-Datei), um die resultierende strukturelle Verdrehung zu entfernen. aus der quadratischen Gitterpackung36,37.
  2. Erweitern Sie die Enden jeder DNA-Helix mit Strängen, die Poly-T (8 nt) Überhänge enthalten; Dadurch wird die Multimerisierung der Objekte durch stumpfe Basisstapelinteraktionen verhindert(Abbildung 1 und ergänzende caDNAno-Datei).
  3. Führen Sie eine Berechnungsanalyse des Entwurfs aus. CanDo38,39 kann verwendet werden, um die dreidimensionale (3D) Form und strukturelle Steifigkeit des DNA-Origami vorherzusagen. CanDo ist auch ein nützliches Werkzeug, um die Anzahl der Basissprünge zu iterieren, die für die Drehkorrektur benötigt werden, und um das Design entsprechend anzupassen.
  4. Wählen Sie in caDNAno die bevorzugte Gerüstlänge aus und erzeugen Sie die Heftstränge, die zum Falten der Struktur benötigt werden. Für die Bowtie-Struktur werden das 7249 nt lange M13mp18 Gerüst und 205 einzigartige Heftstränge verwendet (siehe die ergänzende caDNAno-Datei).
    HINWEIS: Es gibt auch andere Rechenwerkzeuge für die Gestaltung von DNA-Origami-Strukturen40,41,42,43. Je nach gewähltem Werkzeug/Software können auch andere Simulationswerkzeuge43,44verwendet werden.

2. Montage von DNA-Origami

  1. Machen Sie den Bestand an Heftsträngen durch Mischen gleicher Mengen aller Oligonukleotide für die Bowtie-Struktur benötigt (insgesamt 205 Heftklammern)34. Die Oligonukleotide sollten alle die gleiche Anfangskonzentration haben (z. B. 100 m in RNase-freiem Wasser).
  2. Bereiten Sie das DNA-Origami-Faltreaktionsgemisch in 100 l-Mengen in einem 0,2 ml PCR-Rohr vor, indem Sie 20 l M13mp18 Gerüststrang (Typ p7249, bei 100 nM), 40 l Grundstofflösung, mit einer Stapellösung von 500 nM (die einen 10-fachen Molüberschuss an Heftklammern ergibt) mischen. Gerüst) und 40 l 2,5x Faltpuffer (FOB). FOB enthält Tris - Essigsäure - Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Puffer (TAE) ergänzt mit MgCl2. Siehe Tabelle 1 für die FOB-Komponentenkonzentrationen.
  3. Das Reaktionsgemisch in einem Thermocycler von 90 °C bis 27 °C anneal. Verwenden Sie die in Tabelle 2 dargestellte thermische Klapprampe.

3. Reinigung von DNA-Origami

HINWEIS: Die überschüssige Menge an Heftsträngen kann mit einem zerstörungsfreien Poly(Ethylenglykol) (PEG) Reinigungsverfahren aus der DNA-Origami-Lösung entfernt werden. Das Protokoll ist von Stahl et al.45adaptiert.

  1. Verdünnen Sie 200 l der zusammengesetzten DNA-Origami-Strukturen mit 600 l 1x FOB (siehe Tabelle 1), um ein Ausgangsvolumen von 800 l zu erhalten.
  2. Mischen Sie die verdünnte DNA-Origami-Lösung 1:1 mit 800 l PEG-Niederschlagspuffer (15% PEG 8000 (w/v), 1x TAE, 505 mM NaCl) und mischen Sie gründlich durch Pipettieren hin und her.
  3. Zentrifugieren Sie die Mischung für 30 min bei 14.000 x g und Raumtemperatur.
  4. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.
  5. Fügen Sie 200 L von 1x FOB hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Eine andere Menge von 1x FOB kann auch hinzugefügt werden, um die gewünschte DNA-Origami-Konzentration zu erhalten.
  6. Um die DNA-Origami-Strukturen (kleines transparentes Pellet im Rohrboden) wieder aufzulösen, inkubieren Sie die PEG-gereinigten DNA-Origamistrukturen über Nacht bei Raumtemperatur.
  7. Schätzen Sie die DNA-Origami-Konzentration nach PEG-Reinigung, indem Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm mit einem UV/Vis-Spektrophotometer messen. Verwenden Sie für die Berechnung6das Beer-Lambert-Gesetz und einen Aussterbekoeffizienten von 1,1 x 108 m-1 cm-1 . Die typische DNA-Origami-Konzentration nach PEG-Reinigung beträgt 15-20 nM.
  8. Bewahren Sie die PEG-gereinigten DNA-Origami-Strukturen bei 4 °C auf. Die DNA-Origami-Strukturen sind in der Regel monatelang stabil, so dass große Mengen an Vorräten für die spätere Verwendung vorbereitet werden können.
    HINWEIS: Die überschüssige Menge an Heftsträngen kann auch mit anderen Reinigungstechniken46entfernt werden, wie Spin-Filtration47, Rate zonale Zentrifugation48 und Agarose Gel Extraktion49. Die DNA-Origamistrukturen sind in einer Vielzahl von Pufferlösungenstabil 50, und bei Bedarf kann das Speichermedium nach der PEG-Reinigung durch Spinfiltration51verändert werden.

