Gleichzeitige zytometrische Charakterisierung mehrerer Zelltypen, die durch verschiedene Homogenisierungsmethoden aus dem Maushirn/Spinalcord abgerufen wurden

Summary

Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-Methode, um gleichzeitig verschiedene Zelltypen zu identifizieren, die aus dem Gehirn oder Rückenmark der Maus abgerufen wurden. Diese Methode könnte genutzt werden, um reine Zellpopulationen bei neurodegenerativen Erkrankungen zu isolieren oder zu charakterisieren oder das Ausmaß der Zellausrichtung bei der In-vivo-Verabreichung von viralen Vektoren oder Nanopartikeln zu quantifizieren.

Abstract

Jüngste Fortschritte in den viralen Vektor- und Nanomaterialwissenschaften haben den Weg für neue innovative Ansätze zur Untersuchung oder Manipulation des Zentralnervensystems (ZNS) geebnet. Eine weitere Optimierung dieser Technologien würde jedoch von Methoden profitieren, die eine schnelle und schlanke Bestimmung des Ausmaßes von ZNS und zellspezifischem Targeting bei verabreichung von viralen Vektoren oder Nanopartikeln im Körper ermöglichen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die hohen Durchsatz- und Multiplexing-Fähigkeiten der Durchflusszytometrie nutzt, um eine einfache Quantifizierung verschiedener Zellsubtypen zu ermöglichen, die aus dem Gehirn oder Rückenmark der Maus isoliert sind, nämlich Mikroglia/Makrophagen, Lymphozyten, Astrozyten, Oligodendrozyten, Neuronen und Endothelzellen. Wir wenden diesen Ansatz an, um kritische Unterschiede zwischen zwei Gewebehomogenisierungsmethoden in Bezug auf Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Zusammensetzung hervorzuheben. Dies könnte den Benutzer anweisen, die beste Methode zu wählen, abhängig von den von Interesse sindden Zelltypen und der spezifischen Anwendung. Diese Methode eignet sich nicht für die Analyse der anatomischen Verteilung, da das Gewebe homogenisiert ist, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Es ermöglicht jedoch die Arbeit mit lebensfähigen Zellen und kann mit zellsortierung kombiniert werden, was den Weg für mehrere Anwendungen öffnet, die das Repertoire an Werkzeugen in den Händen des Neurowissenschaftlers erweitern könnten, von der Etablierung von Primärkulturen aus reinen Zellpopulationen bis hin zu Genexpressionsanalysen und biochemischen oder funktionellen Assays zu gut definierten Zellsubtypen im Kontext neurodegenerativer Erkrankungen, zur pharmakologischen Behandlung oder Gentherapie.

Introduction

Gen- und Medikamentenabgabetechnologien (wie virale Vektoren und Nanopartikel) sind zu einem leistungsfähigen Werkzeug geworden, das angewendet werden kann, um bessere Einblicke in spezifische molekulare Pfade zu gewinnen, die bei neurodegenerativen Erkrankungen verändert wurden, und für die Entwicklung innovativer therapeutischer Ansätze^1,2,3. Die Optimierung dieser Werkzeuge beruht auf der Quantifizierung von: (1) dem Ausmaß der Penetration im ZNS auf verschiedenen Verabreichungswegen und (2) der Ausrichtung auf bestimmte Zellpopulationen. Histologische Analysen werden in d....

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Dana Farber Cancer Institute (Protokollnummer 16-024) genehmigt.

1. Vorbereitung der für das Experiment erforderlichen Lösungen

1. Bereiten Sie 1x Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS) vor, indem Sie 10x HBSS mit sterilem Wasser verdünnen. Die Lösung auf Eis vorkühlen. Für jede Probe werden mindestens 25 ml Lösung benötigt.
2. Bereiten Sie isotonische Percoll-Lösung (IPS) durch Mischen von 10x sterilem HBSS 1:10 mit Dichtegradientenmedium (d.h. Percoll) vor. Vorchill auf Eis.
   HINWEIS: IPS kann bis zu 30 Tage bei 4 °C gelagert w....

Results

Wir verglichen zwei verschiedene Homogenisierungsmethoden (DH versus PD), die auf Das Maushirn und Rückenmark angewendet wurden, um die Effizienz beim Abrufen verschiedener lebensfähiger Zelltypen zu testen, die für nachgelagerte Anwendungen geeignet sind. Dazu nutzten wir ein 9-farbiges Flow-Zytometrie-Panel, das verschiedene ZNS-Zelltypen wie Mikroglia, Lymphozyten, Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Endothel charakterisieren soll.

Hirn- und Rückenmarksgewebe wurden von verschiedenen.......

Discussion

Hierin beschreiben wir ein Protokoll zur Koreinigung und parallelen zytometrischen Analyse von einigen der relevantesten ZNS-Zellen aus Demhirn und Rückenmark. Traditionell wurden histologische Analysen durchgeführt, um die Verteilung von Nanopartikeln oder die Transduktionseffizienz viraler Vektoren im ZNS^5,13zu beschreiben oder Um Erkenntnisse über morphologische und molekulare Veränderungen zu geben, die in bestimmten Zelltypen während einer Pathologie oder be.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (frei von Calcium-, Magnesiumchlorid- und Magnesiumsulfat)	Gibco	14185-052
70 mm Zellsieb	Corning	431751
ACSA/ACSA2 Anti-Maus-Antikörper	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC konjugiertes
Rinderserumalbumin	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b Ratten-Anti-Maus-Antikörper	Invitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 konjugierter
CD31-Anti-Maus-Antikörper für Ratten	BD	Bioscience 562939	BV421 konjugierter
CD45-Anti-Maus-Antikörper für Ratten	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510 konjugierter
CD90.1/Thy1.1-Anti-Maus-Antikörper für Ratten	Biolegend	202518	PE/Cy7-konjugierter
CD90.2/Thy1.2-Anti-Maus-Antikörper	für RattenBiolegend	1005325	PE/Cy7 konjugierte
konische Röhrchen (15 mL)	CellTreat	229411
konische Röhrchen (50 mL)	CellTreat	229422
Dounce Tissue Grinder Set (Enthält Mörser sowie Stößel A und B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block Ratte Anti-Maus Antikörper	BD Pharmingen	553142
Fötales Rinderserum	Benchmark	100-106
Dissoziationskit für Nervengewebe (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 Anti-Maus/Ratte/Human-Antikörper	Miltenyi Biotec	130-095-895	Biotin-konjugiertes
Percoll	GE Healthcare	10266569	als nicht steriles Reagenz
Percoll	Sigma 65455529		verkauftsteriles Reagenz (zur Verwendung für Anwendungen, die Sterilität erfordern)
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	Reagenz mit sehr geringen Spuren von Endotoxin
Streptavidin	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 konjugiert