Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

10.5K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/60347

⸱

3. Dezember 2019

 , 
1Department of Neurobiology, Stanford University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.

Zusammenfassung

Als ansässige Makrophagen im zentralen Nervensystem, Mikroglia aktiv Steuern gehirnentwicklung und Homöostase, und ihre Funktionsstörungen können menschliche Krankheiten antreiben. Erhebliche Fortschritte wurden gemacht, um die molekularen Signaturen von heimostatischen Mikroglia sowie Veränderungen ihrer Genexpression als Reaktion auf Umweltreize aufzudecken. Mit dem Aufkommen und der Reifung einzelliger genomischer Methoden wird zunehmend erkannt, dass heterogene Mikroglia den unterschiedlichen Rollen zugrunde liegen können, die sie in verschiedenen entwicklungs- und pathologischen Bedingungen spielen. Eine weitere Zerlegung einer solchen Heterogenität kann durch eine effiziente Isolierung von Mikroglia aus einer bestimmten Interessensregion erreicht werden, gefolgt von einer sensiblen Profilierung einzelner Zellen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die schnelle Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen Hirnregionen in einer einzigen erwachsenen Maus-Gehirnhälfte. Wir zeigen auch, wie diese sortierten Mikroglia für die plattenbasierte tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung verwendet werden. Wir diskutieren die Anpassungsfähigkeit dieser Methode an andere Szenarien und stellen Richtlinien für die Verbesserung des Systems für groß angelegte Studien bereit.

Einleitung

Mikroglia, die 5 % der Nervenzellen ausmacht, sind über das zentralnervousische System (ZNS) verstreuteMakrophagen. Geschützt hinter Blut - Hirn-Schranke, typische Mikroglia in einem gesunden erwachsenen Gehirn enthalten viele feine Prozesse, die schnell erweitern und zurückziehen, um mit Neuronen und anderen Gliazellen im Parenchym interagieren. Microglia kann auch die amoemoide Morphologie annehmen, die mit einer erhöhten phagozytischen Funktion in bestimmten Entwicklungsstadien oder bei Immunherausforderungen bei Verletzungen und Krankheiten1,2,3,4verbunden ist. Jüngste spannende Entdeckungen haben deutlich gezeigt, dass Mikroglia keineswegs passive Zuschauer von hirnabgeleiteten oder pathologischen Signalen sind, sondern eine zentrale Rolle bei der Steuerung der Gehirnentwicklung und Homöostase spielen, beispielsweise durch die Unterstützung des neuronalen Überlebens, das Beschnitt unreifer Synapsen, die Förderung der Differenzierung von Oligodendrozyten-Linienzellen sowie die Angiogenese1. Da mehr Funktionen von Mikroglia aufgeklärt werden, wird die Aufregung durch humangenetische Studien weiter angeheizt, die zeigten, dass viele neurodegenerative Krankheitsrisikogene, wie TREM2, überwiegend oder ausschließlich durch Mikroglia5,6,7ausgedrückt werden. Angesichts ihrer Bedeutung für die Entwicklung und der plausiblen rolle der Krankheit wurden in letzter Zeit enorme Anstrengungen unternommen, um unser Verständnis der mikroglialen Genregulation und -funktion zu verstehen, in der Hoffnung, neue therapeutische Ziele für neurodegenerative Erkrankungen zu finden1,8.

Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ermöglicht eine unvoreingenommene Charakterisierung der zelltypspezifischen Genexpression, was wiederum Wissenschaftler bei der Untersuchung von Genfunktionen in dichten Zellnetzen leitet7. RNA-seq wurde hauptsächlich auf Massenproben durchgeführt, was zur Entdeckung einer panostatischen mikrogliaalen Gensignatur führte, die sie von anderen neuronalen und Immunzellen unterscheidet9. Ein solcher Ansatz könnte jedoch molekulare und funktionelle Unterschiede zwischen Mikroglia übersehen, insbesondere solche, die vorübergehend in der Entwicklung vorhanden sind oder mit Alterung und Krankheit in Verbindung gebracht werden. Tatsächlich bietet einzellige RNA-seq (scRNA-seq) die Empfindlichkeit und Auflösung, die das Feld revolutioniert haben, indem sie zuvor unterschätzte Heterogenität von Mikroglia in einer Vielzahl von Kontexten2,3,10. Darüber hinaus liefert scRNA-seq aufgrund des Vorhandenseins anderer ähnlicher Immunzellen an der CNS-Zirkulationsschnittstelle Informationen, die das Design neuer Werkzeuge unterstützen, um diese verwandten Zellen mit wenig Vorkenntnissen zu trennen und funktionell zu sezieren2,11.

