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Methodenartikel

Kontusion Rückenmarksverletzung über eine mikrochirurgische Laminektomie im Regenerativen Axolotl

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DOI:

10.3791/60337

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20. Oktober 2019

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 2Department of Neurosurgery, Aarhus University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript enthält Protokolle zur chirurgischen Zufügung kontrollierter stumpfer und scharfer Rückenmarksverletzungen zu einem regenerativen Axolotl (Ambystoma mexicanum).

Zusammenfassung

Der Zweck dieser Studie ist es, ein standardisiertes und reproduzierbares regeneratives stumpfes Rückenmarksverletzungsmodell im Axolotl (Ambystoma mexicanum) zu etablieren. Die meisten klinischen Rückenmarksverletzungen treten als hochenergetische stumpfe Traumata auf, die Prellungen verursachen. Jedoch, die meisten Studien in der Axolotl Rückenmark wurden mit scharfen Traumata durchgeführt. Daher zielt diese Studie darauf ab, ein klinisch relevanteres regeneratives Modell zu erstellen. Aufgrund ihrer beeindruckenden Fähigkeit, fast jedes Gewebe zu regenerieren, werden Axolotle häufig als Modelle in regenerativen Studien verwendet und wurden ausgiebig in Rückenmarksverletzungen (SCI) Verwendet. In diesem Protokoll werden die Axolotle durch Untertauchen in eine Benzocainlösung anästhetiert. Unter dem Mikroskop wird ein Winkelschnitt bilateral auf einer Ebene gemacht, die nur kaudal zu den Hinterbeinen ist. Aus diesem Schnitt ist es möglich, die spinösen Prozesse zu sezieren und zu entlarven. Mit Zangen und Schere wird eine zweistufige Laminektomie durchgeführt, die das Rückenmark freilegt. Ein benutzerdefiniertes Traumagerät, das aus einer fallenden Stange in einem Zylinder besteht, ist konstruiert, und dieses Gerät wird verwendet, um eine Prellungsverletzung des Rückenmarks zu induzieren. Die Schnitte werden dann vernässt, und das Tier erholt sich von der Anästhesie. Der chirurgische Ansatz ist erfolgreich bei der Exposition des Rückenmarks. Der Traumamechanismus kann Prellungen am Rückenmark hervorrufen, wie durch Histologie, MRT und neurologische Untersuchung bestätigt wird. Schließlich regeneriert sich das Rückenmark von der Verletzung. Der entscheidende Schritt des Protokolls besteht darin, die spinalen Prozesse zu entfernen, ohne das Rückenmark zu beschädigen. Dieser Schritt erfordert Schulungen, um ein sicheres Verfahren zu gewährleisten. Darüber hinaus ist der Wundverschluss in hohem Maße davon abhängig, dass die Haut beim Einschnitt nicht unnötig beschädigt wird. Das Protokoll wurde in einer randomisierten Studie mit 12 Tieren durchgeführt.

Einleitung

Das übergeordnete Ziel dieser Studie war es, eine kontrollierte und reproduzierbare mikrochirurgische Methode zu etablieren, um dem Axolotl (Ambystoma mexicanum)stumpfes und scharfes SCI zuzufügen, wodurch ein regeneratives Rückenmarksverletzungsmodell produziert wird.

SCI ist eine schwere Erkrankung, die, je nach Niveau und Ausmaß, neurologische Behinderung der Extremitäten zusammen mit beeinträchtigter Blasen- und Darmkontrolle1,2,3verursacht. Die meisten SCI sind das Ergebnis von hochenergetischen stumpfen Traumata wie Verkehrsunfällen und Stürzen4,5. Scharfe Verletzungen sind sehr selten. Daher ist der häufigste makroskopische Verletzungstyp Prellungen.

Das Säugetier-Zentralnervensystem (ZNS) ist ein nicht-regeneratives Gewebe, daher wird keine Wiederherstellung des neurologischen Gewebes nach SCI gesehen6,7,8. Auf der anderen Seite haben einige Tiere eine faszinierende Fähigkeit, Gewebe zu regenerieren, einschließlich ZNS-Gewebe. Eines dieser Tiere ist das Axolotl. Es ist weit verbreitet in Studien der regenerativen Biologie und ist von Interesse in der Rückenmarksregeneration, weil es ein Wirbeltier9,10,11,12ist.