4. Agarose-Gel-Elektrophorese

HINWEIS: Die Qualität der Faltung und die Entfernung von überschüssigen Heftsträngen kann mit Agarose-Gel-Elektrophorese überprüft werden.

  1. Bereiten Sie ein Agarose-Gel mit einem Gewicht von 2 % (w/v) vor, indem Sie 1 g Agarose und 45 ml 1x TAE zu einem Erlenmeyerkolben hinzufügen. Erhitzen Sie das Gemisch in einer Mikrowelle, bis die Agarose vollständig gelöst ist und eine klare Lösung entsteht.
  2. Kühlen Sie die Lösung unter fließendem Wasser ab, bis der Kolben angenehm zu berühren ist (50–60 °C).
  3. 5 ml 110 mM MgCl2 und 40 l Ethidiumbromidlösung (0,58 mg ml-1)in die Lösung geben und die Mischung sanft schütteln.
    VORSICHT: Ethidiumbromid ist ein potentielles Karzinogen und sollte mit Vorsicht behandelt werden.
  4. Richten Sie das Gelgusstablett ein und gießen Sie die flüssige Agarose in das Gießfach. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur für mindestens 30 min erstarren.
  5. Entfernen Sie das Gel aus der Gießschale und legen Sie es in eine Gelelektrophoresekammer. Füllen Sie die Kammer mit Laufpuffer (1x TAE mit 11 mM MgCl2).
  6. Fügen Sie 1 l 6x Gel-Ladefarbstoff pro 5 l Probenlösung hinzu und mischen Sie sie gründlich. Laden Sie die Proben, indem Sie die gewünschte Menge der Probenlösungen sorgfältig in separate Geltaschen einleiten.
  7. Führen Sie das Agarose-Gel mit einer konstanten Spannung von 95 V für 45 min. Halten Sie die Gel-Elektrophorese-Kammer auf einem Eisbad für den Lauf, um Hitzeschäden am Gel zu vermeiden.
  8. Visualisieren Sie das Gel unter ultraviolettem Licht mit einem Gel-Bildgebungssystem (Abbildung 2A).

5. Substratzubereitung (Abbildung 3A)

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden alle in einem Reinraum ausgeführt, mit Ausnahme des SiO2-Wachstums (Schritt 9). Die Reinigungsschritte können auch durch eine standard-Piranha-Lösungs-basierte Reinigung ersetzt werden, wenn dieser Prozess nicht ausreicht, um alle Rückstände aus dem Substrat zu entfernen.

  1. Schneiden Sie 7 mm x 7 mm Späne aus einem Wafer, der als Substrat verwendet werden soll. Verwenden Sie für SiN eine Siliziumsäge, einen Diamantschneideroder oder ein ähnliches Gerät. Das Dicing Saphir (Al2O3) erfordert ein spezielles Werkzeug oder Sägeblatt. Die Chipgröße muss nicht genau sein.
  2. Reinigung der Chips.
    1. Die gewürfelten Späne in ein Glas mit heißem Aceton (Aceton auf 52 °C erhitzt) eintauchen und mindestens 15 min erhitzt halten. Je nach Anfangsreinheit des Substrats kann eine längere Zeit erforderlich sein.
    2. Während sie sich noch im heißen Acetonbad befinden, reiben Sie die Chips vorsichtig mit einem Wattestäbchen, um rückstände Folien mechanisch zu entfernen.
    3. Heben Sie die Chips mit einer Pinzette aus dem heißen Aceton und spülen Sie sie mit einer Waschflasche mit Raumtemperatur-Aceton.
    4. Tauchen Sie die Chips in ein Glas mit Isopropanol und Ultraschall für 2 min.
    5. Heben Sie die Späne mit einer Pinzette aus dem Isopropanol und trocknen Sie sie sofort und gründlich mit einem Stickstofffluss. Berühren und halten Sie nur die Seiten und Kanten der Späne, da die von der Pinzette abgedeckten Bereiche nicht richtig trocknen, sodass möglicherweise Rückstände und andere Verunreinigungen an den Kontaktflächen entstehen. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie einen möglichst hohen Durchfluss und halten Sie die Spanflächen parallel zur Strömungsrichtung.
  3. Bewahren Sie die Chips in einem überdachten Behälter im Reinraum für die spätere Verwendung auf.

6. Plasmaverstärkte chemische Dampfabscheidung (PECVD) der amorphen Siliziumschicht (a-Si) (Abbildung 3B)

  1. Legen Sie die Chips in die PECVD-Ausrüstung.
  2. Richten Sie die Abscheidungsparameter ein, um etwa 50 nm amorphes Silizium (a-Si) zu züchten. Die genauen Einstellungen variieren je nach Gerätemodell und Kalibrierung. Siehe Tabelle 3 für die hier verwendeten Parameter. Führen Sie das a-Si-Depositionsprogramm aus, um den Layer zu vergrößern.
  3. Nach der Verarbeitung die Chips in einem überdachten Behälter unter normalen Reinraumbedingungen aufbewahren.