Es wurde eine Vielzahl von scRNA-seq-Plattformen erfunden, die jeweils für bestimmte Anwendungen geeignet sind12. Im Allgemeinen sind tröpfchenbasierte Methoden, wie z. B. 10x Genomics, höher im Durchsatz mit (Zehntausenden) Tausenden von Zellen, die in jedem Durchlauf sequenziert werden, und sie sind weniger selektiv für die Eingabe, die gemischte Zellpopulationen enthalten kann, die eine umfassende Kategorisierung erfordern. Plattenbasierte Methoden bieten eine höhere Empfindlichkeit und Lesetiefe13,14, in der Regel auf bestimmte Populationen aus der Zellsortierung abzielen, um subtile Unterschiede oder seltene Transkripte aufzudecken. Angesichts des geringen Anteils mikrogliar alataler Zellen, insbesondere dieser entwicklungs- oder krankheitsassoziierten Subpopulationen, unter allen ZNS-Zelltypen ist es oft wünschenswert, Mikroglia aus einer bestimmten Interessensregion zu isolieren und tiefe und umfassende transkriptomische Informationen zu erhalten, um ihre Heterogenität zu verstehen.

Hier bieten wir Details, wie Mikroglia aus verschiedenen Maushirnregionen isoliert werden kann, die von einer einzigen Hemisphäre seziert werden, die nach einem halbautomatischen plattenbasierten Bibliotheksvorbereitungsverfahren für einzellige (oder Massen-) RNA-Seq verwendet werden. Die andere Hemisphäre kann dann für die histologische Validierung verwendet werden. Optimiert von einer zuvor veröffentlichten Methode9zielt dieses Isolationsprotokoll darauf ab, den Ertrag aus einer geringen Menge an Ausgangsmaterialien zu maximieren und in der Zwischenzeit endogene mikrogliaale Genexpressionsprofile zu pflegen. Wir verwenden fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um Mikroglia (oder andere verwandte Immunzellen von Interesse) in 96-Well-Platten anzureichern und die Volumen von Reagenzien für die Bibliotheksvorbereitung zu miniaturisieren, um den Durchsatz zu erhöhen. Wir heben diese sensible scRNA-seq-Plattform hervor, obwohl andere plattenbasierte Strategien angewendet werden können. Diese Methode kann leicht angepasst werden, um Mikroglia von anderen sezierten Geweben zu isolieren, wie Verletzungen oder Krankheitsherde, und das Alter der Maus kann in fast jedem postnatalen Stadium variieren. Eine effiziente Isolierung regionaler Mikroglia für einzellige Transkriptomikstudien wird ein besseres Verständnis ihrer Funktionen bei Gesundheit und Krankheit erleichtern.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Nagetiere beteiligt sind, entsprachen den Richtlinien der Stanford University, die den nationalen und staatlichen Gesetzen und Richtlinien entsprechen. Alle Tierverfahren wurden vom Verwaltungsgremium für Labortierpflege der Stanford University genehmigt.

HINWEIS: Alle Lösungs- und Pufferzusammensetzungen sind in Tabelle der Materialienenthalten.