Die meisten SCI-Studien im Axolotl werden entweder als Amputation des gesamten Schwanzes oder als Ablation eines größeren Teils des Rückenmarks9,10,11,12durchgeführt. Kürzlich wurde eine neue Studie über stumpfe Verletzungenveröffentlicht 13, die klinische Situationen besser imitiert. Während eine vollständige Anbelagamputation im Axolotl zu einer vollständigen Regeneration führt, sind einige nicht amputationsbasierte regenerative Phänomene vom kritischen Größenfehler (CSD)14,15abhängig. Dies bedeutet, dass Verletzungen, die einen kritischen Schwellenwert überschreiten, nicht regeneriert werden. Um ein regeneratives Modell mit einem höheren klinischen Translationswert zu entwickeln, untersuchte diese Studie, ob ein 2 mm stumpfes Trauma die CSD-Grenze überschreiten würde.

Diese Methode ist relevant für Forscher, die an der Rückenmarksregeneration in Kleintiermodellen arbeiten, insbesondere im Axolotl. Darüber hinaus kann es von allgemeinem Interesse sein, weil es eine Möglichkeit zeigt, Standard-Laborgeräte zu verwenden, um einen stumpfen Traumamechanismus zu entwickeln, der für den Einsatz bei Kleintieren im Allgemeinen geeignet ist.

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Protokoll

Alle anwendbaren institutionellen und staatlichen Vorschriften über den ethischen Gebrauch von Tieren wurden in dieser Studie befolgt. Die Studie wurde unter der Zulassungs-ID 2015-15-0201-0061 von der dänischen Tierversuchsinspektion durchgeführt. Tiere waren mexikanische Axolotle (Ambystoma mexicanum, mittlere Körpermasse s STD: 12,12 g bei 1,25 g).

1. Vorbereitung

  1. Axolotl für die Anästhesie vorbereiten.
    1. Verwenden Sie hochwertiges, nicht chemisch behandeltes Leitungswasser. Wenn sie nicht verfügbar sind, verwenden Sie die Lösung von 40% Holtfreter.
    2. 200 mg Ethyl 4-Aminobenzoat (Benzocain) in 3 ml Aceton auflösen. Lösen Sie diese Lösung in 1 L Leitungswasser oder 40% Holtfreters Lösung auf.
  2. Verwenden Sie eine Standard-Petrischale (100 mm Durchmesser), die unter einem Stereomikroskop als Operationstisch platziert wird. Legen Sie ein chirurgisches Textiltuch auf die Petrischale.
    HINWEIS: Die Verwendung einer Petrischale als operationsionlicher Bereich ermöglicht das Bewegen und Drehen des Tieres, ohne es zu berühren, wodurch die Wirbelsäulenstabilität während der Operation gewährleistet wird.
  3. Bereiten Sie alle sterilen mikrochirurgischen Instrumente (z. B. Schere und anatomische Zangen) vor.

2. Anästhesie

  1. Legen Sie das Axolotl ca. 45 min in einen Behälter mit Benzocainlösung, um eine tiefe und stabile Anästhesie zu gewährleisten.
    HINWEIS: Die gegebene Konzentration von Benzocain verursacht Anästhesie in allen Größen von Axolotlen.
  2. Überprüfen Sie innerhalb von 30-45 min auf Anzeichen einer Vollnarkose. Dazu gehören ein völliger Mangel an Kiemenbewegungen, Rechtsreflex oder Reaktion auf taktile oder schmerzhafte Reize (sanftes Kneifen der Zehenbahn).
  3. Um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, wickeln Sie die Tiere in Papiertücher, die in der Anästhesielösung benetzt sind. Befeuchten Sie diese regelmäßig mit dieser Lösung während des chirurgischen Eingriffs, um sicherzustellen, dass die Haut und Kiemen feucht gehalten werden.
  4. Erholen Sie das Tier nach der Operation, indem Sie es in einen Behälter mit frischem Leitungswasser legen. Beobachten Sie Anzeichen der Erholung, wie Kiemenbewegung und wiedergewonnenen Rechtenreflex, innerhalb von 1 h16.

3. Mikrochirurgische Laminektomie

HINWEIS: Die Laminektomie wird unter einem Stereomikroskop durchgeführt.

