Das detrusorfreie Blasenmodell ermöglicht den direkten Zugang zum Suburothel, um lokale Mechanismen zur Regulierung der biologisch aktiven Mediatorverfügbarkeit in Suburothelium/Lamina propria während der Lagerung und Leerung von Urin zu untersuchen. Das Präparat ähnelt dem Füllen einer intakten Blase und ermöglicht Druckvolumenstudien ohne systemische Einflüsse.
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Methodenartikel
Ein dezentralisiertes (Ex Vivo) Murine Blasenmodell mit dem Detrusormuskel entfernt für direkten Zugang zum Suburothelium während der Blasenfüllung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Frühere Studien haben die Freisetzung chemischer Substanzen aus flachen Blasenschleimhautplatten, die in Ussing-Kammern angebracht und Veränderungen des hydrostatischen Drucks oder der mechanischen Dehnung und von kultivierten Urothelzellen bei hydrostatischen Druckänderungen, Dehnungs-, Zellschwellungs- oder Schleppkräften und in Blasenlumen am Ende der Füllung ausgesetzt sind, festgestellt. Solche Ergebnisse führten zu der Annahme, dass diese Mediatoren auch in Suburothelium (SubU)/Lamina propria (LP) während der Blasenfüllung freigesetzt werden, wo sie Zellen tief in der Blasenwand beeinflussen, um letztendlich die Blasenerregbarkeit zu regulieren. Es gibt mindestens zwei offensichtliche Einschränkungen in solchen Studien: 1) Keiner dieser Ansätze liefert direkte Informationen über das Vorhandensein von Mediatoren in SubU/LP, und 2) die verwendeten Reize sind nicht physiologisch und rekapitulieren nicht die authentische Füllung der Blase. Hier diskutieren wir ein Verfahren, das den direkten Zugang zur suburotheliale Oberfläche der Blasenschleimhaut im Verlauf der Blasenfüllung ermöglicht. Das murine detrusorfreie Präparat, das wir erstellt haben, ähnelt der Füllung der intakten Blase und ermöglicht druckvolumende Untersuchungen an der Blase in Ermangelung verwirrender Signale durch Wirbelsäulenreflexe und Detrusor-Glattmuskel. Anhand des neuartigen detrusorfreien Blasenmodells haben wir kürzlich gezeigt, dass intravesische Messungen von Mediatoren nicht als Proxy für das verwendet werden können, was während der Blasenfüllung im SubU/LP freigesetzt oder vorhanden ist. Das Modell ermöglicht die Untersuchung von urothelium-abgeleiteten Signalmolekülen, die freigesetzt, durch Stoffwechsel erzeugt und/oder im Laufe der Blasenfüllung in den SubU/LP transportiert werden, um Informationen an Neuronen und glatten Muskel der Blase zu übertragen und ihre Erregbarkeit während der Kontinenz und Micturition zu regulieren.
Einleitung
Der Zweck dieses Modells ist es, den direkten Zugang zur submukossalen Seite der Blasenschleimhaut während verschiedener Phasen der Blasenfüllung zu ermöglichen.
