Unter Verwendung menschlicher primärer Prostataepithelzellen berichten wir über eine neuartige biomarkerfreie Methode der funktionellen Charakterisierung von stammähnlichen Zellen durch einen sphäroidbasierten Labelretentionstest. Für die Beschriftung von BrdU-, CFSE- oder Far Red 2D-Zellen wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll beschrieben. dreidimensionale Sphäroidbildung; kennzeichnungserhaltende stammähnliche Zellidentifikation durch Immunzytochemie; isolierung durch FACS.
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Methodenartikel
Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Trotz der Fortschritte in der adulten Stammzellforschung bleibt die Identifizierung und Isolierung von Stammzellen aus Gewebeproben eine große Herausforderung. Während ansässige Stammzellen mit Nischenbeschränkungen in erwachsenen Geweben relativ still sind, treten sie in einer ankerfreien dreidimensionalen (3D) Kultur in den Zellzyklus ein und durchlaufen sowohl eine symmetrische als auch eine asymmetrische Zellteilung, was sowohl Stamm als auch Vorläufer Zellen. Letztere vermehren sich schnell und sind die Hauptzellpopulation in verschiedenen Stadien der Abstammungsbindung, die heterogene Sphäroide bilden. Unter Verwendung der primären normalen menschlichen Prostataepithelzellen (HPrEC) wurde ein sphäroidbasierter, etikettenretentionsbezogener Assay entwickelt, der die Identifizierung und funktionelle Isolierung der sphäroid-initiierenden Stammzellen bei einer einzelzelligen Auflösung ermöglicht.
HPrEC oder Zelllinien werden mit BrdU für 10 Tage zweidimensional (2D) kultiviert, um ihre Aufnahme in die DNA aller teilenden Zellen, einschließlich selbsterneuernder Stammzellen, zu ermöglichen. Das Auswaschen beginnt mit der Übertragung in die 3D-Kultur für 5 Tage, in denen sich Stammzellen durch asymmetrische Teilung selbst erneuern und die Sphäroidbildung initiieren. Während relativ stille Tochterstammzellen BrdU-markierte Eltern-DNA behalten, vermehren sich die Tochtervorläufer schnell und verlieren das BrdU-Label. BrdU kann durch CFSE- oder Far Red Pro-Dyes ersetzt werden, die eine livee Stammzellisolierung durch FACS ermöglichen. Die Merkmale der Stammzellwerden werden durch in vitro sphäroide Bildung, In-vivo-Geweberegenerationstests und durch Dokumentation ihrer symmetrischen/asymmetrischen Zellteilungen bestätigt. Die isolierten, etikettenerhaltenden Stammzellen können durch nachgeschaltete molekulare und biologische Studien, einschließlich RNA-seq, ChIP-seq, Einzelzellerfassung, Metabolische Aktivität, Proteomprofilierung, Immunzytochemie, Organoidbildung und In-vivo-Geweberegeneration, streng abgefragt werden. Wichtig ist, dass dieser markerfreie funktionelle Stammzellisolationsansatz stammähnliche Zellen aus frischen Krebsproben und Krebszelllinien aus mehreren Organen identifiziert, was auf eine breite Anwendbarkeit hindeutet. Es kann verwendet werden, um Krebsstamm-ähnliche Zell-Biomarker zu identifizieren, Sieb-Arzneimittel, die auf Krebsstammzellen-ähnliche Zellen abzielen, und neue therapeutische Ziele bei Krebs zu entdecken.
Einleitung
Die menschliche Prostata enthält luminale Epithel mit sekretorische Funktion und Basalzellen, die ihm zusammen mit einer ungewöhnlichen neuroendokrinen Zellkomponente zugrunde liegen. Die Epithelzellen werden in diesem Fall aus einer seltenen Population von Prostatastammzellen erzeugt, die in vivo relativ still sind und als Reparatursystem fungieren, um die Drüsenhomöostase im Laufe des Lebens aufrecht zu erhalten1. Trotz vieler Fortschritte bleibt die Identifizierung und funktionelle Isolierung von Prostatastammzellen eine große Herausforderung auf dem Gebiet. Stammzell-Biomarker, einschließlich zelloberflächenmarkerbasierter Methoden in Kombi....
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Protokoll
Alle Zellhandhabungs- und Medienpräparate sollten mit aseptischer Technik in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II (BSC) durchgeführt werden.
