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Methodenartikel

Induzieren posttraumatische Epilepsie in einem Mausmodell von sich wiederholenden diffusen traumatischen Hirnverletzungen

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DOI:

10.3791/60360

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10. Februar 2020

 , 
1Fralin Biomedical Research Institute at Virginia Tech Carilion, 2School of Neuroscience, Virginia Tech, 3Department of Biological Sciences, Virginia Tech

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses systematische Protokoll beschreibt ein neues Tiermodell der posttraumatischen Epilepsie nach wiederholten leichten Schädel-Hirn-Verletzungen. Der erste Teil beschreibt die Schritte zur traumatischen Hirnverletzungsinduktion mit einem modifizierten Gewichtsabnahmemodell. Der zweite Teil enthält Anweisungen zum chirurgischen Ansatz für ein- und mehrkanalige elektroenzephalographische Datenerfassungssysteme.

Zusammenfassung

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind eine der Hauptursachen für erworbene Epilepsie. TBI kann zu einer fokalen oder diffusen Hirnverletzung führen. Fokale Verletzungen sind das Ergebnis direkter mechanischer Kräfte, die manchmal durch den Schädel eindringen und eine direkte Läsion im Hirngewebe verursachen. Diese sind während der Bildgebung des Gehirns als Bereiche mit Kontusion, Zerrung und Blutungen sichtbar. Fokale Läsionen induzieren neuronale Todesfälle und gliale Narbenbildung und sind bei 20% bis 25% aller Menschen, die ein TBI ereignen, vorhanden. In den meisten TBI-Fällen wird die Verletzung jedoch durch Beschleunigungsverzögerungskräfte und anschließende Gewebescherungen verursacht, was zu nicht fokalen, diffusen Schäden führt. Eine Subpopulation von TBI-Patienten entwickelt nach einer Latenzzeit von Monaten oder Jahren weiterhin eine posttraumatische Epilepsie (PTE). Derzeit ist es unmöglich vorherzusagen, welche Patienten PTE entwickeln werden, und Anfälle bei PTE-Patienten sind eine Herausforderung zu kontrollieren, was weitere Forschung erfordert. Bis vor kurzem beschränkte sich das Feld auf nur zwei Tier-/Nagetiermodelle mit validierten spontanen posttraumatischen Anfällen, die beide mit großen fokalen Läsionen mit massivem Gewebeverlust im Kortex und manchmal subkortikalen Strukturen aufwiesen. Im Gegensatz zu diesen Ansätzen wurde festgestellt, dass diffuses TBI, das mit einem modifizierten Gewichtsabfallmodell induziert wird, ausreicht, um die Entwicklung spontaner krampfhatiger und nicht krampfhaniger Anfälle zu initiieren, selbst wenn es keine fokalen Läsionen oder Gewebeverlust gibt. Ähnlich wie bei menschlichen Patienten mit erworbener posttraumatischer Epilepsie bietet dieses Modell eine Latenzzeit nach einer Verletzung vor dem Anfall. In diesem Protokoll wird der Gemeinschaft ein neues Modell der posttraumatischen Epilepsie zur Verfügung gestellt, in dem detailliert beschrieben wird, wie diffuses nicht-lesionales TBI induziert werden kann, gefolgt von einer kontinuierlichen Video-Elektroenzephalografischen Tierüberwachung über mehrere Monate hinweg. Dieses Protokoll wird die Handhabung von Tieren, das Gewichtfallverfahren, die Elektrodenplatzierung für zwei Erfassungssysteme und die häufigen Herausforderungen in jedem der Schritte der Operation, der postoperativen Überwachung und der Datenerfassung beschreiben.