7. Sauerstoffplasmabehandlung der a-Si-Schicht (Abbildung 3B)

HINWEIS: Dieser Schritt macht die Substratoberfläche leicht negativ geladen und hydrophil, so dass die DNA-Origami-Strukturen später mit Hilfe zusätzlicher Magnesiumionen effektiv an die Oberfläche adsorbiert werden können.

  1. Legen Sie die Chips in die reaktive Ionenätzung (RIE) Ausrüstung.
  2. Richten Sie die Ätzparameter ein, um Sauerstoffplasma zu erzeugen. Auch hier variieren die genauen Einstellungen je nach Gerätemodell und Kalibrierung. Siehe Tabelle 3 für die hier verwendeten Parameter. Führen Sie das Sauerstoffplasma-Behandlungsprogramm aus.
  3. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, da sich die Auswirkungen der Behandlung schnell verschlechtern werden. In der Regel sollten die Substrate innerhalb der nächsten 30 min nach der Plasmabehandlung verwendet werden.

8. Ablagerung von DNA-Origami (Abbildung 3C)

  1. Bereiten Sie ein DNA-Origami-Gemisch zur Ablagerung vor, indem Sie 5 l gefaltete/gereinigte DNA-Origami-Lösung (ca. 20 nM) mit 4 l 1x FOB und 1 L von 1 M MgCl2mischen. Die resultierende Lösung enthält 10 nM DNA-Origami und ca. 100 mM Mg2+.
  2. Legen Sie 10 l des DNA-Origami-Gemischs auf einen mit Sauerstoffplasma behandelten Chip ab und inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur. Die Abdeckung verhindert unbeabsichtigtes Trocknen und hilft, später Fremdsalz- und DNA-Origamistrukturen zu entfernen.
  3. Waschen Sie die Oberfläche nach der Inkubation zunächst durch Pipettieren von 100 l destilliertem Wasser (z. B. MilliQ) auf dem Chip. Spülen Sie das Wasser ein paar Mal mit der Pipette hin und her, während Sie vermeiden, die Mitte des Chips zu berühren. Entfernen Sie den größten Teil des Wassers von der Oberfläche mit der Pipette. Dadurch bleibt nur das richtig adsorbierte Origami auf der Oberfläche.
  4. Wiederholen Sie diesen Waschzyklus (Schritte 8.3) 3 bis 4 Mal.
  5. Nach dem Waschen die Probe sofort mit einem Stickstofffluss trocknen. Tun Sie dies auf die gleiche Weise wie die Trocknung in der Substratvorbereitung (Schritt 5). Es ist wichtig, die Probe so gründlich wie möglich zu trocknen.
    HINWEIS: Die Dichte der abgelagerten Strukturen und damit die Dichte der Metall-Nanostrukturen kann durch Anpassung der Konzentration von DNA-Origami und Mg2+ in der Abscheidungslösung verändert werden. Höhere Mg2+ Konzentration verbessert die DNA-Origami-Adhäsion und erhöht damit die Dichte, aber es wird schließlich auch agglomeration der DNA-Origami-Strukturen verursachen. Daher sollte in erster Linie die DNA-Origami-Konzentration zuerst angepasst werden.

9. Wachstum der SiO2 Maske (Abbildung 3D)

HINWEIS: Dieser Schritt kann außerhalb des Reinraums ausgeführt werden. Die folgende Version ergibt ein Negativtonmuster, aber es ist möglich, den Prozess zu ändern, um stattdessen ein Positivtonmuster zu ergeben. Der SiO2 Wachstumsprozess wird von Surwade et al.52adaptiert, von den Autoren53weiterentwickelt und schließlich für dieses Protokoll optimiert.