  1. Legen Sie das Tier in die anfällige Position auf der Petrischale. Wickeln Sie es in Papiertücher, so dass der Schwanz ausgesetzt ist.
    HINWEIS: Die Papiertücher eignen sich hervorragend, um die Stabilität während des gesamten Verfahrens zu gewährleisten.
  2. Identifizieren Sie die Hinterbeine. Machen Sie den ersten Schnitt nur kaudal zu ihnen.
    1. Mit einer Mikroschere, führen Sie einen vertikalen Schnitt aus dem Kiel, bis die knöcherne Prominenz der spinösen Prozesse gefühlt werden.
      HINWEIS: Seien Sie sehr vorsichtig, wenn Sie den Kiel und die Haut mit Zangen greifen, da diese leicht Schäden an der empfindlichen Haut zufügen.
    2. Erweitern Sie den Schnitt seitlich, so dass der Schnitt die gesamte Breite des Schwanzes durchquert.
    3. Greifen Sie den spinösen Prozess mit Zangen, um die richtige Tiefe zu gewährleisten.
    4. Verlängern Sie die vertikalen Einschnitte 1 mm unterhalb des Spinnprozesses auf beiden Seiten.
  3. Legen Sie das Tier auf eine Seite, um ventrale und horizontale Schnitte durchzuführen, wie unten angegeben.
    1. Mit einer Mikroschere, beginnend vom ventralen Punkt des vertikalen Schnitts, machen Sie einen horizontalen Schnitt von etwa 15 mm für Tiere 10-20 g Gewicht. Machen Sie den Schnitt länger für größere Tiere und kürzer für kleinere Tiere.
    2. Mit der Schere, sezieren Sie medial durch den horizontalen Schnitt, bis die Wirbelsäule in der Mittellinie gefühlt wird.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 3.3, 3.3.1 und 3.3.2 auf der anderen Seite des Tieres.
  4. Nachdem sie in der tiefen medialen Ebene von beiden Seiten seziert haben, sezieren Sie durch die Mittellinie und verbinden so die beiden horizontalen Einschnitte.
    1. Bewegen Sie das freie Stück Schwanz und Kiel auf eine Seite, die spinösen Prozesse(Abbildung 1).
    2. Fixieren Sie das Schwanzstück mit nassen Papiertüchern.
  5. Setzen Sie das Tier wieder in die anfällige Position mit dem Kopf, der der nicht-dominanten Seite des Chirurgen zugewandt ist.
    1. Mit einem Paar Zange, erfassen Sie die spinösen Prozesse nur kaudal zu den Hinterbeinen. Tragen Sie einen sanften Aufzug sowohl nach oben als auch in Richtung des Kopfes des Tieres auf.
    2. Legen Sie die Klingen einer Mikroschere horizontal um den Prozess und schneiden Sie sie vorsichtig. Der Aufzug des Prozesses stellt sicher, dass er nun entfernt wird, wodurch das Rückenmark freigelegt wird.
    3. Greifen Sie den spinösen Prozess nur kaudal zu dem, der gerade entfernt wurde, und wiederholen Sie die Schritte 3.5.1 und 3.5.2.
      HINWEIS: Dadurch sollte ein exponiertes Rückenmark hinterlassen werden, das zwei Wirbelebenen entspricht. Bei der Laminektomie erscheint oft ein weißes schaumiger Sekret. Das Rückenmark ist leicht durch seinen unverwechselbaren Glanz zu erkennen, zusammen mit einem Gefäß entlang der Mittellinie.
    4. Je nach Größe des Tieres ist die exponierte Fläche möglicherweise nicht breit genug. Mit zwei Zangenpaaren greifen Sie die Laminae auf beiden Seiten des Rückenmarks und drehen diese seitlich mit einer sanften Bewegung.

4. Einführung einer Verletzung des Konfusentyps (Abbildung 2)

  1. Halten Sie das Tier in der anfälligen Position.
  2. Verwenden Sie die Petrischale, um das Tier auf die Traumaeinheit zu übertragen.
  3. Lassen Sie einen Assistenten eine Taschenlampe auf das Rückenmark leuchten.
  4. Platzieren Sie den Zylinder der Konfusionstraumaeinheit über dem freiliegenden Rückenmark mit den Mikrojustierern auf dem Gerät. Ziel durch den Zylinder.
  5. Senken Sie den Zylinder, bis er mit der Laminae eben ist.
  6. Befestigen Sie die fallende Stange am Elektromagneten. Legen Sie den gewünschten Fallhöhenverstellzylinder auf die Traumaeinheit.
  7. Legen Sie die fallende Stange in den Zylinder.
    HINWEIS: Für eine blinde Studie sollte der Chirurg nun den Raum verlassen, ohne zu wissen, ob das Tier einer Verletzung oder einer Scheinchirurgie-Gruppe zugeordnet wird.
  8. Schalten Sie den Elektromagneten aus. Die Stange fällt auf das freigelegte Rückenmark.
  9. Verwenden Sie die Höhenverstellungsschraube, um die Stange vom Rückenmark zu heben.
  10. Bestätigen Sie die Verletzung, indem Sie das Rückenmark durch das Mikroskop betrachten. Die verletzte Stelle wird dunkler erscheinen, und Blutungen aus dem Mittelliniengefäß werden sichtbar sein.