Einleitung

Jedes Jahr sind weltweit schätzungsweise 60 Millionen Menschen von TBI betroffen. Betroffene Personen haben ein höheres Risiko, epilepsie zu entwickeln, die sich Jahre nach der anfänglichen Verletzung manifestieren kann. Obwohl schwere TBIs mit einem höheren Risiko für Epilepsie verbunden sind, erhöht selbstmildes TBI die Wahrscheinlichkeit, epilepsie nanzuentwickeln 1,2,3,4. Alle TBIs können als fokal, diffus oder als Kombination aus beidem klassifiziert werden. Diffuse Hirnverletzungen, die in vielen, wenn nicht allen TBIs vorhanden sind, sind das Ergebnis von Hirngeweben unterschiedlicher Dichte, die durch Beschleunigungsverzögerung und Rotationskräfte gegeneinander scheren. Per Definition tritt diffuse Verletzung nur isoliert bei leichten/konkussiven nicht durchdringenden Hirnverletzungen auf, bei denen keine Hirnläsionen auf Computertomographie-Scans sichtbar sind5.

Derzeit gibt es zwei kritische Probleme beim Management von Patienten, die an posttraumatischen Epilepsien (PTE) leiden oder einem Risiko ausgesetzt sind. Die erste ist, dass, sobald PTE manifestiert hat, Anfälle resistent gegen verfügbare Antiepileptika (AEDs)6sind. Zweitens sind AEDs ebenso wirkungslos bei der Verhinderung der Epileptogenese, und es gibt keine wirksamen alternativen therapeutischen Ansätze. Um dieses Defizit anzugehen und bessere therapeutische Ziele und Behandlungskandidaten zu finden, wird es notwendig sein, neue zelluläre und molekulare Mechanismen an der Wurzel von PTE6zu erforschen.

Eines der herausragenden Merkmale der posttraumatischen Epilepsie ist die latente Periode zwischen dem anfänglichen traumatischen Ereignis und dem Beginn spontaner, unprovozierter, wiederkehrender Anfälle. Die Ereignisse, die in diesem zeitlichen Fenster auftreten, sind ein natürlicher Fokus für Forscher, da dieses Zeitfenster die Behandlung und Prävention von PTE insgesamt ermöglichen könnte. Tiermodelle werden am häufigsten für diese Forschung verwendet, weil sie mehrere verschiedene Vorteile bieten, nicht zuletzt, dass eine kontinuierliche Überwachung menschlicher Patienten sowohl unpraktisch als auch kostspielig über solche potenziell langen Zeiträume wäre. Darüber hinaus können zelluläre und molekulare Mechanismen an der Wurzel der Epileptogenese nur in Tiermodellen erforscht werden.

Tiermodelle mit spontanen posttraumatischen Anfällen und Epilepsie werden gegenüber Modellen bevorzugt, bei denen Krampfanfälle nach TBI durch weniger physiologisch relevante Mittel induziert werden, z. B. durch Chemokonvulsiva oder elektrische Stimulation akut, chronisch oder durch Entmundung. Spontane posttraumatische Anfallsmodelle testen, wie TBI das gesunde Gehirnnetzwerk verändert, was zu epilektiöser Genese führt. Studien mit zusätzlicher Stimulation nach TBI bewerten, wie die Exposition gegenüber TBI die Anfallsschwelle verringert und die Anfälligkeit für Anfälle beeinflusst. Die Vorteile von Tiermodellen mit chemisch induzierten Anfällen oder mit elektrischer Stimulation liegen darin, die spezifischen Mechanismen der Refraktorik auf AEDs und die Wirksamkeit bestehender und neuartiger AEDs zu testen. Der Grad der Relevanz und Übersetzung dieser Daten für den Menschen kann jedochaufgrund der folgenden Aspekte mehrdeutig sein 7: 1) Die Anfallsmechanismen können sich von denen unterscheiden, die nur durch TBI induziert werden; 2) nicht alle diese Modelle führen zu spontanen Anfällen7; 3) Läsionen, die durch das Krampmittel selbst, mit der für seine Entbindung erforderlichen Kanüle oder durch stimulierte Elektrodenplatzierung in Tiefenstrukturen (z.B. Hippocampus oder Amygdala) erzeugt werden, können bereits eine erhöhte Anfallsanfälligkeit und sogar hippocampale epiptiforme Feldpotentialeverursachen 7. Darüber hinaus produzieren einige Krampfmittel (d.h. Kainsäure) direkte Hippocampusläsionen und Sklerose, die nach diffusem TBI nicht typisch ist.

