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Methodenartikel

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

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DOI:

10.3791/60357

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13. Dezember 2019

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1Department of Urology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Pathology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago, 3University of Illinois Cancer Center, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Unter Verwendung menschlicher primärer Prostataepithelzellen berichten wir über eine neuartige biomarkerfreie Methode der funktionellen Charakterisierung von stammähnlichen Zellen durch einen sphäroidbasierten Labelretentionstest. Für die Beschriftung von BrdU-, CFSE- oder Far Red 2D-Zellen wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll beschrieben. dreidimensionale Sphäroidbildung; kennzeichnungserhaltende stammähnliche Zellidentifikation durch Immunzytochemie; isolierung durch FACS.

Zusammenfassung

Trotz der Fortschritte in der adulten Stammzellforschung bleibt die Identifizierung und Isolierung von Stammzellen aus Gewebeproben eine große Herausforderung. Während ansässige Stammzellen mit Nischenbeschränkungen in erwachsenen Geweben relativ still sind, treten sie in einer ankerfreien dreidimensionalen (3D) Kultur in den Zellzyklus ein und durchlaufen sowohl eine symmetrische als auch eine asymmetrische Zellteilung, was sowohl Stamm als auch Vorläufer Zellen. Letztere vermehren sich schnell und sind die Hauptzellpopulation in verschiedenen Stadien der Abstammungsbindung, die heterogene Sphäroide bilden. Unter Verwendung der primären normalen menschlichen Prostataepithelzellen (HPrEC) wurde ein sphäroidbasierter, etikettenretentionsbezogener Assay entwickelt, der die Identifizierung und funktionelle Isolierung der sphäroid-initiierenden Stammzellen bei einer einzelzelligen Auflösung ermöglicht.

HPrEC oder Zelllinien werden mit BrdU für 10 Tage zweidimensional (2D) kultiviert, um ihre Aufnahme in die DNA aller teilenden Zellen, einschließlich selbsterneuernder Stammzellen, zu ermöglichen. Das Auswaschen beginnt mit der Übertragung in die 3D-Kultur für 5 Tage, in denen sich Stammzellen durch asymmetrische Teilung selbst erneuern und die Sphäroidbildung initiieren. Während relativ stille Tochterstammzellen BrdU-markierte Eltern-DNA behalten, vermehren sich die Tochtervorläufer schnell und verlieren das BrdU-Label. BrdU kann durch CFSE- oder Far Red Pro-Dyes ersetzt werden, die eine livee Stammzellisolierung durch FACS ermöglichen. Die Merkmale der Stammzellwerden werden durch in vitro sphäroide Bildung, In-vivo-Geweberegenerationstests und durch Dokumentation ihrer symmetrischen/asymmetrischen Zellteilungen bestätigt. Die isolierten, etikettenerhaltenden Stammzellen können durch nachgeschaltete molekulare und biologische Studien, einschließlich RNA-seq, ChIP-seq, Einzelzellerfassung, Metabolische Aktivität, Proteomprofilierung, Immunzytochemie, Organoidbildung und In-vivo-Geweberegeneration, streng abgefragt werden. Wichtig ist, dass dieser markerfreie funktionelle Stammzellisolationsansatz stammähnliche Zellen aus frischen Krebsproben und Krebszelllinien aus mehreren Organen identifiziert, was auf eine breite Anwendbarkeit hindeutet. Es kann verwendet werden, um Krebsstamm-ähnliche Zell-Biomarker zu identifizieren, Sieb-Arzneimittel, die auf Krebsstammzellen-ähnliche Zellen abzielen, und neue therapeutische Ziele bei Krebs zu entdecken.