5. Einführung einer scharfen Verletzung

HINWEIS: Führen Sie diese Schritte nach 3.5.4 aus.

  1. Mit einer Mikroschere schneiden Sie das Rückenmark in einem perfekten vertikalen Schnitt.
  2. Wiederholen Sie den Schnitt 2 mm auf die kaudale Seite des Körpers.
    HINWEIS: Die Länge des entfernten Rückenmarksstücks kann entsprechend der Studienanforderung angepasst werden. Ein 2 mm Schnitt ist jedochum 10wiederzurechnen.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Schnitte abgeschlossen sind. Nach der Fertigstellung spüren Sie die Klingen der Schere, die entlang des ventralen Teils des Rückenmarkskanals kratzen.
  4. Heben Sie das 2 mm Rückenmark aus dem Rückenmarkskanal.

6. Schließen der chirurgischen Wunde

  1. Bringen Sie das Tier auf den OP-Tisch zurück. In einer blinden Studie, positionieren Sie den Kiel, so dass das Rückenmark für den Chirurgen nicht sichtbar ist.
  2. Halten Sie das Tier in der anfälligen Position.
    1. Beginnen Sie mit der Platzierung von 10,0 Nylonnähten aus dem kaudalsten Teil des horizontalen Schnitts. Schließen Sie die Wunden in einer Schicht.
      HINWEIS: Greifen Sie die Haut nicht zu eng, weil sie Nekrose verursachen wird.
    2. Arbeiten Sie auf den vertikalen Teil des Schnittes hin.
    3. Wenn Sie den Winkel erreichen, drehen Sie die Petrischale und veransähen Sie den anderen horizontalen Schnitt.
    4. Stellen Sie Nähte auf die vertikalen Schnitte.
    5. Legen Sie keine Nähte in den obersten Teil des Kiels, weil die Haut hier nicht halten kann.

7. Rückgabe des Tieres an die anästhetische Lösung

  1. Heben Sie die Petrischale mit dem Tier an und tauchen Sie beide sehr sanft in frisches Wasser, das nur 5 cm tief ist, und lassen Sie das Tier abgleiten.
    HINWEIS: Die flache Wassertiefe sorgt dafür, dass das Tier nicht versucht, an die Oberfläche zu schwimmen, um zu atmen.
  2. Wechseln Sie das Wasser nicht während der ersten Woche.
  3. Achten Sie bei der Fütterung der Tiere darauf, dass das Futter in der Nähe des Kopfes des Tieres platziert wird.
    HINWEIS: Ziel dieser Maßnahmen ist es, in der ersten Woche so viel Bewegung wie möglich zu vermeiden.