Bis vor kurzem gab es nur zwei Tiermodelle der posttraumatischen Epilepsie: kontrollierte kortikale Einschlage (CCI, fokal) oder Flüssigkeitspercussion-Verletzung (FPI, fokal und diffus)8. Beide Modelle führen zu großen fokalen Läsionen neben Gewebeverlust, Blutungen und Gliose bei Nagetieren8. Diese Modelle imitieren posttraumatische Epilepsie, die durch große fokale Läsionen induziert wird. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass wiederholtes (3x) diffuses TBI für die Entwicklung von spontanen Anfällen und Epilepsie bei Mäusen auch ohne fokale Läsionen9ausreicht, wobei ein drittes Nagetier-PTE-Modell mit bestätigten spontanen wiederkehrenden Anfällen hinzugefügt wird. Dieses neue Modell imitiert zelluläre und molekulare Veränderungen, die durch diffuses TBI induziert werden, und repräsentiert die menschliche Bevölkerung besser mit milden, konkussiven TBIs. In diesem Modell ermöglicht die latente Periode von drei Wochen oder mehr vor dem Anfall des Anfalls und das Auftreten von späten, spontanen, wiederkehrenden Anfällen die Untersuchung der Ursachen der posttraumatischen Epileptogenese, die Erprobung der Wirksamkeit präventiver Ansätze und neuer therapeutischer Kandidaten nach dem Anfall und hat Potenzial für die Entwicklung von Biomarkern der posttraumatischen Epileptogenese, da etwa die Hälfte der Tiere eine posttraumatische Epilepsie entwickeln.

Die Wahl des Tiermodells für die Untersuchung der posttraumatischen Epilepsie hängt von der wissenschaftlichen Frage, der Art der untersuchten Hirnverletzung und der Frage ab, mit welchen Werkzeugen die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen bestimmt werden. Letztlich muss jedes Modell der posttraumatischen Epilepsie sowohl das Auftreten spontaner Anfälle nach TBI als auch eine anfängliche Latenzzeit bei einer Teilmenge von TBI-Tieren nachweisen, da nicht alle Patienten, die ein TBI erkranken, Epilepsie entwickeln. Dazu wird in diesem Protokoll die Elektroenzephalographie (EEG) bei gleichzeitiger Videoerfassung verwendet. Das Verständnis der technischen Aspekte hinter Hardware und Ansätzen zur Datenerfassung ist für eine genaue Dateninterpretation von entscheidender Bedeutung. Zu den entscheidenden Hardwareaspekten gehören die Art des Aufzeichnungssystems, die Art der Elektroden (Schraube oder Drahtleitung) und das Material, aus dem sie bestehen, die synchronisierte Videoerfassung (als Teil des EEG-Systems oder Eines Drittanbieters) und die Eigenschaften des Computersystems. Je nach Studienziel, EEG-Ereignissen von Interesse, weiterer Analysemethode und Nachhaltigkeit der Datenspeicherung müssen in jedem System typisiert die entsprechenden Erfassungsparameter festgelegt werden. Schließlich ist die Methode der Elektrodenkonfiguration (Montage) zu berücksichtigen, da jede vor- und nachteile hat und die Dateninterpretation beeinflusst.

Dieses Protokoll beschreibt, wie man das modifizierte Marmarou-Gewichtsabfallmodell10,11 verwendet, um diffuse Verletzungen zu induzieren, die zu spontanen, unprovozierten, wiederkehrenden Anfällen bei Mäusen führen, beschreibt chirurgische Ansätze zur Erfassung eines ein- und mehrkanaligen kontinuierlichen und synchronisierten Video-EEG mit monopolarer, bipolarer oder gemischter Montage.