  1. Nehmen Sie einen verschließbaren Trockenschrank (1,5 l), eine Petrischale, die in den Trockenschrank passt (optional) und eine perforierte Platte, die als Plattform im Inneren des Trockenators fungieren kann.
  2. 100 g Kieselgel nehmen und mit 30 g destilliertem Wasser in der Petrischale oder direkt im Trockenbau mischen. Machen Sie diesen Schritt vorzugsweise mindestens 24 h im Voraus, damit sich das Kieselgel stabilisieren kann.
    HINWEIS: Dies wird verwendet, um die Feuchtigkeit im Inneren des Trockenbaus und damit auch die Wachstumsrate und Morphologie der SiO2-Folie zu kontrollieren. Höhere Luftfeuchtigkeit führt zu höherer Rate und gröberer Struktur. Alternativ kann das Kieselgel in einer Klimaprüfkammer ausgehärtet werden.
  3. Das Kieselgel in den Trockenbau geben und mit der perforierten Platte trennen.
  4. Positionieren Sie die Chips mit adsorbiertem DNA-Origami sowie eine offene Durchstechflasche mit (frischen) 10 ml Tetraethylorthosilikat (TEOS) und einer weiteren Durchstechflasche mit 10 ml 25% Ammoniumhydroxid (NH4OH) im Trockenbau, auf der perforierten Plattform. Stellen Sie die Durchstechflaschen in der Nähe und auf den gegenüberliegenden Seiten der Proben ein. Verwenden Sie vorzugsweise einen Kolbenkorken oder einen ähnlichen flachen Sockel, um die Chips leicht von der Plattform zu heben.
    VORSICHT: Sowohl NH4OH als auch TEOS sind bei Hautkontakt schädlich und ihre Dämpfe können sowohl die Augen als auch die Atmungsorgane reizen. In einem gut belüfteten Bereich verwenden und Schutzhandschuhe, Augenschutz und Schutzkleidung tragen.
  5. Versiegeln Sie die Kammer und brüten Sie 20 Stunden bei Raumtemperatur. Dadurch wird ein SiO-2-Film auf den Bereichen wachsen, in denen sich die DNA-Origami-Strukturen nicht befinden, wodurch eine 10-20 nm gemusterte Maske mit DNA-Origami-förmigen Löchern entsteht (Abbildung 4).
  6. Entfernen Sie die Proben nach der Inkubation aus der Kammer. In einem überdachten Container aufbewahren. Die Verarbeitung kann hier angehalten werden. Entsorgen Sie die verwendeten TEOS und NH4OH. Die Charge von Kieselgel kann 2-3 mal verwendet werden, wenn es innerhalb des Trockenators zwischen den Verwendungen versiegelt und innerhalb von 2-3 Wochen verwendet wird.

10. Reaktive Ionenätzung (RIE) von SiO2 und a-Si (Abbildung 3E)

  1. Legen Sie die Chips in die reaktive Ionenätzung (RIE) Ausrüstung.
  2. Richten Sie die Ätzparameter auf nur 2-5 nm SiO2 ein, um die a-Si-Schicht unter den Löchern in der SiO2-Maske zu enthüllen. Für die einzelnen Geräte müssen die genauen Einstellungen experimentell festgelegt werden. Die hier verwendeten Parameter sind in Tabelle 3dargestellt. Führen Sie das anisotrope Plasmaätzprogramm SiO2 aus.
  3. Richten Sie die Ätzparameter ein, um die 50 nm a-Si-Schicht zu durchbohren. Die hier verwendeten Parameter sind wiederum in Tabelle 3dargestellt. Führen Sie das isotrope a-Si Plasmaätzprogramm aus.
  4. Entfernen Sie Proben von RIE-Geräten und lagern Sie sie. Die Verarbeitung kann hier erneut unterbrochen werden.

11. Physikalische Dampfabscheidung (PVD) von Metallen (Abbildung 3F)

  1. Laden Sie die Späne in die Verdampfungskammer des PVD-Instruments.
  2. Wählen Sie ein Zielmetall aus. Wählen Sie zunächst ein Klebstoffmetall. Hier bei2 nm Chrom (Cr) wird verwendet.
  3. Richten Sie das Dickenkontrollprogramm für das Zielmaterial und die Zieldicke ein. Die Steuerungsmethode ist instrumentenabhängig. Hierwird eine Quarzkristall-Mikrobalance (QCM) verwendet. Die gemessene Dicke wird durch die Zielmaterialdichte und den Z-Faktor angepasst und muss durch einen experimentell ermittelten Werkzeugfaktor korrigiert werden, der für das Gerät und jedes Zielmaterial spezifisch ist.
  4. Starten Sie den Elektronenstrahl, richten Sie den Strahl am Ziel aus und erhöhen Sie den Strahlstrom, bis eine Abscheidungsrate von 0,05 nm/s erreicht ist. Verdampfen, bis eine enddauernde Dicke von 2 nm erreicht ist.
  5. Wählen Sie ein zweites Zielmetall (z.B. Gold), ohne die Kammer zu entlüften oder den Prozess zu unterbrechen. Unterbrechungen oder Entlüftungen ermöglichen es dem Klebemetall zu oxidieren und seine Nutzbarkeit als Klebstoff zu verringern.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 11.3 bis 11.4. Verdampfen, bis 20 nm erreicht ist. Dadurch entsteht eine DNA-Origami-förmige Metallstruktur durch die SiO2 Maskenlöcher mit einer Gesamthöhe von 22 nm.
  7. Entlüften Sie die Kammer und entfernen Sie Proben.
  8. Die Verarbeitung kann hier angehalten werden, wenn die Proben verdeckt gelagert werden.