1. Kultur und Pflege von HPrEC-Zellen in 2D
- 100 mm Kulturgerichte mit 2 ml 2,5 g/cm2 Fibronectinlösung über Nacht bei Raumtemperatur (RT) beschichten. Die Lösung ansaugen und die Kulturgerichte im BSC 45 min lufttrocknen lassen. Fibronectin-beschichtete Kulturgerichte können 2–4 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
- Fügen Sie 9 ml des Prostataepithelzellwachstumsmediums (z.B. PrEGM) zu einer fibronectinbeschichteten 100-mm-Kulturschale hinzu und halten Sie die S....
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Ergebnisse
Primäre normale menschliche Prostataepithelzellen werden in fibronectinbeschichtete Kulturgerichte gelegt und das Zellwachstum wird in der 2D-Kultur beibehalten (Abbildung 1a). Beim Transfer in die 3D-Kultur mit einer Kellermembranmatrix sterben differenzierte Epithelzellen langsam aus. Nur Prostatastammzellen können in einer ankerfreien Kultur überleben und in 5 Tagen Sphäroide bilden (Abbildung 1b).
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Diskussion
Die Durchflusszytometrie mit mehreren Stammzelloberflächenmarkern ist ein häufig verwendeter Ansatz für die Stammzellforschung, obwohl es an Spezifität und Selektivität1,5,6fehlt. Während die Sphäroidbildung in einem 3D-Kultursystem eine weitere nützliche Methode zur Anreicherung der seltenen Stammzellpopulation aus primären Epithelzellen, einschließlich HPrEC, ist, sind die resultierenden Sphäroide immer noch eine heterogene Mi.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine finanziellen Beziehungen zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Studie wurde durch Stipendien des National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH) unterstützt. Wir danken dem Flow Cytometry Core an der University of Illinois in Chicago für die Unterstützung bei der Zellsortierung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL Tuberkulinspritzen | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, sterile | |||
| 100 mm Kulturschalen | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-Well-Kulturplatte | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL Zentrifuge Röhrchen | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm Deckgläser, sq | Corning | 284522 | Für MatTek 35 mm Kulturschale |
| 24 x 50 mm | Deckgläser Corning | 2975245 | |
| 26G x 1,5 Zoll Injektionsnadel | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm Kulturschale mit Deckglasboden | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glasboden Nr. 0, unbeschichtet,  bestrahlt |
| 40 & Mikro; m Poren-Zellsieb aus Nylon | Corning | 352340 | |
| 5 % CO2-Kultur-Inkubator, 37 > C | Forma | ||
| 50 mL Zentrifugenröhrchen | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5 mL Polystyrol Rundbodenröhrchen mit Siebschnappkappe | Corning | 352235 | 35 & micro; m Nylonnetz |
| 6-Well-Kulturplatten | Corning | 353046 | |
| 8-Well-Objektträger | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Wässriges Einbettmedium mit DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuklearer Fluoreszenzfarbstoff |
| Biologische Sicherheitswerkstatt, Level 2 zertifiziert | |||
| BrdU (5-Brom-2'-Desoxyuridin) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM Stammlösung in DMSO |
| Zentrifuge für 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Eppendorf | ||
| Zentrifuge für 15 mL Röhrchen | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidylester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM Stammlösung in DMSO |
| Cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | ||
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulters | ||
| Far-Red Pro-Farbstoff | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM Stammlösung in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronektin | Sigma-Aldrich | F0895 | Zum Beschichten von 100 mm Kulturschalen |
| Fluoreszenzmikroskop mit Farb-Digitalkamera | Carl Zeiss | Axioskop 20 Fluoreszenzmikroskop; Farb-Digitalmikroskop Axiocamera | |
| Ziege Anti-Maus-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primäre normale menschliche Prostataepithelzellen) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Gepoolt von 3 jungen (19-21 Jahre alten) krankheitsfreien Organspendern; 1 x 105 Zellen/ml; gelagert in flüssigem |
| Stickstoff-Eiskübel und Eis | |||
| Invertiertes Mikrosope mit Digitalkamera | |||
| Matrigel, niedriger Wachstumsfaktor, phenolrotfrei | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Maus Anti-BrdU Antikörper | Cell Signaling | 5292S | |
| Maus IgG Antikörper ( Santa | Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normales Ziegenserum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipetten und Spitzen, verschiedene Größen | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidiumiodid (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μ g/mL PI in PBS gelagert bei 4 ° C im Dunkeln |
| Serologische Pipetten, verschiedene Größen | |||
| Software für Kugelzählung und Größenmessungen | |||
| Software: 3D-Bilder mit Imaris, einer Bildbearbeitungssoftware mit Freiform-Zeichenfunktionen | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Wasserbad, 37 > C | |||
| z-Stapel-Bilder mit einem inversen Fluoreszenz-Konfokalmikroskop |
Referenzen
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells
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Nachdrucke und Genehmigungen