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Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen tierischen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Virginia Tech und in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" der National Institutes of Health durchgeführt. .

1. Tierhandhabungsprotokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll soll Tiere, die von einem Verkäufer nach der Ankunft bestellt wurden, in die Anlage eingewöhnen und sie so konditionieren, dass sie vom Experimentator behandelt werden. Dies verbessert das Wohlbefinden der Tiere, indem Stress und Angst reduziert werden, und vereinfacht bestimmte Verfahren, die den Umgang mit Tieren erfordern, einschließlich der Induktion des TBI, der postoperativen Überwachung und der Anbindung des Tieres an das Erfassungssystem.

  1. Wenn viele Tiere vom Verkäufer empfangen werden, ohrmarken und nach dem Zufallsprinzip einer experimentellen Gruppe (TBI) oder Kontrollgruppe (Scheinchirurgie) zuweisen, während sie sie in Käfigen von 2-5 Tieren kombinieren. Haus TBI Tiere getrennt von Scheintieren, weil Scheinmäuse gelegentlich aggressiv gegenüber Mäusen handeln, die TBI unterzogen wurden.
  2. Tag 1 (24-48 h nach Ohrmarken): Bereiten Sie ein Diagramm für die Erfassung von Tierohrmarken, Geburtsdatum, Datum der Handhabung, Tiergewicht an den Handhabungstage, Dauer der Handhabung und einen Abschnitt für Kommentare und Beobachtungen vor.
  3. Das Tier vorsichtig mit beiden Händen bebechern. Greifen Sie das Tier nicht am Schwanz, da es Abwehrmechanismen und eine Stressreaktion induziert.
  4. Überprüfen und notieren Sie die Ohrmarke des Tieres.
  5. Legen Sie das Tier in den Behälter auf der Gewichtsskala und erfassen Sie das Gewicht.
  6. Bechern Sie das Tier vorsichtig mit beiden Händen wieder und behandeln Sie es für 1 min, so dass es sich bewegen und innerhalb der Hände erkunden kann. Führen Sie dies über eine Bank im Prozedurraum und achten Sie darauf, das Tier nicht auf den Boden fallen zu lassen.
  7. Nach 1 min Der Handhabung, legen Sie das Tier wieder in seinen Käfig.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 1.3-1.7 für die anderen Tiere im Käfig.
  9. Behandlung Tag 2 (am folgenden Tag): Wiederholen Sie die Schritte 1.2-1.5.
  10. Bechern Sie das Tier vorsichtig mit beiden Händen wieder und behandeln Sie es für 2 min, so dass es sich bewegen und innerhalb der Hände erkunden. Führen Sie dies über eine Bank im Prozedurraum und achten Sie darauf, das Tier nicht auf den Boden fallen zu lassen.
  11. Nach 2 min Der Handhabung, legen Sie das Tier wieder in seinen Käfig.
  12. Wiederholen Sie die Schritte 1.10-1.11 für die anderen Tiere im Käfig.
  13. Behandlung von Tag 3 (am folgenden Tag): Wiederholen Sie die Schritte 1.2-1.5.
  14. Bechern Sie das Tier vorsichtig mit beiden Händen wieder und behandeln Sie es für 4 min, so dass es sich bewegen und innerhalb der Hände erkunden. Führen Sie dies über eine Bank im Prozedurraum und achten Sie darauf, das Tier nicht auf den Boden fallen zu lassen.
  15. Nach 4 min der Handhabung, legen Sie das Tier wieder in seinen Käfig.
  16. Wiederholen Sie die Schritte 1.14-1.15 für die anderen Tiere im Käfig.
  17. Handhabungstag 4 (Kontrolltag, 1 Woche ab Behandlungstag 1): Wiederholen Sie die Schritte 1.2-1.5.
  18. Bechern Sie das Tier vorsichtig mit beiden Händen wieder und behandeln Sie es für 4 min, so dass es sich bewegen und innerhalb der Hände erkunden. Führen Sie dies über eine Bank im Prozedurraum und achten Sie darauf, das Tier nicht auf den Boden fallen zu lassen.
  19. Nach 4 min Handhabung, legen Sie das Tier wieder in seinen Käfig.
  20. Wiederholen Sie die Schritte 1.18-1.19 für die anderen Tiere im Käfig.
    HINWEIS: Der Tag der Kontrolle wird getestet, ob das ruhige Verhalten nach einem dreitägigen Handling-Protokoll beibehalten wird.