1. Vorbereitung am Tag der Zellisolierung

  1. Bereiten Sie folgende Reagenzien vor und kühlen Sie sie auf Eis: Medium A (50 ml), magnetaktivierter Zellsortierungspuffer (30 ml), FACS-Puffer (25 ml), phosphatgepufferte Saline (PBS; 30 ml), DNase (320 l) und RNase-Inhibitor (30 l).
    HINWEIS: Die hier zur Verfügung gestellten Volumina reichen aus, um Mikroglia aus 4 Hirnregionen (z.B. Kortex, Kleinhirn, Hippocampus und Striatum) einer einzelnen Maushirnhälfte zu isolieren. Skalieren Sie, wenn mehr Gewebe verwendet werden.
  2. Legen Sie vier saubere 2 ml Dounce Homogenisatoren auf Eis und fügen Sie 2 ml Medium A mit 80 l DNase (12.500 Einheiten/ml) und 5 l RNase-Inhibitor in jeden Dounce-Homogenisator ein. Kühlen Sie die Kolben in 15 ml Rohren.
  3. Etikettieren Sie vier 6 cm Petrischalen mit Hirnregionen für die Gewebesammlung und fügen Sie 200 l kaltes Medium A in jede Schale auf Eis ein. Ca. 5 ml Medium A zur Zerlegung in eine 6 cm Petrischale geben.
    HINWEIS: Stellen Sie vor der Anwendung sicher, dass alle Reagenzien steril und für RNA-Anwendungen geeignet sind. Bank- und Sezierwerkzeuge müssen sauber und mit RNase Dekontaminationslösung(Materialtabelle)besprüht werden.

2. Hirnregion-Sektion

HINWEIS: Dieser Schritt sollte ca. 30 min dauern.

  1. Injizieren Sie 400 x 500 l Ketamin/Xylazin (24 mg/ml Ketamin und 2,4 mg/ml Xylazin) in das Peritoneum einer jugendlichen zu erwachsenen Stage-Maus (>1 Monat alt).
    HINWEIS: Eine männliche Maus wird hier zur Veranschaulichung verwendet, aber beide Geschlechter sind geeignet.
  2. Warten Sie 5 min und kneifen Sie eine Hinterpfote, um einen Mangel an Rückzug zu gewährleisten.
  3. Verwenden Sie sofort eine 26 G x 3/8 Nadel, um eine transkardiale Perfusion mit 20 bis 30 ml eiskaltem PBS durchzuführen, bis der Puffer ohne sichtbares Blut abläuft.
  4. Enthaupten Sie die Maus mit einer chirurgischen Schere. Verwenden Sie eine kleine Schere, um die Haut zu schneiden, um den darunter liegenden Schädel freizulegen, und schneiden Sie dann durch die sagittale Naht, Lambdoidal Naht und koronare Naht. Verwenden Sie Zangen, um beide Seiten des parietalen Knochens und interparietalen Knochens abzuziehen, ohne das Gewebe zu beschädigen, und bewegen Sie das Gehirn vorsichtig in die Sezierform Petrischale mit Medium A.
  5. Verwenden Sie eine vorgekühlte Klinge, um das Gehirn durch die Mittellinie in zwei Hemisphären zu schneiden.
    HINWEIS: Die vier hier beschriebenen Hirnregionen aus einer einzigen Hemisphäre ergeben eine ausreichende Anzahl von Mikroglia für einzellige oder massenhafte RNA-Seq-Anwendungen. Die andere Hemisphäre kann für die Immunhistochemie oder RNA-in-situ-Validierung verwendet werden.
  6. Trennen Sie das Kleinhirn vom kortikalen Lappen und dem Hirnstamm mit #55 Zange und übertragen Sie das Gewebe in eine Sammlung Petrischale.
  7. Verwenden Sie #55 Zange, um den Hippocampus und das Striatum vorsichtig aus dem Kortex zu sezieren und jedes Gewebe in eine Sammlung Petrischale zu übertragen.

3. Mechanische Gewebedissoziation

HINWEIS: Halten Sie Zellen und Reagenzien die ganze Zeit kühl, außer während der Färbung Schritte. Dieser Schritt sollte ca. 30 min dauern.