Die Blase muss auf eine vorzeitige Kontraktion während der Befüllung verzichten und entleeren, wenn kritisches Volumen und Druck erreicht werden. Abnormale Kontinenz oder Leerung des Urins sind häufig mit abnormaler Erregbarkeit des Detrusor glatten Muskels (DSM) im Laufe der Blasenfüllung verbunden. Die Erregbarkeit von DSM wird durch Faktoren bestimmt, die den glatten Muskelzellen innewohnen, und durch Einflüsse, die von verschiedenen Zelltypen innerhalb der Blasenwand erzeugt werden. Die Wand der Harnblase besteht aus Urothelium (Mukosa), Suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), Detrusor glatter Muskel (DSM) und Serosa (Abbildung 1A). Das Urothel besteht aus Schirmzellen (d.h. der äußersten Schicht des Urothel), Zwischenzellen und Basalzellen (d. h. der innersten Schicht des Urothel). Verschiedene Arten von Zellen, einschließlich interstitielle Zellen, Fibroblasten, affefente Nerventerminals, kleine Blutgefäße und Immunzellen befinden sich in der SubU/LP. Es wird allgemein angenommen, dass das Blasenurothel ein Sinnesorgan ist, das Reflex-Micturition und Kontinenz initiiert, indem es Mediatoren in die Submukose freisetzt, die Zellen in der SubU/ LP und im DSM1,2,3. Zum größten Teil basieren solche Annahmen auf Studien, die die Freisetzung von Mediatoren gezeigt haben: aus Schleimhautteilen, die Veränderungen des hydrostatischen Drucks ausgesetzt sind4,5; von kultivierten urotheliale Zellen, die dehnung6,7, Hypotonizität-induzierte Zellschwellung7 oder Schleppkräfteausgesetzt 8; von isolierten Blasenwandstreifen auf Rezeptor oder Nervenaktivierung9,10,11,12,13,14; und in Blase Lumen am Ende der Blasenfüllung15,16,17,18,19. Während solche Studien entscheidend waren, um die Freisetzung von Mediatoren bei mechanischer Stimulation von Blasenwandsegmenten oder kultivierten Urothelzellen zu demonstrieren, müssen sie durch direkte Beweise für die Freisetzung von Mediatoren in der Submucosa gestützt werden, die durch physiologische Reize ausgelöst werden, die die Blasenfüllung reproduzieren. Dies ist eine schwierige Aufgabe, da sich der SubU/LP tief in der Blasenwand befindet und den direkten Zugang zur Nähe von SubU/LP während der Blasenfüllung behindert.
Hier illustrieren wir ein dezentralisiertes (ex vivo) murines Blasenmodell mit dem Detrusormuskel entfernt13, das entwickelt wurde, um Studien über lokale Mechanismen der Mechanotransduktion zu erleichtern, die an der Signalisierung zwischen dem Blasenurothel, DSM und anderen Zelltypen in der Blasenwand teilnehmen. Dieser Ansatz ist der Verwendung von flachen Blasenwandblättern, Blasenwandstreifen oder kultivierten Urothelzellen überlegen, da er direkte Messungen in der Nähe von SubU/LP von Urothel-abgeleiteten Mediatoren ermöglicht, die als Reaktion auf physiologische Drücke und Volumina in der Blase freigesetzt oder gebildet werden und mögliche phänotypische Veränderungen in der Zellkultur vermeiden. Es kann verwendet werden, um Verfügbarkeit, Freisetzung, Stoffwechsel und transurotheliale Transport von Mediatoren in SubU/LP in verschiedenen Stadien der Blasenfüllung zu messen (Abbildung 1B). Das Präparat kann auch verwendet werden, um urotheliale Signalisierung und Mechanotransduktion in Modellen von überaktiven und unteraktiven Blasensyndromen zu untersuchen.
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Protokoll
Alle in diesem Manuskript beschriebenen Verfahren mit Tieren wurden gemäß dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals und dem Institutional Animal Use and Care Committee an der University of Nevada durchgeführt.
ANMERKUNG: Das hier vorgestellte Modell besteht in der Entfernung des Detrusormuskels, während das Urothel und SubU/LP intakt bleiben (Abbildung 1B), um den Ermittlern den direkten Zugang zu SubU/LP im Verlauf der Blasenfüllung zu ermöglichen.
1. Zerlegung der detrusorfreien Blasenpräparation
- Die isolierte Blase in eine mit Kälte (10 °C) gefüllte und mit 5% CO2/95 %O2 Krebs Bicarbonatlösung (KBS) gefüllte Sezschale (mM) legen: 118,5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2, 23.8 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 dextrose, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
- Pin einen kleinen Teil der Kuppel der isolierten Blase an eine Sylgard-bedeckte Sezieren Schale mit KBS gefüllt. Stellen Sie sicher, dass der Stift durch ein Stück der Serosa oder den äußersten Rand des Detrusormuskels weit weg vom innersten Rand des Muskels geht, der dem SubU/LP gegenübersteht.