12. Abheben mit Flusssäure (HF) (Abbildung 3G)

  1. Gießen Sie 50% HF-basierte Etchant-Lösung in einen geeigneten Kunststoffbehälter. Für das Gemisch sollte kein HCl verwendet werden, da HCl die Cr in der Probe ätzen würde.
    VORSICHT: HF ist extrem korrosiv, verursacht schwere Reizungen und Verbrennungen und kann bei Hautkontakt oder beim Einatmen tödlich sein. Verwenden Sie HF nur in einer speziellen Dunstabzugshaube oder belüfteten Nassbank mit einer Schutzschürze, chemikalienbeständigen Handschuhen und Gesichtsvisier oder auf andere Weise vollständigen chemischen Schutz.
  2. Die Proben in den HF-basierten Etchant eintauchen und vorsichtig mit einer Kunststoff-Pinzette rühren.
  3. Warten Sie, bis die SiO2-Schicht vollständig ätzt und die Metallschicht sich löst. Die Zeit variiert merklich je nach Dichte der Maskenlöcher. Eine höhere Anzahl von Löchern führt zu einer schnelleren Ätzung. Wenn die Metallschicht schwer abzuziehen ist, kann eine kurze Ultraschallbehandlung für 5 bis 10 s verwendet werden.
  4. Sobald sich der Metallfilm löst, spülen Sie die Proben mit doppelt destilliertem Wasser und Isopropanol ab.
  5. Trocknen Sie die Proben nach dem Spülen auf die gleiche Weise mit einem Stickstofffluss, wie für die Substratvorbereitung angewiesen (Schritt 5). Vermeiden Sie Pinzettenkontakt mit dem Spanzentrum, da dies die gebildeten Nanostrukturen zerstören kann.
    HINWEIS: Proben können hier gespeichert und verarbeitet werden.

13. RIE des verbleibenden a-Si (Abbildung 3H)

  1. Legen Sie die Chips in die reaktive Ionenätzung (RIE) Ausrüstung.
  2. Richten Sie die Ätzparameter ein, um alle 50 nm a-Si gründlich zu entfernen. Die Parameter können die gleichen sein wie in Schritt 10, aber eine etwas längere Ätzzeit (40 s) kann verwendet werden, um die Entfernung aller a-Si zu gewährleisten. Siehe Tabelle 3 für die hier verwendeten Parameter.  Führen Sie das isotrope a-Si Plasmaätzprogramm aus, um verbleibende a-Si zu entfernen.
  3. Entfernen Sie Proben von RIE-Geräten und lagern Sie sie. Damit wird die Probenverarbeitung abgeschlossen.

14. Atomkraftmikroskopie (AFM)

HINWEIS: Atomkraftmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie können verwendet werden, um den Erfolg von Filmwachstum und -musterung zu überwachen sowie um gefaltete DNA-Origami-Strukturen abzubilden (Abbildung 2B,C). Der folgende Beispielvorbereitungsschritt kann übersprungen werden, wenn verarbeitete Proben aus den Schritten 5-13 abgebildet werden.

  1. Probenvorbereitung für AFM
    1. Um die gefaltete DNA-Origami abzubilden, nehmen Sie einen Chip Glimmersubstrat.
    2. Befestigen Sie den Glimmerchip mit einem Klebstoff an einem Glasmikroskopschlitten.
    3. Bereiten Sie 10 l DNA-Origami-Lösung vor, indem Sie den DNA-Origami-Bestand von 20 nM 50 Mal in 1x FOB auf eine Konzentration von etwa 0,4 nM verdünnen. Die Verdünnung wird durchgeführt, um eine Überbelegung des Substrats zu verhindern.
    4. Die oberste Schicht des Glimmerblatts mit schwachem Klebeband abziehen, um eine frisch gespaltete, aufgeladene Oberfläche zu erhalten.
    5. Legen Sie die verdünnte DNA-Origami-Lösung auf den frisch gespalteten Glimmer ab und inkubieren Sie die entnommene Probe 1 min bei Raumtemperatur.
    6. Nach der Inkubation die Oberfläche 3-4 mal mit 100 l destilliertem Wasser mit einer Pipette waschen. Dadurch bleibt nur das richtig adsorbierte Origami auf der Oberfläche.
    7. Legen Sie 100 l destilliertes Wasser auf der Glimmeroberfläche ab.
    8. Neigen und scharf tippen Sie auf das Mikroskop-Dia auf dem Tisch, um den größten Teil des Wassers zu lösen.
    9. Wiederholen Sie diesen Waschzyklus 3-4 mal.
    10. Trocknen Sie die Probe unmittelbar nach dem Waschen gründlich mit einem Stickstofffluss. Die Probe ist dann bereit für die AFM-Bildgebung.
  2. Legen Sie die DNA-Origami-Proben oder die verarbeiteten Chips in einen AFM und führen Sie Scans durch. Eine Scangröße von 1-10 m ist geeignet, um die Strukturen richtig aufzulösen.

15. Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

  1. Legen Sie die Proben in ein SEM. Die verarbeiteten Chips können so verwendet werden, wie sie sind (weitere Probenvorbereitung ist nicht erforderlich).
  2. Wählen Sie die Beschleunigungsspannung aus. Verwenden Sie niedrige Spannungen (5-10 kV), um Ladeeffekte zu reduzieren, da das Probensubstrat (Al2O3 oder SiN) ein Isolator ist.
  3. Scannen Sie alle Interessensgebiete. Minimieren Sie die Scanzeiten, um die Ladung zu reduzieren und die Ablagerung von Verunreinigungen zu vermeiden.