  1. Schneiden Sie jedes Hirngewebe mit einer Rasierklinge in <1 mm3 feine Stücke.
  2. Verwenden Sie 1 ml Pipette (mit abgeschnittenen Spitzen), um Gewebeteile in die vorgekühlten Dounce Homogenisatoren zu übertragen, die jeweils 2 ml Medium A mit DNase- und RNase-Inhibitor enthalten.
  3. Homogenisieren Sie das Gewebe, indem Sie den Kolben langsam in und aus dem Dounce Homogenisator für 6-10 volle Striche verdrehen, bis keine sichtbaren Brocken vorhanden sind.
    HINWEIS: Douncing tötet Neuronen und die meisten anderen Gliazellen, lässt aber mikrogliaale Zellen ziemlich intakt. Sowohl unzureichende als auch überdhüpfende Werte können zu einer geringen Ausbeute an Zellen führen.
  4. Übertragen Sie dissoziierte Gewebe durch 70'm-Siebe in 50 ml-Röhren.
  5. Spülen Sie jeden Dounce Homogenisator und Kolben mit insgesamt 6 ml Kaltmedium A und filtern Sie die Spüllösung durch das gleiche Sieb in das entsprechende Rohr.
  6. Die Einzelzellaufhängungen (je ca. 8 ml) in 15 ml konische Rohre und Zentrifugen bei 400 x g für 5 min bei 4 °C mit Bremse = 5 übertragen.

4. MyelinEntfernung

HINWEIS: Dieser Schritt sollte ca. 60 min dauern.

  1. Bereiten Sie 1 große Erschöpfungsspalte (LD) (für Kortex) und 3 große Auswahlspalten (LS) (für die anderen 3 Regionen) in einem magnetischen Trennzeichen (Materialtabelle) vor. Spülen Sie jede Spalte mit 3 ml MCS-Puffer.
  2. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, Pipette aus und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Für das Cortex- und Daserebellumgewebe, resuspendieren Sie Zellen in 850 l MCS-Puffer mit 1,8 l RNase-Inhibitor. Für Hippocampus- und Striatumgewebe, resuspendieren Sie Zellen in 400 l MCS-Puffer mit 0,9 l RNase-Inhibitor.
    HINWEIS: Die Spalten (LD vs. LS) und das volumen, das für die Resuspension verwendet wird, werden basierend auf der Menge an Myelin im Gewebe optimiert. Wenn andere Hirnregionen untersucht werden, müssen diese Bedingungen möglicherweise angepasst werden, abhängig von der Größe des Gewebes und wie viel Myelin existieren kann. Wirksamkeit der Myelin-Entfernung kann in Schritt 4.9 geschätzt werden.
  3. Fügen Sie jeweils 100 L Myelinentfernungsperlen in Zellen aus Kortex und Kleinhirn hinzu und fügen Sie jeweils 50 L Myelinentfernungsperlen in Zellen aus Hippocampus und Striatum hinzu.
  4. Mischen Sie die Zellen vorsichtig mit Perlen und inkubieren Sie die Rohre auf Eis für 10 min.
  5. Bringen Sie das Volumen der Röhre mit kortikalen Zellen auf 2 ml mit MCS-Puffer, und alle anderen auf 1 ml (d. h., fügen Sie 1 ml für kortikale Zellen; 500 l für Hippocampus- und Striatalzellen; keine Notwendigkeit, Kleinhirnzellen Puffer hinzuzufügen).
  6. Sobald die Spalten leer vom Spülpuffer sind, legen Sie eine 15 ml-Röhre unter jeder Spalte. Laden Sie kortikale Zellen (2 ml) in die LD-Spalte und alle anderen (jeweils 1 ml) in die LS-Spalten. Verwenden Sie sofort jeweils 1 ml MCS-Puffer, um die Originalrohre zu waschen und die Lösung auf die entsprechenden Säulen zu laden.
  7. Waschen Sie die LD-Säule einmal mit 1 ml MCS-Puffer und waschen Sie jede LS-Säule zweimal mit 1 ml MCS-Puffer pro Wäsche. Fahren Sie fort, um die Durchflusslösung während des Waschens zu sammeln.
  8. Filtern Sie Zellen in runde FACS-Rohre durch 35 m Siebkappen.
    HINWEIS: Jedes Rohr sollte etwa 4 ml einzellige Suspension von Myelin erschöpft sammeln.
  9. Nehmen Sie optional 10 l der Zellsuspension und mischen Sie sie mit einer 10-L-Lösung mit 0,4 % Trypan-Blaulösung. Untersuchen Sie die Zellen unter einem 10-fachen Hellfeldmikroskop, um die Ausbeute, Überlebensrate und den Restmyelingehalt zu schätzen.
    HINWEIS: Eine erfolgreiche Zubereitung sollte über 90% lebende Zellen (rund in Form und ohne den blauen Farbstoff) mit wenig bis gar keinem Myelin-Abfall erzeugen.
  10. Pelletzellen in den FACS-Rohren bei 400 x g für 5 min bei 4 °C, mit Bremse = 5. Langsam überwasseren überstand und tupfte den Rand des Rohres auf Tissuepapier. Resuspend Zellen in jedem Rohr mit 300 L FACS Puffer.
    HINWEIS: Wenn MCS-Sortierung bevorzugt wird, können CD11b Perlen verwendet werden, um Mikroglia und andere myeloische Zellen nach Myelin-Entfernung auszuwählen. Diese Zellen können dann für nicht-plattenbasierte scRNA-seq sowie Bulk-RNA-seq verwendet werden. Der Vorbehalt dieses alternativen Ansatzes ist, dass CD11b Perlen Mikroglia nicht von anderen verwandten Immunzellen trennen, die auch positiv für dieses Antigen sind.