Einleitung

Die menschliche Prostata enthält luminale Epithel mit sekretorische Funktion und Basalzellen, die ihm zusammen mit einer ungewöhnlichen neuroendokrinen Zellkomponente zugrunde liegen. Die Epithelzellen werden in diesem Fall aus einer seltenen Population von Prostatastammzellen erzeugt, die in vivo relativ still sind und als Reparatursystem fungieren, um die Drüsenhomöostase im Laufe des Lebens aufrecht zu erhalten1. Trotz vieler Fortschritte bleibt die Identifizierung und funktionelle Isolierung von Prostatastammzellen eine große Herausforderung auf dem Gebiet. Stammzell-Biomarker, einschließlich zelloberflächenmarkerbasierter Methoden in Kombination mit Durchflusszytometrie, werden häufig für die Stammzellforschung2,3,4verwendet. Die Ergebnisse für die Anreicherung und Isolierung variieren jedoch stark als Funktion von Markerkombinationen und Antikörperspezifität5,6, was Fragen über die Identität der isolierten Zellen aufwirft. Ein weiterer weit verbreiteter Ansatz zur stammartigen Zellanreicherung ist die dreidimensionale (3D) Sphäroidkultur2,3,4. Während ansässige Stammzellen in vivo mit Nischenbeschränkungen relativ still sind, durchlaufen sie eine Zellteilung in der 3D-Matrixkultur (sowohl symmetrisch als auch asymmetrisch) und erzeugen sowohl Stamm- als auch Vorläuferzellen, die sich schnell zur Abstammungsverpflichtung7,8vermehren. Die gebildeten Sphäroide sind eine heterogene Mischung, die sowohl Stammzellen als auch Vorläuferzellen in verschiedenen Stadien der Abstammungsverpflichtung enthält, einschließlich Früh- und Spätstadium-Vorläuferzellen. So sind Assays mit den gesamten Sphäroiden nicht stammzellexklusiv, was die Identifizierung einzigartiger Stammzelleigenschaften unschlüssig macht. Daher ist es wichtig, Assays zu erstellen, um Prostatastammzellen zu identifizieren und von ihren Tochtervorläufern zu trennen. Zu diesem Zweck besteht das Ziel des aktuellen Protokolls darin, ein Assay-System zu etablieren, das eine effiziente Identifizierung und Isolierung von Stammzellen aus menschlichen Prostatageweben ermöglicht, gefolgt von einer robusten nachgelagerten Analyse ihrer biologischen Funktionen.

Langfristige 5-Brom-2'-Deoxyuridin (BrdU) Etikettenretention ist weit verbreitet für in vivo und In-vitro-Lineage-Tracing von Stammzellen auf der Grundlage ihrer verlängerten Verdoppelungszeit9,10. Der aktuelle Ansatz zur Identifizierung und Isolierung von Prostatastammzellen basiert auf ihren relativen Ruhecharakteristik- und Beschriftungsretentionseigenschaften innerhalb einer gemischten Epithelpopulation. Darüber hinaus können auf der Grundlage der unsterblichen Strang-DNA-Hypothese nur Stammzellen asymmetrische Zellteilung durchlaufen. Die Stammzelle stellt die Tochterzelle dar, die die ältere elterliche DNA enthält, während die Vorläuferzelle, die eine engagierte Tochterzelle ist, die neu synthetisierte DNA empfängt. Die oben beschriebene einzigartige Stammzelleigenschaft wird genutzt, um brdU-Kennzeichnung enthoben Stammzellen in Primärkulturen durchzuführen und dann ihr Etikett nach BrdU-Waschung nach dem Transfer in die 3D-ankerfreie Sphäroidkultur nachzuverfolgen. Während die Mehrheit der primären Prostataepithelzellen einen basalen und transitverstärkenden Phänotyp in der 2D-Kultur behält, gibt es auch eine seltene Population von multipotenten Stammzellen, die die epitheliale Homöostase auffüllen und aufrechterhalten, wie die Bildung von Sphäroiden oder vollständig differenzierten Organoiden mit entsprechenden Kulturmedien beim Transfer auf 3D-Systeme3,12belegt. In unserem aktuellen Protokoll identifizieren wir durch die Verwendung von HPrEC Prostatasphäroiden oder prostasphärenbasierten BrdU-, CFSE- oder Far Red Retentionstests, gefolgt von fluoreszaktivierter Zellsortierung (FACS), etikettenhaltende Stammzellen in Sphäroiden auf einer Einzelzellebene13.

Wichtig ist, dass wir die Stammzelleigenschaften von etikettenerhaltenden Zellen in frühen Sphäroiden im Vergleich zu den Vorläuferzellen mit Lineage-Verpflichtung weiter bestätigt haben. Dazu gehören Stammzell asymmetrische Teilung, In-vitro-Sphäroid-Bildungsfähigkeit und In-vivo-Geweberegenerationsfähigkeit, erhöhte Autophagie-Aktivität, augmentierte Ribosome-Biogenese und verminderte metabolische Aktivität. Anschließend wurde die RNAseq-Analyse durchgeführt. Es wurden differenziell exprimierte Gene in etikettenerhaltenden Sphäroidzellen beobachtet, die als neuartige Biomarker für menschliche Prostatastammzellen dienen können. Dieser sphäroidbasierte Label-Retaining-Ansatz kann auf Krebsproben angewendet werden, um eine kleine Anzahl von krebsstammähnlichen Zellen zu identifizieren, wodurch translationale Möglichkeiten zur Verwaltung der therapeutischen resistenten Populationen13. Im Folgenden wird der prostasphärenbasierte Labelretentionstest am Beispiel menschlicher Primärprostataepithelzellen (HPrEC) vorgestellt.

