Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Als ansässige Makrophagen im zentralen Nervensystem, Mikroglia aktiv Steuern gehirnentwicklung und Homöostase, und ihre Funktionsstörungen können menschliche Krankheiten antreiben. Erhebliche Fortschritte wurden gemacht, um die molekularen Signaturen von heimostatischen Mikroglia sowie Veränderungen ihrer Genexpression als Reaktion auf Umweltreize aufzudecken. Mit dem Aufkommen und der Reifung einzelliger genomischer Methoden wird zunehmend erkannt, dass heterogene Mikroglia den unterschiedlichen Rollen zugrunde liegen können, die sie in verschiedenen entwicklungs- und pathologischen Bedingungen spielen. Eine weitere Zerlegung einer solchen Heterogenität kann durch eine effiziente Isolierung von Mikroglia aus einer bestimmten Interessensregion erreicht werden, gefolgt von einer sensiblen Profilierung einzelner Zellen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die schnelle Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen Hirnregionen in einer einzigen erwachsenen Maus-Gehirnhälfte. Wir zeigen auch, wie diese sortierten Mikroglia für die plattenbasierte tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung verwendet werden. Wir diskutieren die Anpassungsfähigkeit dieser Methode an andere Szenarien und stellen Richtlinien für die Verbesserung des Systems für groß angelegte Studien bereit.
Einleitung
Mikroglia, die 5 % der Nervenzellen ausmacht, sind über das zentralnervousische System (ZNS) verstreuteMakrophagen. Geschützt hinter Blut - Hirn-Schranke, typische Mikroglia in einem gesunden erwachsenen Gehirn enthalten viele feine Prozesse, die schnell erweitern und zurückziehen, um mit Neuronen und anderen Gliazellen im Parenchym interagieren. Microglia kann auch die amoemoide Morphologie annehmen, die mit einer erhöhten phagozytischen Funktion in bestimmten Entwicklungsstadien oder bei Immunherausforderungen bei Verletzungen und Krankheiten1,2,3
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle Verfahren, an denen Nagetiere beteiligt sind, entsprachen den Richtlinien der Stanford University, die den nationalen und staatlichen Gesetzen und Richtlinien entsprechen. Alle Tierverfahren wurden vom Verwaltungsgremium für Labortierpflege der Stanford University genehmigt.
HINWEIS: Alle Lösungs- und Pufferzusammensetzungen sind in Tabelle der Materialienenthalten.
1. Vorbereitung am Tag der Zellisolierung
- Bereiten Sie folgende Reagenzien vor und kühlen Sie sie auf Eis: Medium A (50 ml), magnetaktivierter Zellsortierungspuffer (30 ml), FACS-Puffer (25 ml), phospha....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Mikroglia aus verschiedenen Hirnregionen in einer erwachsenen perfundierten Gehirnhälfte zu isolieren und zu sortieren, gefolgt von scRNA-seq. Wir verwenden Douncing, um einzellige Suspension zu erstellen und auch als ersten Schritt, um Mikroglia zu bereichern. Unzureichende oder überdouncing reduziert die Ausbeute. Darüber hinaus enthalten erwachsene Mausgehirne hohe Myelinspiegel, die auch die Sortiereffizienz reduzieren und nachgeben können, wenn sie nicht richtig entfernt .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Mikroglia interagieren aktiv mit anderen Zelltypen im ZNS und sind sehr empfindlich auf Umweltreize reagieren. Um Entzündungsreaktionen und abnorme Veränderungen in ihrer Genexpression während des Isolationsprozesses zu minimieren, wurde dieses Protokoll von einer zuvor veröffentlichten Methode9gestrafft und ist nun geeignet, Mikroglia aus mehreren Regionen einer einzelnen Maushirnhälfte parallel zu isolieren. Die Gewebe und Reagenzien werden bei kalter Temperatur gehalten und Experimente werden z.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno und Spyros Darmanis für ihre Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken auch der Stanford Shared FACS Facility, insbesondere Meredith Weglarz und Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart von Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) für ihre große Unterstützung bei den Dreharbeiten. Diese Arbeit wird von der JPB Foundation und der Vincent J. Coates Foundation finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 5 M Betain | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP Mischung | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Stränge Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden, mit Zellsiebkappe | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, hochempfindliches NGS-Fragment-Analysekit (1 bp – 6.000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Arbeitslösung: 12500 Einheiten/ml |
| DTT, | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fötales Rinderserum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 Indizes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 Indizes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 Indizes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 Indizes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda-Exonuklease (5 U/μ l) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Maus Fc Block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin Entfernungsperlen | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Zyklen) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS ( 10X), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodid | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Färbung: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Ratte monoklonal anti maus/human CD11b, Brilliant Violet 421 (Klon M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Färbung: 1:300 |
| Ratte monoklonales Anti-Maus-CD45, PE/Cy7 (Klon 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Färbung: 1:300 |
| Rekombinanter RNase-Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transkriptase (100 U/μ l) | Clontech | Cat# 639538 | Enthält 5x Erststrangpuffer |
| Oligonukleotide | |||
| 0,1 μ M ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' | (Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN Primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' | (Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" steht für Ribobasen und "+" für eine LNA-Base) | (Picelli et al., 2014) | ||
| SolutionsFACS | |||
| Puffer | Rezept: sterilfiltriert 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS Puffer | Rezept: sterilfiltriert 0,5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Rezept: 15 mM HEPES, 0,5% Glukose in 1X HBSS ohne Phenol red | ||
| Platten | |||
| 384 Well Rigi-Plate PCR Mikrotiterplatten, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hartschalen 96 Well PCR Platten | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| /strongDumont #55 Pinzette | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce Homogenisator, 2 ml | Wheaton | ||
| Große Depletionskolonne | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Große Auswahlsäule | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Sieb (70 μ m) | Falcon | 352350 | |
| Ausrüstung | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalysator | Agilent | 2100 | |
| Fragment-Analysator | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS Nanoliter-Pipettierroboter | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
Referenzen
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Singl....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