5. Färbung für fluorescence-aktivierte Zellsortierung

HINWEIS: Dieser Schritt sollte ca. 40 min dauern.

  1. Fügen Sie in jedem Rohr 5 L Der Maus-Fc-Rezeptoren-Blockreagenz (Materialtabelle) hinzu. 5 min auf Eis inkubieren.
  2. Fügen Sie in jedem Rohr 1 L CD45-PE-Cy7 und 1 L CD11b-BV421 hinzu.
    HINWEIS: Es können Antikörper mit anderen konjugierten Fluorophoren verwendet werden. Antikörper gegen TMEM119, einen spezifischen Marker für die panostatische Mikroglia9, können ebenfalls enthalten sein, es wird jedoch empfohlen, zusammen mit CD45 und CD11b verwendet zu werden, da bestimmte Mikroglia-Subpopulationen die TMEM119-Oberflächenexpression verlieren können.
  3. Inkubieren Sie die Rohre auf einem Shaker für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
  4. Fügen Sie 2 ml FACS-Puffer zum Waschen hinzu.
  5. Pelletzellen bei 4 °C, 400 x g für 5 min. Langsam überwasseren überstand und tupfen sie den Rand des Rohres auf Tissuepapier aus. Resuspend-Zellen in jedem Röhrchen mit 400 L FACS-Puffer mit 1 L RNase-Inhibitor und 0,5 l Propidiumjodid (PI, 1:1.000 Verdünnung).

6. Index FACS Sortierung

HINWEIS: Dieser Schritt sollte 1 h dauern.