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Protokoll

Alle Zellhandhabungs- und Medienpräparate sollten mit aseptischer Technik in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II (BSC) durchgeführt werden.

1. Kultur und Pflege von HPrEC-Zellen in 2D

  1. 100 mm Kulturgerichte mit 2 ml 2,5 g/cm2 Fibronectinlösung über Nacht bei Raumtemperatur (RT) beschichten. Die Lösung ansaugen und die Kulturgerichte im BSC 45 min lufttrocknen lassen. Fibronectin-beschichtete Kulturgerichte können 2–4 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
  2. Fügen Sie 9 ml des Prostataepithelzellwachstumsmediums (z.B. PrEGM) zu einer fibronectinbeschichteten 100-mm-Kulturschale hinzu und halten Sie die Schale in einemCO2-Inkubator bei 37 °C warm.
  3. Eine Durchstechflasche mit gefrorenen HPrEC-Zellen (2 x 105/ml) in einem 37 °C-Wasserbad auftauen und die Zellen in 10 ml warmem Medium wieder aufhängen.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.
  5. Die Zellen in 1 ml des warmen Kulturmediums gründlich wieder aussetzen. Samenzellen durch Pipettieren von 1 ml der Zellsuspension direkt in die fibronectinbeschichtete 100 mm Kulturschale, die 9 ml des vorgewärmten Mediums enthält (Gesamtvolumen von Medium und Zellen beträgt 10 ml). Kulturgerichte bei 37 °C wieder in einen CO2-Inkubator geben.
  6. Füllen Sie das Medium alle 2 Tage auf. Um dies zu tun, sorgfältig alle Medien aspirieren und fügen Sie 10 ml frisches warmes Medium.
  7. Stellen Sie in ca. 5 Tagen sicher, dass die Kulturen zu 70–80 % konfluent sind. Führen Sie die enzymatische Verdauung durch Inkubation der Zellen mit 3 ml 0,05% Trypsin/EDTA bei 37 °C für 5 min.
  8. Beenden Sie die Verdauung, indem Sie 3 ml warme PBS mit 10% FBS hinzufügen.
  9. Sammeln Sie die Zellen in einem 50 ml Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.
  10. Das Zellpellet in 30 ml warmem Medium aufhängen und gleichmäßig in drei neue fibronectinbeschichtete 100-mm-Kulturgerichte für den nächsten Durchgang geben.
    HINWEIS: Primäre HPrEC-Zellen können 3–5x durchgesiedelt werden, ohne ihre Basalepithelzelleigenschaften zu verändern. Epitheliale Phänotyp wird durch Ausdrücke der basalen Epithelzellmarker Cytokeratin 5 und p63 mit Immunozytochemie/Immunfluoreszenz (ICC/IF) Assays getestet.

2. Etikettierung von HPrEC mit BrdU-, CFSE- oder Far Red-Pro-Farbstoffen

HINWEIS: Die Zellen können entweder mit Schritt 2.1 oder Schritt 2.2 fortfahren, gefolgt von der Übertragung in die 3D-Prostasphärenkultur, wie in Schritt 3.1 beschrieben.