Ergebnisse

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Eine schematische Figur des Bowtie DNA Origami Designs und seiner strukturellen Details sind in Abbildung 1dargestellt. Agarose-Gel-Elektrophorese und AFM werden verwendet, um die DNA-Origami-Faltung und die Qualität der PEG-Reinigung zu analysieren (Abbildung 2). Der Prozessablauf der Nanolithographieschritte ist in Abbildung 3dargestellt. Repräsentative AFM-Bilder nach dem SiO 2-Maskenwachstum sind in Abbildung 4 dargestellt (dieser Schritt ist in Abbildung 3Ddargestellt), während SEM-Bilder der endgültigen Metall-Nanostrukturen in Abbildung 5 zu sehen sind (dieser Schritt ist in Abbildung 5 dargestellt Abbildung 3H). Abbildung 6 zeigt die optische Funktionalität der metallischen Nanostrukturen, die von der Bowtie DNA Origami vorlagen.

Faltpuffer (FOB) Komponentenkonzentrationen [mM]
TrisessigsäureEdtaMagnesiumchloridPh
2.5x FOB10047.52.531.25Nr. 8,3
1x FOB4019112.5Nr. 8,3

Tabelle 1: Zusammensetzung des Faltpuffers (FOB).

Temperaturbereich [oC]Kühlrate
90-70-0.2 °C / 8 s
70-60-0.1 °C / 8 s
60-27-0.1 °C / 2 s
12Halten, bis gestoppt

Tabelle 2: Thermische Rampe für die Fliege Origami Faltung. Nach dem Glühen wird der Origami bei 12 oC gespeichert, bis das Programm manuell gestoppt wird.

PECVD- und RIE-Parameter
gasGasdurchfluss [sccm]Kammerdruck [mTorr]HF-Leistung [W]Temperatur [oC]Dauer [s]
PECVD von a-Si5% SiH4 in N2 50010001525090
O2 PlasmabehandlungO2 5040200301200
RIE von SiO2 CHF3 25
Ar25301002510-22
RIE von a-SiO2 8
SF6 10090503035
RIE der verbleibenden a-SiO2 8
SF6 10090503035-40

Tabelle 3: Prozessparameter für plasmaverstärkte chemische Dampfabscheidung (PECVD) und reaktive Ionenätzung (RIE). Die Prozessparameter für diese Geräte sind spezifisch für einzelne Instrumente und müssen bei Verwendung möglicherweise angepasst werden.

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Abbildung 1: Design der Fliege DNA Origami. (A) Schematische Darstellung des Bowtie-Origami-Designs, bei dem die Kernstruktur als Doppelhelices dargestellt wird und die PolyT-Überhänge als wellenförmige Linien dargestellt werden. (B) Screenshot eines Teils des Bowtie Origami Designs in der caDNAno Software. Die roten Kreuze bezeichnen das Überspringen des Basispaares fürdie Drehkorrektur, und die T 8-Überhänge werden hinzugefügt, um stumpfes Basisstapeln zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Charakterisierung der Bowtie-DNA-Origami-Struktur. (A) Agarose-Gel-Elektrophorese der Bowtie-Struktur vor und nach der Poly-(Ethylenglykol) (PEG) Reinigung. Als Referenz dient das 7249 Nukleotide lange Gerüst. (B) Atomkraftmikroskopie (AFM) Bild der Bogenstrukturen vor der Reinigung. (C) AFM-Bild der Fliegestrukturen nach PEG-Reinigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3:Schema des Fertigungsprozesses (die Abmessungen sind nicht imMaßstab). (A) Würfeln und reinigen Sie das Substrat. (B) Hinterlegung einer a-Si-Schicht durch plasmaverstärkte chemische Dampfabscheidung (PECVD). *Es ist möglich, eine zusätzliche Opferschicht unter dem a-Si zu verwenden, um einen Abheben mit anderen etchant als HF zu ermöglichen. (C) Behandeln Sie die Probenoberfläche mitO2-Plasma und legen Sie DNA-Origami darauf ab. (D) Wachsen Sie die SiO2 Maske im Trockenbau. (E) Ätzen Sie eine dünne Schicht von SiO2 und durch die darunter liegende a-Si durch reaktive Ionenätzung (RIE). (F) Metall durch die Maske durch physikalische Dampfabscheidung (PVD) ablagern. (G) Abheben mit HF. (H) entfernen Sie den restlichen a-Si durch RIE. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Repräsentative AFM-Bilder von SiO2-Filmen mit dem DNA-Origami-förmigen Muster. (A) Der Scanbereich von 10 x 10 m zeigt die hohe Ausbeute der Musterbildung. (B) Ein näherer Scan zeigt die genauen Einzelmuster im SiO2-Film. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Repräsentative Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Bilder von metallischen Nanostrukturen mit strukturell unterschiedlichen DNA-Origami. (A) Kreuzförmige DNA-Origami, d.h. sogenannte Seeman-Fliesenorigami54. (B) Bowtie-Antennen. (C) Chirale Doppel-L-Strukturen (CDL). Insets zeigen individuelle Strukturen mit Kastengrößen von 150 nm x 150 nm. Die Fertigungsausbeute exakter Strukturen beträgt bis zu 76% für die Fliege Origami undfür die anderen hier dargestellten Strukturen 50%. Diese Figur wurde von Shen et al.34angepasst und modifiziert. Die Figur wird mit Genehmigung der Autoren reproduziert und von der American Association for the Advancement of Science, 2018 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Repräsentative optische/funktionelle Eigenschaften der resultierenden Nanostrukturen. (A) Lokalisierte Oberflächen-Plasmonresonanz (LSPR) Messungen einer individuellen Gold-Bogenstruktur mit unterschiedlicher Polarisation (Farbe kodiert als orange und blau). Die durchgezogenen Linien sind gemessene Spektren und die gestrichelten Linien sind Simulationsergebnisse. Insets zeigen das SEM-Bild des gemessenen Partikels (links) und das modell, das für die Simulation verwendet wird (rechts). (B) Oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) von Rhodamin 6G und 2,2-Bipyridin, gemessen auf einer Oberfläche, die mit Fliege-Nanostrukturen bedeckt ist. Die Basislinie jeder Probe zeigt den Signalpegel, wenn die Nanostrukturen fehlten. Diese Figur wurde von Shen et al.34angepasst und modifiziert. Die Figur wird mit Genehmigung der Autoren reproduziert und von der American Association for the Advancement of Science, 2018 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Ergänzende Datei 1: CaDNAno Datei Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Ergänzende Datei 2: m13mp18 Sequenz Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Ergänzende Datei 3: Heftstrang Sequenz Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