2. Gewichtsabnahme-Verfahren

  1. Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer. Stellen Sie den Sauerstoff- und Vakuumstrom sowohl auf 1 l/min als auch den Gehalt an Isoflurangas auf 3 % bis 5 % ein. Anästhetisieren Sie die Maus für 5 min.
  2. Entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer und legen Sie sie auf ein Schaumstoffpad. Testen Sie, ob keine Reaktion auf eine Zeh oder Schwanzklemme besteht.
  3. Ein Schmerzmittel (0,1 mg/kg Buprenorphin) subkutan verabreichen. Wenn die EEG-Operation am selben Tag durchgeführt wird, verabreichen Sie das Buprenorphin subkutan in Kombination mit dem nichtsteroidalen entzündungshemmenden Karprofen (5 mg/kg).
  4. Verabreichen Sie die Natriumlaktatlösung (3 l pro Gramm des Gewichts des Tieres) vor oder nach dem letzten Aufprall subkutan. Die Natriumlaktatlösung kann mit den Analgetika zur schnellen Verabreichung in einer einzigen Injektion gemischt werden.
    HINWEIS: Die Natriumlactatlösung enthält eine Mischung aus Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid und Natriumlactat in Wasser. Dieser Schritt hilft, Flüssigkeiten und Elektrolyte zu ersetzen und hilft bei der Rückgewinnung.
  5. Positionieren Sie den Mauskopf unter dem Gewichtstropfenrohr (Abbildung 1A) und platzieren Sie eine flache Edelstahlscheibe (1,3 cm Durchmesser, 1 mm Dicke und 880 mg Gewicht) in der Mitte des Kopfes, zwischen der Linie der Augen und Ohren.
    HINWEIS: Diese Scheibe diffundiert den Aufprall über die Schädeloberfläche (Abbildung 1B).
  6. Entfernen Sie den Stift im Gewichtstropfenrohr, um die 100 g-Gewichtsstange aus einer Höhe von 50 cm zu lösen. Um die Scheinverletzung für die Kontrollmäuse zu induzieren, entfernen Sie die Gewichtsstange aus dem Rohr, um eine versehentliche Freisetzung des Stifts und Gewichtsabnahme zu verhindern.
    HINWEIS: Der Kopf des Tieres muss flach positioniert werden, damit die Stange frei auf die gesamte Oberfläche der Scheibe fällt.
  7. Legen Sie das bewusstlose Tier auf den Rücken, um es auf einem Heizkissen zu erholen, das mit einem sterilen polyleinen saugfähigen Handtuch bedeckt ist. Die richtige Reflex-Wiederherstellungszeit (d.h. die Zeit, die die Maus braucht, um sich von hinten zu recht zu bewegen) kann als Auslesung für die unbewusste Zeit gemessen werden.
  8. Wenn das Tier das Bewusstsein wiedererlangt, legen Sie es in einen sauberen Käfig, der auf einem Heizkissen erwärmt wurde, mit Erholungsgel und ein paar befeuchteten Chow-Stücken, um sich für 45 min zu erholen. Stellen Sie sicher, dass es genügend Müll gibt, damit der Käfig nicht überhitzt wird. Eine Überhitzung des Tieres kann sich als ebenso großes Hindernis für die Genesung erweisen, wie die Maus zu kalt werden lässt.
  9. Wiederholen Sie nach 45 min zweimal die Schritte 2.1 x 2.8, bei dem Schritt 2.3 weggelassen wird (d. h. Verabreichung von Analgetika und entzündungshemmenden Medikamenten).
  10. Lassen Sie die Tiere sich für 1 x 2 h erholen, wenn am selben Tag eine EEG-Elektrodenimplantationsoperation durchgeführt wird.