  1. Einzelbeschriftung von Zellen mit BrdU
    1. Kultur 2 x 105 HPrEC-Zellen in fibronectinbeschichteten 100-mm-Kulturgerichten mit 10 ml warmem Medium mit 1 'M BrdU. Kultur die Zellen für 10 Tage (über zwei Passagen), um die Kennzeichnung aller Zellen einschließlich Prostatastamm und Vorläuferzellen zu gewährleisten.
    2. Nach 10 Tagen das PrEGM-Medium, das die BrdU enthält, sorgfältig ansaugen und die Zellen mit 5 ml warmem PBS waschen. Wiederholen Sie 1x.
    3. Führen Sie die enzymatische Verdauung mit 0,05% Trypsin/EDTA durch, wie in den Schritten 1.7–1.8 beschrieben. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.
    4. Setzen Sie die BrdU-markierten Pelletzellen (5 x 104) in 500 l eiskalte (1:1) Kellermembranmatrix/-medium aus und übertragen Sie sie 5 Tage lang in eine 3D-Prostasphärenkultur (beschrieben in Schritt 3.1), um brdU-Auswaschen während der Sphäroidbildung zu ermöglichen (ca. 6 Zellzyklen).
  2. Doppelte Kennzeichnung von Zellen mit BrdU und CFSE oder Far Red Pro-Farbstoffen
    1. Wenn eine Co-Etikettierung für lebende Zellen gewünscht ist, nehmen Sie voretikettierte Zellen, die mit BrdU bebrütet werden, für 10 Tage ab Schritt 2.1 und co-label mit 5 'M CFSE oder Far Red Live Cell fluorescent pro-dyes für 30 min. Führen Sie die Co-Labeling an Tag 10 durch.
    2. Das Medium, das BrdU und CFSE oder Far Red Pro-Farbstoffe enthält, vorsichtig ansaugen. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml warmem PBS. Wiederholen Sie die Wäsche 1x.
    3. Führen Sie die enzymatische Verdauung mit 0,05% Trypsin/EDTA durch, wie in den Schritten 1.7–1.8 beschrieben. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei RT. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
    4. Setzen Sie die ko-markierten Zellen (5 x 104) in 500 l eiskalte (1:1) Kellermembranmatrix/-medium aus und übertragen Sie sie für 5 Tage in eine 3D-Prostasphärenkultur (siehe Abschnitt 3.1), um BrdU und CFSE oder Far Red während der Sphäroidbildung (6 Zellzyklen) zu ermöglichen.
  3. Führen Sie die Detektion von etikettenerhaltenden Zellen in Kugeln (Tag 5 Prostasphären) durch, wie in den Schritten 4.1, 4.2, 4.3 oder 5 beschrieben.
    HINWEIS: Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE) und Far Red sind langlebige fluoreszierende Profarbstoffe und werden in den markierten Zellen gut zurückgehalten. Intrazelluläre Esterase in lebenden Zellen spalten die Acetatgruppen, die die grünen oder roten fluoreszierenden Moleküle aktivieren, die jetzt membranimpermeant sind.

3. Prostasphärenbildung im 3D-Kellermembrankultursystem

  1. Prostasphärenkultur im 3D-Kellermembranmatrixsystem
    1. Die Kellermembranmatrix über Nacht bei 4 °C auftauen und vor Gebrauch auf Eis halten.
    2. Fügen Sie 1 ml eiskalte Kellermembranmatrix vorsichtig in ein gleiches Volumen des eiskalten Kulturmediums ein. Langsam mischen, indem Sie nach oben und unten, Vermeidung von Blasen.
      ANMERKUNG: Beschichten Sie den Boden von 12 Brunnenplattenbrunnen mit 100 l dieser Lösung vor. Dadurch wird die Anzahl der Zellen minimiert, die durch die Matrix fallen und als Monolayer wachsen.
    3. 5 x 104 HPrEC-Zellen in eiskalter (1:1) Kellermembranmatrix/Kulturmittelmischung in einem Gesamtvolumen von 500 l resuspendieren.
    4. Pipette 500 l dieser Zelllösung um den unteren Rand jedes Brunnens.
    5. Wirbeln Sie die Platte, um die Mischung gleichmäßig um den Rand des Brunnens zu verteilen. Legen Sie die Platte 30 min in einen CO2-Inkubator bei 37 °C, damit sich die Matrix erstarren lässt.
    6. Sobald sich die Matrix verfestigt hat, decken Sie mit 1 ml warmem Kulturmedium pro Brunnen ab. Stören Sie den Kellermembran-Matrixring nicht. Zielen Sie vorsichtig auf die Pipettenspitze und geben Sie das Kulturmedium in die Mitte des Brunnens.
      HINWEIS: Das Kulturmedium muss auf 37 °C erwärmt werden, wenn es der erstarrten Kellermembranmatrix hinzugefügt wird. Die Kellermembranmatrix verliert ihre Integrität und löst sich auf, wenn sie kalten/kühlen Medien ausgesetzt ist.
    7. Auffüllen Medium alle 2 Tage. Saugen Sie vorsichtig 500 L des verbrauchten Mediums an und fügen Sie 500 l frisches warmes Kulturmedium hinzu.
    8. Überwachen Sie die Prostasphärenbildung und das Wachstum für 5–7 Tage mit einem invertierten Mikroskop.
  2. Passage von Prostasphären
    1. Ernte Prostasphären aus der Matrix, indem sie so viel Medien wie möglich sorgfältig absaugt. Vermeiden Sie es, schwimmende Teile der erstarrten Matrix zu stören oder aufzusammeln.
    2. Fügen Sie 1 ml Dispase-Lösung hinzu (Kellermembranmatrix:Dispase im Verhältnis 1:2). Mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals.
    3. Inkubieren Sie die Kulturplatten in einemCO2-Inkubator bei 37 °C für 30 min.
    4. Nehmen Sie Bilder von Prostasphären, die am unteren Ende des Kulturgerichts für Kugelzahlenzählung und Größenmessungen sind.
    5. Sammeln Sie das Kugelgemisch in ein 15 ml Rohr. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 500 x g für 5 min bei RT, um die Kugeln zu pellet. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.
    6. Dispergieren Sie die Kugeln in einzelne Zellen, indem Sie mit 500 l warmem 0,05% Trypsin/EDTA verdauen und die Suspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen.
    7. Inkubieren Sie das Mikrozentrifugenrohr in einemCO2-Inkubator bei 37 °C für 5 min.
    8. Beenden Sie die Trypsin-Aktion mit 500 l warmen PBS, die 10% FBS enthalten. Passieren Sie die verdaute Kugelsuspension durch eine 1 ml Spritze mit einer 26 G Nadel 5x, um die Kugeln in einzelne Zellen zu dissoziieren.
    9. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 500 x g für 5 min, um die Zellen bei RT zu pellet. Den Überstand ansaugen und entsorgen.
    10. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml warmes Kulturmedium wieder auf und filtern Sie es durch ein 40 m porengroßes Nylonzellsieb.
    11. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min, um die Zellen bei RT zu pellet. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.
    12. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml eiskalter (1:1) Kellermembranmatrix/Kulturmedium und Subkultur in einer 3D-Kellermembranmatrix für den zweiten Durchgang der Prostasphäre wieder auf.