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Das Protokoll bietet große Freiheit und Genauigkeit in Form von produzierten Nanostrukturen. Durch die Änderung des Designs der DNA-Origami kann die Form der Metall-Nanostrukturen gesteuert werden. Die endgültige, exakte Form der Metallstrukturen wird zusätzlich durch den Maskenwachstumsschritt (Schritt 9) und in geringerem Maße durch die Maskenätzung (Schritt 10) bestimmt, sollte sie nicht anisotrop sein. Wenn die Maskenwachstumszeit genug verlängert wird, beginnen die Löcher in der Maske geschlossen zu wachsen. Dies kann verwendet werden, um die dünnsten Merkmale einiger Strukturen wegzulassen und Spaltgrößen zu kontrollieren, wie in Shen et al.34 mit getrennten Dreiecken der Fliege Origami (Abbildungen 5B) gezeigt. Umgekehrt können dünnere Formen besser erhalten werden, indem die Oxidwachstumszeit verkürzt wird. Dies bedeutet, dass es möglich ist, die in Abbildung 6dargestellten optischen Eigenschaften zu optimieren, nicht nur durch Änderung des verwendeten Origami-Designs, sondern auch durch Die Optimierung des SiO 2-Filmwachstums.

Wenn sich die Maskendicke deutlich ändert, muss diese Änderung auch im SiO2 RIE-Schritt widergespiegelt werden. Nur eine sehr dünne Schicht von SiO2 sollte geätzt werden (2-5 nm), um kaum durch die Maskenlöcher zu durchdringen. Dies ist der sensibelste und wichtigste Teil des gesamten Prozesses. Da die Ätzzeit extrem kurz ist, nur 10-20 s, müssen beim ersten Versuch mit neuen Geräten experimentell genaue Einstellungen ermittelt werden. Dies gilt auch für Schritt 10.4, da einige SiO2 auch während der a-Si Radierung geätzt werden. Der Umfang des geätzten SiO2 wird durch die Selektivität der verwendeten a-Si Etch Parameter, Geräte und sogar individuelle Gerätekalibrierungen bestimmt. Es sollte darauf geachtet werden, dass während dieser beiden Prozesse nicht die gesamte SiO2-Schicht weggeätzt wird.

Ein weiterer sensibler Schritt ist das SiO 2-Wachstum. Der Wachstumsprozess ist sowohl von der Kammerfeuchtigkeit als auch von der aktuellen Aktivität des verwendeten TEOS abhängig. TEOS degradiert, wenn es Wasser aus der Luft adsorbiert, wodurch es mit dem Alter weniger wirksam wird. Dies kann sich als deutlich langsamere, weniger kontrollierbare Wachstumsrate innerhalb von Monaten manifestieren, selbst bei ordnungsgemäßer Lagerung der Chemikalie. 34 Wenn die resultierende SiO2-Schicht dünner als vorgesehen ist, kann dies auf ein Problem mit TEOS und nicht auf Kammerfeuchtigkeit hinweisen. Während eine niedrigere Luftfeuchtigkeit auch zu einer geringeren Wachstumsrate und einem dünneren Film führen kann, sollte die resultierende Folie auch glatter als normal sein. In der Zwischenzeit würde eine grobkörnige und grobe Schicht umgekehrt auf ein Problem mit hoher Luftfeuchtigkeit hinweisen.