  1. Nach dem Standard-FACS-Verfahren zeichnen Sie Tore basierend auf Streuung (ohne Schutt), Einzelzellen, lebende Zellen (PI-Negativ), Mikroglia und myeloische Zellen (CD45+, CD11b+).
    HINWEIS: Typische mikrogliaale Zellen exprimieren CD45 auf niedrigeren Ebenen im Vergleich zu anderen grenzassoziierten Makrophagen, wie perivaskuläre und meningeale Makrophagen, und daher sollte das Gating auf CD45 Low CD11b+ ausreichen, wenn der Schwerpunkt der Forschung Genexpressionsprofile in diesen klassischen Mikroglia1,2sind. Bestimmte Teilmengen von Mikroglia können jedoch eine höhere CD45-Expression haben, und dies gilt insbesondere während der Entwicklung oder bei Krankheitszuständen. Um eine unvoreingenommene Analyse der mikrogliaalen Genexpression zu gewährleisten, können CD45 High- und CD45 Low-Immunophenotypen durch Indexsortierungseinstellung und beide Populationen, die für die Sequenzierung und nachgelagerte Analyse gesammelt werden, aufgezeichnet werden. Darüber hinaus kann die TMEM119-Oberflächenexpression verwendet werden, um die panostatische mikrogliaale Population anzusprechen (siehe Schritt 5.2) und zusammen mit CD45-Spiegeln und den Sequenzierungsergebnissen analysiert werden.
  2. Sortieren Sie einzelne Mikroglia (mit einer 100-m-Düse) in 96-Well-Polymerase-Kettenreaktionsplatten (PCR), die jeweils 4 L Lysepuffer enthalten (Details siehe das veröffentlichte Protokoll14).
    HINWEIS: Das External RNA Control Consortium (ERCC) RNA Spike-in Mix (Table of Materials) kann bei 1:2.4 x 107 im Lysepuffer für Qualitätskontrolle und Normalisierung hinzugefügt werden2.
  3. Kurz wirbeln die Platten und drehen Sie sich mit einer Tischzentrifuge nach unten.
  4. Die Proben sofort auf Trockeneis einfrieren. Bewahren Sie die Platten bei -80 °C bis zur Bibliotheksvorbereitung auf.
    HINWEIS: Alternativ können mehr Zellen in 1,5 ml-Röhren mit RNA-Extraktionspuffer für Bulk-RNA-seq gesammelt werden. Nach den Erfahrungen der Autoren reichen 3.000 Zellen aus, um Bibliotheken von guter Qualität nach dem veröffentlichten Protokoll2,14zu generieren.

7. Einzellige RNA-Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung

HINWEIS: Hier wird dem veröffentlichten Protokoll14 gefolgt, um scRNA-seq-Bibliotheken mit Hilfe von Flüssigkeitshandhabungsrobotik und einigen Modifikationen zu generieren. In diesem Artikel wird das Verfahren nur kurz beschrieben, und die Unterschiede werden hervorgehoben. Die Gleichzeitige Verarbeitung von 4 Platten dauert ca. 2,5 Tage.