4. Identifizierung von BrdU-erhaltenden Prostatastammzellen durch immunfluoreszierende Färbung

  1. Outgrow die angeschlossenen Prostasphären gefolgt von Immunfluoreszenz (IF) Färbung für Prostata-Stammzell 2D-Bildgebung.
    1. Ernte prostasphärend durch Dispase-Verdauung, wie in den Schritten 3.2.1–3.2.3 beschrieben. Zentrifugieren Sie die Kugeln in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr bei 500 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
    2. Resuspend Kugeln in 1 ml warmen Kulturmedium.
    3. In einem 37 °C-Inkubator über Nacht in einem 37 °C-Inkubator 50 Prostasphären pro Brunnen pro Brunnen in 8 Brunnenkammerrutschen in 200 L Kulturmedium inkubieren, um das An- und Auswachsen von Kugeln zu ermöglichen.
    4. An Tag 2 das Kulturmedium ansaugen und verwerfen. Waschen Sie die ausgewachsenen Kugeln mit 200 l PBS für 5 min.
    5. Fixieren Sie die Kugeln in 200 l/Well von eiskaltem Methanol bei -20 °C für 20 min.
    6. Waschen Sie die Kugeln mit 200 L/Well von PBS für 5 min. Wiederholen Sie 2x.
    7. Säure-Waschkugeln mit 200 l/Well von 2N HCl für 30 min bei RT.
    8. Waschen Sie die Kugeln mit 200 L/Well von PBS für 5 min. Wiederholen Sie 3x.
    9. Fügen Sie 100 l Blockierlösung mit 5% normalem Ziegenserum in PBST (PBS mit 0,25% Triton X-100) hinzu und brüten 30 min bei RT.
    10. Apirieren Sie die Blockierlösung ab und fügen Sie jedem Brunnen 100 l PBST mit 2% normalem Ziegenserum und primärem Maus-Antihuman-BrdU-Antikörper (1:200) hinzu und in einer befeuchteten Box bei 4 °C über Nacht inkubieren.
      HINWEIS: Mouse IgG Antikörper wird als Negativkontrolle verwendet.
    11. Aspirieren und entfernen Sie die primäre Antikörperlösung. Waschen Sie die Kugeln mit 200 l PBS für 5 min. Wiederholen Sie 2x.
    12. Fügen Sie jedem Bohrkörper 100 l PBST mit 2% normalem Ziegenserum und sekundärem Ziegenanti-Maus-Antikörper Alexa Fluor 488 (1: 500) hinzu und inkubieren Sie bei RT im Dunkeln 2 h.
    13. Aspirieren und entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung. Waschen Sie die Kugeln mit 200 l PBS für 5 min. 3x wiederholen.
    14. Montieren Sie die Dias mit einem wässrigen Montagemedium mit DAPI-Haltigem Montagemedium von 25-40 l.
    15. Erhalten Sie Bilder der gebeizten Kugeln/Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop und einer Farb-Digitalkamera.
  2. Ganze Mount IF Färbung von Prostasphären für Prostatastammzell 3D-Bildgebung
    HINWEIS: Für die gesamte Mount IF Färbung werden Prostasphären mit 1,5 ml Mikrozentrifugenrohren behandelt.
    1. Ernte der Prostasphären durch Dispase-Verdauung, wie in den Schritten 3.2.1–3.2.3 beschrieben. Zentrifugieren Sie die Kugeln in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr bei 500 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und entsorgen.
    2. Die Kugeln mit 1 ml 4% Paraformaldehyd bei RT für 20 min aufheben und fixieren. Zentrifugieren Sie die Kugeln bei 500 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und entsorgen.
    3. Waschen Sie die Kugeln, indem Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder aufhängen. Zentrifugieren Sie die Kugeln bei 500 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und entsorgen. Wiederholen Sie 1x.
    4. Säure waschen Sie die Kugeln durch Wiederaufhängen des Pellets in 1 ml von 2N HCl für 30 min.
    5. Waschen Sie die Kugeln mit 1 ml PBS für 5 min und Zentrifuge bei 500 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen. Wiederholen Sie 3x.