Es ist auch möglich, dieses Protokoll auf jedem anderen frei gewählten Substrat mit zwei Anforderungen durchzuführen: Es muss sowohl HF-Ätzen (Schritt 12) als auch die 200-300 °C-Temperaturen von PECVD (Schritt 6) vertragen. Die Temperatur kann für den PECVD von a-Si sicher auf 100 °C gesenkt werden, wenn ein empfindlicheres Substrat verwendet wird, aber HF kann nicht vermieden werden, wenn das Protokoll genau wie beschrieben befolgt wird. Um HF zu umgehen, wäre die Anwendung einer zusätzlichen Opferschicht erforderlich. Wenn die Anforderung der HF-Ätzung entfernt wird, würde dieses Protokoll mit einer breiteren Auswahl an Substratmaterialien und Metallen kompatibel werden.

Da dieses Protokoll aus häufig verwendeten und robusten Mikro- und Nanofertigungverfahren besteht, könnte es mit einer beliebigen Anzahl anderer Mikrofabrikationsprotokolle kombiniert werden, bei denen kleine Merkmalsgrößen und komplexe Metallformen gewünscht werden. In naher Zukunft, insbesondere mit der Einführung von low-cost DNA Origami Massenproduktion31, gibt es Potenzial für diese Methode, sowohl allgemeine Verwendung und High-Throughput Nanopatterning für schnittstellenbasierte Nanophotonik und Plasmonik zu erleichtern55 .

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Akademie Finnlands (Projekte 286845, 308578, 303804, 267497), der Jane and Aatos Erkko Foundation und der Sigrid Jusélius Foundation unterstützt. Diese Arbeiten wurden im Rahmen des Exzellenzprogramms der Akademie Finnlands (2014–2019) durchgeführt. Wir würdigen die Bereitstellung von Einrichtungen und technische Unterstützung durch Aalto University Bioeconomy Facilities und OtaNano – Nanomicroscopy Center (Aalto-NMC) und Micronova Nanofabrication Center.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AcetonHoneywell40289HULSI in Halbleiterqualität, ≥ 99,5 %
Agarose Fisher Bioreagents1036603mit niedrigem EEO-Gehalt, Mehrzweck und Molekularbiologie
Fisher Chemical1065225125 % Ammoniaklösung, zertifiziert AR für die Analyse, d = 0,91
BRANSON 5510BransonUltraschallbad
Dimension IconBrukerRasterkraftmikroskop
Elektronenstrahlverdampfer IM-9912Instrumentti MattilaVerdampfer für PVD
EthidiumbromidSigma AldrichE8751Fluoreszenzfarbstoff für die DNA-Färbung
Eon Mikrotiterplatten-SpektralphotometerBioTekUV/Vis-Spektralphotometer für DNA-Origami-Konzentrationsmessungen
Gel Doc XR+ DokumentationssystemBioRadGel Imaging System
Gel Loading Dye, Blau (6&fach;)New England BiolabsB7021SBromphenolblau-basierter Ladefarbstoff für die Agarose-Gelelektrophorese
G-storm GS1 ThermocyclerGene Technologies
HBR 4IKAHeizbad
FlusssäureHoneywell40213HHalbleiterqualität, 49,5-50,5 %
IsopropanolHoneywell40301HHalbleiterqualität VLSI, ≥ 99,8 %
MagnesiumchloridSigma AldrichM8266wasserfrei > 98 %
Mini-Sub Cell GT Horizontales ElektrophoresesystemBioRad
Plasmalab 80+ PECVDOxford InstrumentsPECVD-System
Plasmalab 80+ RIEOxford InstrumentsRIE-System
Poly(ethylenglykol)Sigma Aldrich89510BioUltra, 8.000
PowerPac HC Hochstrom-NetzteilBioRad
Saphir-Substrat (Al2O3)Wafer-Dicke: 430 μ m, Politur: DSP, Größe: 50,8 mm
Sigma VPZeissRasterelektronenmikroskop
KieselgelMerck1019691000Mit Indikator (orangefarbenes Gel), Granulat ~1-3 mm
Einzelsträngiges Gerüst DNA, Typ p7249Tilibit NanosystemeBei 100 nM Konzentration
NatriumchloridSigma AldrichS9888ACS Reagenz, ≥ 99,0 %
Stapelstränge (Oligonukleotide)Integrierte DNA-TechnologienSequenzen können z.B. bei 100 Mikromolaren in Rnase-freiem Wasser bestellt werden
TAE-Puffer (50-fach;) pH 8,0 VWRChemicals444125DElectran Elektrophorese-Qualität
Take3 MikrovolumenplatteBioTekWird für DNA-Origami-Konzentrationsmessungen
TetraethylorthosilikatSigma Aldrich86578 99,0 % (GC)
Ammoniumhydroxid der Universität verwendet

Referenzen

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