- Identifizieren Sie mit einem Mikroskop die Harnröhre und harnstoffer und heften Sie sie an den Boden der Sezschale.
- Entfernen Sie die überschüssigen Fett- und Bindegewebe, so dass der gesamte Hauptkörper der Blase, die Harnröhre und beide Harnleiter angezeigt werden.
- Binden Sie die Harnleiter mit 6-0 Nylon Nähte. Dann heften Sie die offenen Enden der Harnleiter an den Boden der Sezschale, um die Zubereitung zu sichern.
- Mit feiner Spitzenzange ziehen Sie vorsichtig ein Stück des Serosa an der Ecke zwischen Harnleiter und Blasenkörper.
- Passen Sie das Licht des Mikroskops an, um die Transparenz zu erhöhen und den Rand der Submukosa unter dem Detrusormuskel zu unterscheiden.
- Beginnen Sie mit dem Schneiden(nicht schälen!) die Blasenwand mit einer Feinspitze scheren entlang der Innenseite der Detrusor-Muskelschicht, während Sie das geschnittene Segment sanft von der Zubereitung wegziehen. Stellen Sie jederzeit sicher, dass die seitliche Kante der Schleimhaut sichtbar ist und vermeiden Sie es zu berühren.
- Entfernen Sie den Detrusormuskel vollständig, indem Sie die Sezierende Schale umdrehen, so dass die Position des Präparats bequem ist, um den Detrusormuskel weiter zu sezieren.
- Lassen Sie ein kleines Stück Detrusormuskel auf der Oberseite der Blasenkuppel, um die Fähigkeit zu gewährleisten, die Vorbereitung während der verbleibenden Schritte des Protokolls zu immobilisieren.
- Machen Sie eine doppelte Schleife von 6-0 Nylonfaden, legen Sie es um den Hals der Blase Vorbereitung, und lassen Sie die Schleife locker.
- Fügen Sie eine zweite Doppelschleife von 6-0 Seidenfaden, legen Sie es um den Hals der Blase Vorbereitung, und lassen Sie die Schleife verlieren. Zwei Nähte zu haben verhindert Lecks um die Nähte.
- Schneiden Sie ca. 2 cm von 20 PE-Schläuche (Katheter), aufflackern Sie die Spitze, indem Sie langsam die Spitze in der Nähe einer Flamme bewegen.
- Füllen Sie den Katheter mit warmen (37 °C) sauerstoffhaltigen KBS.
- Legen Sie den Katheter in die Öffnung der Harnröhre der Blase ein und drücken Sie den Katheter vorsichtig, bis die Katheterspitze ungefähr die Mitte der Blase erreicht.
- Binden Sie die Naht um den Katheter und das umgebende Gewebe des Blasenhalses.
- Füllen Sie die Blase langsam mit ca. 50-100 l warmem (37 °C) sauerstoffhaltigem KBS, heben Sie sie kurz (<10 s) über die Oberfläche von KBS und überwachen Sie Leckagen an den Nähten und dem Blasenkörper.
- Wenn kein Leck beobachtet wird, ist die Vorbereitung für das Experiment bereit. Wenn ein Leck um die Naht beobachtet wird, entfernen Sie die Naht und ersetzen Sie sie. Wenn ein Leck aus einem Loch im Blasenkörper bemerkt wird, entsorgen Sie das Präparat.
2. Füllung der denuded Blasenvorbereitung
- KBS (37 °C) in eine 3 ml Kammer einer wassergemantelten Organschale mit Sylgardboden durchdringen.
- Stellen Sie die Sauerstoff- und Saugleitungen ein.
- Legen Sie das denuded Blasenpräparat in die Kammer.
- Sichern Sie den Katheter an der Seite der Kammer, damit das Präparat nicht über der Oberfläche der Perfusionslösung schwebt.
- Schließen Sie den Blasenkatheter an einen längeren PE20-Schlauch (Infusionsleitung) an, der mit dem Drei-Wege-Stopphahn verbunden ist, und verwenden Sie die gleiche Größe.