3. Chirurgische Feldvorbereitung zur Implantation von EEG-Elektroden

HINWEIS: Autoklavieren Sie die chirurgischen Werkzeuge und Schrauben vor der Operation. Reinigen Sie die chirurgischen Handschuhe, indem Sie vor und nach dem Berühren des Tieres und zwischen durch den Umgang mit den Tieren 70 % Ethanol besprühen und reiben. Sterilisieren Sie die chirurgischen Werkzeuge für 2 x 3 min im Perlensterilisator (siehe Tabelle der Materialien) zwischen Tieren. Ändern Sie den sterilen Vorhang, bevor Sie ein neues Tier in den stereotaktischen Apparat legen. Stellen Sie sicher, dass das Operationsfeld alle notwendigen Komponenten für die Operation enthält (Abbildung 2). Das Fehlen eines invasiven chirurgischen Eingriffs zur Induzieren des TBI in diesem Modell hat mehrere Vorteile: 1) Die Implantation der Elektroden ist flexibel und kann am selben Tag wie TBI oder nach einem definierten Zeitraum durchgeführt werden; 2) die Erholungszeit des Tieres ist schneller; 3) der Schädel bleibt intakt, was mehr Oberfläche und Flexibilität für die Implantation von Elektroden ermöglicht.

  1. Anästhetisieren Sie die Maus in 3%-5% Isoflurangas in einer Induktionskammer für 5 min.
  2. Übertragen Sie die Maus von der Induktionskammer auf das stereotaktische Gerät und legen Sie sie auf einen sterilen Vorhang auf einem Heizkissen mit Isoflurangas und Vakuumröhren, die mit dem Nasenkegel verbunden sind.
  3. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37 °C während der Operation. Platzieren Sie den Temperatursensor so, dass er mit der Brust oder Der Bauchwand der Maus in Kontakt tritt.
  4. Fixieren Sie den Kopf des Tieres mit den Ohrbügeln an Ort und Stelle.
  5. Halten Sie die Anästhesie bei 1,5 % 3,5 % Isofluran oder bei 60 Atemzügen/min in der chirurgischen Ebene (ohne Reaktion auf Zehen- oder Schwanzkneifen).
  6. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um sie während der gesamten Operation geschmiert zu halten.
  7. Verabreichen Sie eine Mischung aus Analgetika (0,1 mg/kg Buprenorphin) und dem nichtsteroidalen entzündungshemmenden Medikament (5 mg/kg Carprofen) in einer einzigen Injektion subkutan, es sei denn, das TBI wurde früher im Laufe des Tages durchgeführt, in diesem Fall erhielt das Tier bereits Analgetika und Entzündungshemmer.
    HINWEIS: Buprenorphin sollte erneut verabreicht werden, wenn die Zeit zwischen der ersten TBI- und EEG-Platzierungsoperation 8 h überschreitet oder wenn das Tier nach der ersten Verabreichung Anzeichen von Schmerzen 8 h zeigt, es aber ohne Zugabe von Carprofen verabreicht werden sollte.
  8. Verabreichen Sie natriumlactatlösung (3 l pro Gramm des Gewichts des Tieres) subkutan, um Flüssigkeiten und Elektrolyte im Tier zu ersetzen.
    HINWEIS: Wenn eine Operation unmittelbar nach dem TBI durchgeführt wird, muss dieser Schritt ordnungsgemäß getimt werden. Natriumlaktat-Lösung sollte alle 2 h verabreicht werden, während das Tier die Verfahren durchläuft und einmal nach der Operation 2 h von der vorherigen Injektion.
  9. Entfernen Sie das Haar von der Kopfhaut mit einer Haarentfernungscreme.