  1. Platten auf Eis auftauen und Reverse-Transkription mit Oligo-dT30VN-Primer (im Lysepuffer) durchführen, um cDNA mit thermischen Cyclern zu erzeugen (Tabelle 1): 42 °C 90 min; 70 °C 5 min; 4 °C halten. Verstärken Sie dann cDNA mit einem zusätzlichen Exonuklease-Verdauungsschritt am Anfang (Tabelle 2) mit dem PCR-Master-Mix und In-situ-PCR-Grundierungen(Materialtabelle) und der folgenden PCR-Bedingung: 37 °C 30 min; 95 °C 3 min; 23 Zyklen von 98 °C 20 s, 67 °C 15 s, 72 °C 4 min; 72 °C 5 Min.
  2. Reinigen Sie cDNA mit 18 l Magnetperlen pro Brunnen (0,7:1 Verhältnis). Inkubieren Sie die Platte auf einem magnetischen Ständer für 5 min und waschen Sie Proben zweimal mit frisch hergestelltem 80% Ethanol, 80 l pro Brunnen jedes Mal. Nach dem Trocknen der Platte für 15-20 min, elute cDNA mit 20 l Elutionspuffer pro Brunnen.
    HINWEIS: Verwenden Sie zur Qualitätskontrolle einen Fragmentanalysator (hochempfindliche Sequenzierung [NGS] der nächsten Generation, 1,6.000 bp), um Größenverteilungen und CDNA-Konzentrationen zu überprüfen, und nur weitere Prozessproben mit einem Abstrich zwischen 500 und 5.000 bp und höher als 0,05 ng/l.
  3. Um Bibliotheken zu erzeugen, mischen Sie 0,4 l jeder cDNA-Probe mit 1,2 L Tn5-Tagmentationsreagenzien aus dem Bibliotheksvorbereitungskit (Tabelle der Materialien) in einer 384-Well-Platte mit Hilfe einer Nanoliter-Pipettiermaschine, bei 55 °C 10 min.
    HINWEIS: Hierbei wird 1/12,5 des vorgeschlagenen Reaktionsvolumens (5 l Probe und 15 l Tagmentationsreagenzien) zugegeben, um die Kosten zu senken und gleichzeitig den Durchsatz zu erhöhen. Eine Nanoliter-Pipettiermaschine(Tabelle der Materialien) wird verwendet, um Reagenzien (diese und folgende Schritte) von und auf 384-Well-Platten zu übertragen.
  4. Fügen Sie 0,4 l Neutralisationspuffer hinzu, um die Tagmentationsreaktion bei RT für 5 min zu stoppen.
  5. Fügen Sie 384 Indizes(Materialtabelle, 0,4 l vorwärts und 0,4 l rückwärts), 1,2 l PCR-Mix zu Samples (jeweils 2 l) hinzu und verstärken Sie die Bibliotheken unter folgender Bedingung: 72 °C 3 min; 95 °C 30 s; 10 Zyklen von 95 °C 10 s, 55 °C 30 s, 72 °C 1 min; 72 °C 5 Min.
  6. Bündeln Sie alle einzelnen Bibliotheken (jeweils 1 L) aus derselben 384-Well-Platte zusammen und verwenden Sie magnetische Perlen(Tabelle der Materialien, 0,7:1-Verhältnis), um die endgültigen gepoolten Bibliotheken zu reinigen.
  7. Verwenden Sie ein Fluorometer (Materialtabelle), um die Konzentrationen zu messen, und einen Bioanalysator (Materialtabelle), um die Größenverteilungen von gepoolten Bibliotheken vor der Sequenzierung zu untersuchen. Richten Sie die Sequenzierungstiefe auf 1 Million Rohlesevorgänge pro Zelle aus.
  8. Befolgen Sie die standardmäßigen bioinformatischen Verfahren, um Sequenzierungslesevorgänge zu filtern und zu trimmen und Ausrichtung2durchzuführen. Verwenden Sie die Zähltabelle und die Metadaten als Eingaben, um Clusteranalysen mit dem Seurat-Paket15durchzuführen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Mikroglia aus verschiedenen Hirnregionen in einer erwachsenen perfundierten Gehirnhälfte zu isolieren und zu sortieren, gefolgt von scRNA-seq. Wir verwenden Douncing, um einzellige Suspension zu erstellen und auch als ersten Schritt, um Mikroglia zu bereichern. Unzureichende oder überdouncing reduziert die Ausbeute. Darüber hinaus enthalten erwachsene Mausgehirne hohe Myelinspiegel, die auch die Sortiereffizienz reduzieren und nachgeben können, wenn sie nicht richtig entfernt ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Mikroglia interagieren aktiv mit anderen Zelltypen im ZNS und sind sehr empfindlich auf Umweltreize reagieren. Um Entzündungsreaktionen und abnorme Veränderungen in ihrer Genexpression während des Isolationsprozesses zu minimieren, wurde dieses Protokoll von einer zuvor veröffentlichten Methode9gestrafft und ist nun geeignet, Mikroglia aus mehreren Regionen einer einzelnen Maushirnhälfte parallel zu isolieren. Die Gewebe und Reagenzien werden bei kalter Temperatur gehalten und Experimente werden z...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno und Spyros Darmanis für ihre Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken auch der Stanford Shared FACS Facility, insbesondere Meredith Weglarz und Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart von Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) für ihre große Unterstützung bei den Dreharbeiten. Diese Arbeit wird von der JPB Foundation und der Vincent J. Coates Foundation finanziert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5 M BetainSigma-AldrichCat# B0300-5VL
10 mM dNTP MischungThermo Fisher ScientificCat# R0192
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher ScientificCat# 15575020