    6. 15–30 Kugeln in 100 l Blockierlösung, die 5% normales Ziegenserum in PBST (PBS mit 0,25% Triton X-100) enthält, wieder aufhängen und 30 min bei RT inkubieren.
    7. Um die Blockierlösung zu entfernen, zentrieren Sie die Kugeln bei 500 x g für 5 min. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.
    8. Setzen Sie die Kugeln in 100 l PBST mit 2% normalem Ziegenserum und primärem Maus-Antihuman-BrdU-Antikörper (1:200) wieder aus und inkubieren Sie sie bei 4 °C über Nacht.
    9. Waschen Sie die Kugeln, indem Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder aufhängen. Zentrifugieren Sie die Kugeln bei 500 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und entsorgen. Wiederholen Sie 1x.
    10. Setzen Sie die Kugeln in 100 l PBST mit 2% normalem Ziegenserum und sekundärem Ziegenanti-Maus-Alexa Fluor 488-Antikörper (1:1.000) wieder aus und brüten bei RT für 2 h.
    11. Waschen Sie die Kugeln, indem Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder aufhängen. Zentrifugieren Sie die Kugeln bei 500 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und entsorgen. Wiederholen Sie 1x.
    12. Setzen Sie die Kugeln in 30–50 l wässrigen Montagemediums, das DAPI enthält, wieder ab. Um eine Abflachung der Kugeln zu verhindern, geben Sie sie in eine gut erstellte 35 mm unbeschichtete Kulturschale mit einem Abdeckglasboden. Dann fügen Sie einen Coverslip zum Kulturgericht hinzu und decken den Brunnen ab.
    13. Erfassen Sie ganze Kugel Z-Stack-Bilder mit einem durchlichtelichten invertierten fluoreszierenden konfokalen Mikroskop. Konvertieren Sie diese Z-Stack-Bilder in 3D-Bilder mit einer Bildverarbeitungssoftware mit Freiform-Zeichnungsfunktionen.
      HINWEIS: Mouse IgG Antikörper wird als Negativkontrolle verwendet.
  3. Gepaart-Zell-Analyse (4-Tage-Protokoll)
    1. Kultur die BrdU-markierten Kugeln bis Tag 5.
    2. Tag 1: Ernten Sie die Kugeln aus einer Kellermembranmatrix mit 1 ml Dispase-Verdauung. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, wie in den Schritten 3.2.1–3.2.11 beschrieben, in einzelne Zellen verteilt.
    3. Setzen Sie die Zellen in 1 ml warmen Kulturmedium.
    4. Die dispergierten Einzelzellen (300–500 PRO Brunnen) in 8 Wellkammer-Dias und Kultur in 200 L/Well-Kultur-Medium über Nacht verätzen, um eine Befestigung zu ermöglichen.
    5. Tag 2: Ändern Sie das Kulturmedium mit 200 l von 2 'M Cytochalasin D im Kulturmedium und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C, um eine Zellteilung zu ermöglichen, die in der späten Metaphase zur Anaphase pausiert.
    6. Tag 3–4: Aspirieren und entsorgen Sie das Medium. Fixzellen in 200 L/Well von eiskaltem Methanol bei -20 °C für 20 min. Folgen Sie dem Immunstainierungsprotokoll für BrdU, wie in den Schritten 4.1.5–4.1.14 beschrieben.
    7. Nehmen Sie Bilder von gepaarten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen den beiden Kernen weniger als 30 m beträgt. Identifizieren Sie die gepaarten Stammzellen anhand der BrdU-Retention als symmetrische oder asymmetrische Zellteilung.
      ANMERKUNG: BrdU-etikettenerhaltende Prostatastammzellen durchlaufen eine symmetrische Teilung, so dass zwei Tochterstammzellen eine gleiche Menge an BrdU behalten, während Stammzellen, die sich einer asymmetrischen Teilung unterziehen, dazu führen, dass eine Tochter-Stammzelle alle BrdU und die andere Tochter-Vorläuferzelle, die das BrdU-Label verloren hat.