8. Postoperativer Ultraschall

  1. Verwenden Sie vor Beendigung der Anästhesie ein hochfrequentes Ultraschallsystem, um Bilder der Verletzung zu erfassen, die für den Bau dreidimensionaler Bilder des SCI-Standorts verwendet werden können.
  2. Befestigen Sie den Messumformer an einem Mikromanipulator, vorzugsweise mit einem entfernten Joystick gesteuert.
  3. Tauchen Sie das anästhesierte Tier in der anfälligen Position in einen kleinen Behälter mit Anästhesielösung gefüllt.
    HINWEIS: Befestigen Sie das Tier mit Miniatur-Sandsäcken oder anderen Geräten, um Bewegungen während der Scansequenz zu vermeiden.
  4. Richten Sie die Spitze des Messumformers an der Längenachse des Tieres aus und tauchen Sie sie in die Benzocainlösung ein, bis sie nur wenige Millimeter über dem Kiel hinter den Hinterbeinen des Tieres liegt.
  5. Identifizieren Sie die SCI-Site.
    HINWEIS: Die Verletzungsstelle ist durch die fehlenden Spinnprozesse direkt über dem SCI leicht erkennbar.
  6. Optimieren Sie das Bild, indem Sie die Ultraschalleinstellungen anpassen. Stellen Sie sicher, dass sich der SCI-Standort in der Mitte des Bildes befindet. Passen Sie das Sichtfeld (d. h. Bildtiefe, Tiefenversatz und Bildbreite) an, um die SCI-Site und das angrenzende gesunde Gewebe abzudecken. Passen Sie die zweidimensionale Verstärkung an, um den Bildkontrast zu optimieren.
  7. Durch Das Fegen des Ultraschallwandlers über den SCI-Standort mit einem elektronisch betriebenen Mikromanipulator, erfassen Sie B-Modus-Bilder, die den SCI-Standort an mehreren sagittalen Querschnittsstellen abdecken, mit aufeinanderfolgenden Scheiben mit einem Interslice-Intervall. von 50 m. Erfassen Sie Cine-Bilder mit 500 Bildern mit einer Bildrate von 50 Frames/s und einer Wandlerfrequenz von 40 MHz.
    HINWEIS: Für dieses Setup ist ein elektronischer Mikromanipulator erforderlich, der von einem entfernten Joystick gesteuert wird (Schritt 8.2).
  8. Nach Abschluss der Scansequenz kehren Sie zu Schritt 7 zurück.

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Ergebnisse

Der Zweck des Protokolls ist es, einen SCI zu produzieren, der den Motor und sensorische Funktionen lähmt, die der Verletzung zunichte machen. Da das Axolotl regenerationsfähig ist, stellt es die Funktion innerhalb von Wochen wieder her, so dass Forscher die ZNS-Regeneration während eines kurzen Zeitraums untersuchen können.

Anästhesie wurde für 45 min für alle Tiere zur Verfügung gestellt, und keine Episoden der Früherholung wurden erlebt. Alle Tiere erholten sich innerhalb einer Stunde und z...

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Diskussion

Da das Verletzungsrisiko des Rückenmarks erheblich ist, sind die entscheidenden Schritte des Protokolls die Entfernung der spinalen Prozesse und die Erweiterung des knöchernen Zugangs zum Rückenmarkskanal, falls erforderlich. Wie im Protokoll erwähnt, ist das Entfernen des kranialsten Prozesses zuerst sehr zu empfehlen. Dies bedeutet, dass die kaudalen Prozesse das Rückenmark davor schützen, von der Schere getroffen zu werden. Es wird empfohlen, genügend chirurgischen Zugang zu gewährleisten, was bedeutet, dass nicht zu ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Michael Pedersen, Universität Aarhus für sein Know-how und Zeit bei der Entwicklung von MRT-Protokollen und der Einrichtung des gesamten Projekts. Peter Agger, Universität Aarhus für seine Expertise und Zeit bei der Entwicklung der MRT-Protokolle. Steffen Ringgard, Universität Aarhus für seine Expertise und Zeit bei der Entwicklung der MRT-Protokolle. Die Entwicklung des SCI-Modells im Axolotl wurde freundlicherweise von der A.P. M. Maersk Foundation, der Riisfort Foundation, der Linex Foundation und der ELRO Foundation unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
25 g Custom FallstabCustom Home Made
30 mm PVC RohrCustom Home Made
AcetonSigma-Aldrich67-64-1Propanon
Axolotl (Ambystoma mexicanum)Exoterra GmbHN/A12-22 cm und 10 g - 80 g, Alle Stämme (Wildtyp, Melanoid, Weiß, Albino, Transgenes Weiß mit GFP)
BenzocainSigma-Aldrich94-09-7Ethyl-4-aminobenzoat
Electromagetcustom home made
Excel 2010MicrosoftN/AExcel 2010 oder neuer
ImageJNational Institutes of HealthImageJ 1.5e oder neuer. Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Mikrochirurgische InstrumenteN/AN/APinzette und Schere
MS550sFujifilm, VisualsonicsMS550s40 MHz Mittenfrequenz, Schallkopf
MS700Fujifilm, VisualsonicsMS70050 MHz Mittenfrequenz, Schallkopf
Petrischalebeliebiger Hersteller
Weiches TuchN/AN/AJedes Stück weiches Tuch mit den Maßen ca. 70 x 55 cm2 z.B. ein Geschirrtuch
Stereomikroskop
Vevo 2100Fujifilm, VisualsonicsVevo 2100Hochfrequenz-Ultraschallgerät

Referenzen

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