10X Stränge Balanced Salt SolutionThermo Fisher ScientificCat# 14185-052
1 M HEPESThermo Fisher ScientificCat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master MixKapa BiosciencesCat# KK2602
5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden, mit ZellsiebkappeCorningCat# 352235
AATI, hochempfindliches NGS-Fragment-Analysekit (1 bp – 6.000 bp)Advanced AnalyticalCat# DNF-474-1000
RinderserumalbuminSigma AldrichCat# A8806
DNase IWorthingtonCat# LS002007Arbeitslösung: 12500 Einheiten/ml
DTT,PromegaCat# P1171
ERCC RNA Spike-In MixThermo Fisher ScientificCat# 4456740
Fötales RinderserumThermo Fisher ScientificCat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 Indizes)IlluminaCat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 Indizes)IlluminaCat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 Indizes)IlluminaCat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 Indizes)IlluminaCat# FC-131-2004
Lambda-Exonuklease (5 U/μ l)New England BioLabsCat# M0262S
Maus Fc BlockBD PharmingenCat# 553142
Myelin EntfernungsperlenMiltenyl BiotecCat# 130-096-433
Nextera XT DNA Sample Prep KitIlluminaCat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Zyklen)IlluminaCat# 20024907
PBS ( 10X), pH 7,4Thermo Fisher ScientificCat# 70011044
PCRClean DX beadsAline BiosciencesCat# C-1003-50
Propidium IodidThermo Fisher ScientificCat# P3566Färbung: 1:1000
Qubit dsDNA HS Assay KitThermal Fisher ScientificCat# Q32851
Ratte monoklonal anti maus/human CD11b, Brilliant Violet 421 (Klon M1/70)BioLegendCat# 101236; RRID: AB_11203704Färbung: 1:300
Ratte monoklonales Anti-Maus-CD45, PE/Cy7 (Klon 30-F11)Thermo Fisher ScientificCat# 25-0451-82; RRID: AB_469625Färbung: 1:300
Rekombinanter RNase-InhibitorTakara BioCat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transkriptase (100 U/μ l)ClontechCat# 639538Enthält 5x Erststrangpuffer
Oligonukleotide
0,1 μ M ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGT-3'		(Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN Primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA
GAGTACT 30 VN-3'		(Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
GTACATrGrG+G-3' ("r" steht für Ribobasen und "+" für eine LNA-Base)		(Picelli et al., 2014)
SolutionsFACS
PufferRezept: sterilfiltriert 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS
MCS PufferRezept: sterilfiltriert 0,5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS
Medium ARezept: 15 mM HEPES, 0,5% Glukose in 1X HBSS ohne Phenol red
Platten
384 Well Rigi-Plate PCR Mikrotiterplatten, Axygen ScientificVWR89005-556
Hartschalen 96 Well PCR PlattenBio-RadHSP9631
Others
/strongDumont #55 PinzetteFine Science Tools11295-51
Dounce Homogenisator, 2 mlWheaton
Große DepletionskolonneMiltenyi Biotec130-042-901
Große AuswahlsäuleMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976
RNAzapThermo Fisher ScientificAM9780
Sieb (70 μ m)Falcon352350
Ausrüstung
BD FACSAria IIBD Bioscienceshttp://www.bdbiosciences.com/
BioanalysatorAgilent2100
Fragment-AnalysatorAgilent5300
Mosquito HTS Nanoliter-PipettierroboterTTP Labtechhttps://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33226
357422

Referenzen

  1. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  2. Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
  3. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  4. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  5. Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
  6. Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
  7. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  8. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  9. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  10. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  11. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  12. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).
  13. Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
  14. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  17. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  18. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2018).
  19. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  20. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122(2018).
  21. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  22. Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109(2018).
  23. Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Isolierung von MikrogliaDissektion von HirnregionenDurchflusszytometrische SortierungMyelin Entfernungsk gelchenHerstellung von FACS PufferCD45 CD11B F rbungBestimmung der Zellviabilit tProtokoll zur Library Pr parationDeep Sequencing Analyse
Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.