5. Isolierung der CFSE-etikettenerhaltenden Prostatastammzellen durch FACS-Sortierung

  1. Tag 5: Ernte die CFSE-markierten Tag 5 Prostasphären, die in 6 Brunnenkulturplatten in der 3D-Kultur wachsen, indem sie das Medium durch 2 ml Dispase ersetzen (Kellermembranmatrix: Dispase im Verhältnis 1:2). Pipette auf und ab mehrmals gründlich mischen.
  2. Inkubieren Sie die Platten in einem CO2-Inkubator bei 37 °C für 30 min, um die Matrix zu verdauen.
  3. Sammeln Sie das Kugelgemisch in ein 15 ml Zentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Kugeln bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen.
  4. Das Kugelpellet in 500 l warmem Trypsin/EDTA aussetzen und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr geben.
  5. Inkubieren Sie die Kugeln in einem CO2-Inkubator bei 37 °C für 5 min. Fügen Sie 500 l warme PBS mit 10% FBS hinzu.
  6. Passieren Sie die Kugeln durch eine 1 ml Spritze mit einer 26 G Nadel 5x, um die Kugeln vollständig in einzelne Zellen zu trennen.
  7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.
  8. Setzen Sie die Zellen in 1 ml warmem Kulturmedium, das 1 g/ml Propidiumjodid (PI) enthält, wieder ab, um abgestorbene Zellen zu färben. 1 min bei RT inkubieren.
  9. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.
  10. Setzen Sie die Zellen in 1 ml warmen Kulturmedium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.
  11. Setzen Sie die Zellen in 500 l warmes Kulturmedium wieder auf und sammeln Sie die Zellen in 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen, indem Sie sie durch 35-m-Poren-Zellen-Sieb-Snap-Caps filtern.
  12. Führen Sie die Analyse von Trypsin-dispergierten CFSE-markierten Prostasphärenzellen mit einem einkanaligen FACS-Analysator durch.
  13. Gate die Subpopulationen der fraktionierten CFSEHi, CFSEMedund CFSELo Zellen. Verwenden Sie die negativen und positiven Steuerelemente für gating.
    HINWEIS: Das Vorhandensein von FACS-sortierten CFSE-kennzeichnungserhaltenden Prostatastammzellen (siehe Hu et al.13) kann durch grüne Fluoreszenzmikroskopie und ihre größere Zellgröße im Vergleich zu nicht-erhaltenden Zellen bestätigt werden. Diese größere Zellgröße ist eine Eigenschaft von Prostatastammzellen relativ zu Vorläuferzellpopulationen. Dies kann bei anderen Gewebetypen anders sein.

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Ergebnisse

Primäre normale menschliche Prostataepithelzellen werden in fibronectinbeschichtete Kulturgerichte gelegt und das Zellwachstum wird in der 2D-Kultur beibehalten (Abbildung 1a). Beim Transfer in die 3D-Kultur mit einer Kellermembranmatrix sterben differenzierte Epithelzellen langsam aus. Nur Prostatastammzellen können in einer ankerfreien Kultur überleben und in 5 Tagen Sphäroide bilden (Abbildung 1b).