- Stellen Sie sicher, dass die Leitungen zwischen der Infusionspumpe, dem Druckaufnehmer und der Blase offen sind.
- Füllen Sie die Infusionsspritze mit frischen, warmen (37 °C) und sauerstoffhaltigen KBS.
- Passen Sie die Pumpenparameter an: Spritzentyp/-volumen (d. h. 1 ml), Betrieb (d. h. Infuse), Durchfluss (d. h. konstante) und Durchfluss (d. h. 15 l/min).
- Drücken Sie die Starttaste an der Spritzenpumpe, um die Blase zu füllen.
- Überwachen Sie Füllvolumen und intravesischen Druck während der Blasenfüllung.
3. Nachweis von Mediatoren im SubU/LP-Aspekt der denuded Blasenvorbereitung
- Sammeln Sie Aliquots der Badlösung in eiskalte Mikrozentrifugenrohre oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Einsätze.
- Bereiten Und verarbeiten Sie die Proben entsprechend der entsprechenden Erkennungsanwendung. Im Falle der Detektion der Purinverfügbarkeit verarbeiten Sie die Proben mit HPLC mit Fluoreszenzdetektion13,18.
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Ergebnisse
Die Wand der murinen detrusorfreien Blasenzubereitung ist intakt und enthält alle Schichten außer dem DSM und serosa. Proof-of-Principle-Studien zeigten, dass die DSM-freie Blasenwand Urothelium und SubU/LP enthält, während die Tunika muscularis und die Serosa fehlen (Abbildung 2)13.
Die Füllung der detrusorfreien Blase entspricht der normalen Blasenfüllung.
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Diskussion
Die Blase hat zwei Funktionen: Lagerung und Leerung von Urin. Der normale Betrieb dieser Funktionen erfordert eine ordnungsgemäße mechanische Erfassung des intraluminalen Volumens und des Drucks sowie die Transduktion von Signalen durch Zellen in der Blasenwand, um die Erregbarkeit der Detrusormuskulatur zu regulieren. Die Blasenschleimhaut (Urothelium) wird geglaubt, um Blasenerregbarkeit zu regulieren, indem eine Vielzahl von Signalmolekülen in der SubU/LP freigesetzt wird, die zahlreiche Zelltypen in der Blasenwand be...
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Offenlegungen
Teile dieser Arbeit wurden zuvor im Journal of Physiology (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). Wiley and Sons, Inc. hat die Genehmigung für die Verwendung von Materialien aus dieser Publikation erteilt. Die Autoren haben keine finanziellen oder anderen Konflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grant DK41315 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CaCl2 | Fisher | C79 | Quelle flexibel |
| Dextrose | Fisher | D16 | Quelle flexibel |
| Präparierstifte | Fine Science Tools | 26002-20 | Quelle flexibel |
| Infusionspumpe | Kent Scientific | GenieTouch | Quelle flexibel |
| KCl | Fisher | P217 | Quelle flexibel |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Quelle flexibel |
| Lichtquelle | SCHOTT ACEI | Quelle flexibel | |
| Mikroskop | Olympus SZX7 | Flexibel für jeden Einsatz | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Quelle flexibel |
| NaCl | Fisher | S671 | Quelle flexibel |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Quelle flexible |
| Nadeln 25G | Becton Dickinson | 305122 | Quelle flexibles |
| Organbad | Maßgeschneiderte | flexible Quelle; Wir haben es gemacht aus Radnoti Präparierschale | |
| PE-20 Schlauch | Intramedic | 427405 | Quelle flexibel |
| Druckmessumformer | AD Instrument | Quelle flexibel | |
| S& T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Quelle flexibel |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Naht Nylon, 6-0 | AD chirurgisch | S-N618R13 | Quelle flexible |
| Naht Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Quelle flexible |
| Spritzen 1 mL | Becton Dickinson | 309602 | Quelle flexibel |
| Vannas Federschere | Fine Science Tools | 15000-08 | Quelle flexibel |
| Wasserzirkulator | Baxter | K-MOD 100 | Quelle flexibel |
Referenzen
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
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