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Diskussion

Die Durchflusszytometrie mit mehreren Stammzelloberflächenmarkern ist ein häufig verwendeter Ansatz für die Stammzellforschung, obwohl es an Spezifität und Selektivität1,5,6fehlt. Während die Sphäroidbildung in einem 3D-Kultursystem eine weitere nützliche Methode zur Anreicherung der seltenen Stammzellpopulation aus primären Epithelzellen, einschließlich HPrEC, ist, sind die resultierenden Sphäroide immer noch eine heterogene Mi...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine finanziellen Beziehungen zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Stipendien des National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH) unterstützt. Wir danken dem Flow Cytometry Core an der University of Illinois in Chicago für die Unterstützung bei der Zellsortierung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,05 % Trypsin-EDTAGibco25300-054
1 mL TuberkulinspritzenBectin DickinsonBD 309625
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, sterile
100 mm KulturschalenCorning/Falcon353003
12-Well-KulturplatteCorning/Falcon353043
15 mL Zentrifuge RöhrchenCorning/Falcon352097
22 x 22 mm Deckgläser, sqCorning284522Für MatTek 35 mm Kulturschale
24 x 50 mmDeckgläser Corning2975245
26G x 1,5 Zoll InjektionsnadelMonoject1188826112
2N HCl
35 mm Kulturschale mit DeckglasbodenMatTek CorpP35G-0-10-CGlasboden Nr. 0, unbeschichtet, figure-materials-1 bestrahlt
40 & Mikro; m Poren-Zellsieb aus NylonCorning352340
5 % CO2-Kultur-Inkubator, 37 > CForma
50 mL ZentrifugenröhrchenCorning/Falcon352098
5 mL Polystyrol Rundbodenröhrchen mit SiebschnappkappeCorning35223535 & micro; m Nylonnetz
6-Well-KulturplattenCorning353046
8-Well-ObjektträgerMillipore SigmaPEZGS0816
Wässriges Einbettmedium mit DAPIVector LaboratoriesH-1200A nuklearer Fluoreszenzfarbstoff
Biologische Sicherheitswerkstatt, Level 2 zertifiziert
BrdU (5-Brom-2'-Desoxyuridin)Sigma-AldrichB50021 mM Stammlösung in DMSO
Zentrifuge für 1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenEppendorf
Zentrifuge für 15 mL RöhrchenBeckman CoulterAllegra 6
CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidylester)Thermo Fisher ScientificC345545 mM Stammlösung in DMSO
Cytochalasin DThermo Fisher Scientific
Dispase 1U/mLStemCell Technologies07923
FACS CellSorter MoFlo XDPBeckman Coulters
Far-Red Pro-FarbstoffThermo FisherC345645 mM Stammlösung in DMSO
Fetal Bovine Serum (FBS)
FibronektinSigma-AldrichF0895Zum Beschichten von 100 mm Kulturschalen
Fluoreszenzmikroskop mit Farb-DigitalkameraCarl ZeissAxioskop 20 Fluoreszenzmikroskop; Farb-Digitalmikroskop Axiocamera
Ziege Anti-Maus-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488Thermo FisherA-11029
HPrEC (Primäre normale menschliche Prostataepithelzellen)Lifeline Cell TechnologyFC-0038Gepoolt von 3 jungen (19-21 Jahre alten) krankheitsfreien Organspendern; 1 x 105 Zellen/ml; gelagert in flüssigem
Stickstoff-Eiskübel und Eis
Invertiertes Mikrosope mit Digitalkamera
Matrigel, niedriger Wachstumsfaktor, phenolrotfreiCorning356239
MethanolCorningA452-4
Maus Anti-BrdU AntikörperCell Signaling5292S
Maus IgG Antikörper ( SantaCruz Biotechnologysc-2025
Normales ZiegenserumVector LaboratoriesS-1000
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4Sigma-AldrichP5368-10PAK
Pipetten und Spitzen, verschiedene Größen
PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)Lifeline Cell TechnologyLL-0041
Propidiumiodid (PI)R & D Systems5135/1010 μ g/mL PI in PBS gelagert bei 4 ° C im Dunkeln
Serologische Pipetten, verschiedene Größen
Software für Kugelzählung und Größenmessungen
Software: 3D-Bilder mit Imaris, einer Bildbearbeitungssoftware mit Freiform-Zeichenfunktionen
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Wasserbad, 37 > C
z-Stapel-Bilder mit einem inversen Fluoreszenz-Konfokalmikroskop
PHZ1063 mit Durchlicht

Referenzen

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