  10. Vor dem Schnitt, desinfizieren Sie die Haut der Kopfhaut mit Povidon-Jod chirurgische antiseptische Lösung und 70% Ethanol in abwechselnden Tupfern mit sterilen Gaze Pads in einer kreisförmigen Bewegung 3x (20 s pro Lösung jedes Mal).
  11. Mit einem Skalpell, machen Sie einen rostral-kaudalen Schnitt auf der Kopfhaut Mittellinie von knapp über den Augen bis zum Hinterkopf. Diese Methode der Kopfhautöffnung wird dem Abschneiden der Kopfhaut vorgezogen, da Hautklappen über oder um die EEG-Kappe versiegelt werden können, um mehr Stabilität zu gewährleisten.
    HINWEIS: Bei der Vorbereitung des Schädels für die Implantation des 3-EEG-Kopfteils ist ein Abschneiden der Kopfhaut erforderlich, da die Größe des Kopfteils keine Verschlussart der Hautklappen über dem Kopfteil zulässt.
  12. Erweitern Sie den Einschnittbereich, indem Sie kleine Hämostate auf die geöffneten Hautränder auftragen. Wenn nach dem Schnitt Blutungen auftreten, mit einer sterilen Watte oder einem Tupfer reinigen.
  13. Entfernen Sie das Periost (d.h. die dünne Membran über dem Schädelknochen) vorsichtig mit einer Skalpellklinge. Wenn während dieses Schritts Blutungen auftreten, drücken Sie auf der Blutungsstelle mit einem sterilen Wattestäbchen, bis er aufhört.
  14. Verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um den Schädel mit Wasserstoffperoxid zu reinigen, aber vermeiden Sie es, das Weichgewebe zu berühren, das den exponierten Schädelbereich umgibt. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis der Schädel von einem Weichgewebe gereinigt wird und ein weißliches Aussehen hat.
  15. Den Schädel mit einem sterilen Gaze oder Wattestäbchen trocknen.
    HINWEIS: Die Schritte 3.12-3.15 sind wichtig für die richtige Fixierung der Elektroden und des Zahnzements. Weichgewebe, nicht-kauterisierte Blutungen und Ablagerungen können Infektionen, instabile Kopfbefestigung, verzerrtes oder fehlendes Signal und Verlust des Implantats innerhalb von mehreren Tagen oder Wochen nach der Operation verursachen.

4. Elektrodenplatzierung

  1. Implantieren Sie den einzelnen EEG (1EEG) Kanalkopfhalter.
    HINWEIS: Abkürzungen in den stereotaktischen Koordinaten stellen räumliche Beziehungen dar und geben den Abstand des Ziels vom Bregma in Millimetern bei einer bestimmten Ausrichtung auf dem Kopf des Tieres an: vorder-posterior (AP) und medial-lateral (ML). Dorsal-ventral ist in diesem Protokoll nicht anwendbar, da alle Elektroden in den Epiduralraum und nicht in eine bestimmte Struktur innerhalb des Gehirns (Abbildung 3). Vin+ ist eine aktive Elektrode und Vin- ist seine Referenzelektrode.
    1. Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeitsbohrer mit einem Stahlbit (0,5 mm, rund, 1/4 In.) bei 5.000 bis 6.000 Runden pro Min. (Rpm), um sechs Gratlöcher (drei für Stabilitätsschrauben und drei für Elektroden) mit den mitgelieferten stereotaktischen Koordinaten12zu erstellen. Für die beiden vorderen Schrauben: AP = +1,5 mm, ML = 1,5 mm; für die eine hintere Schraube: AP = -5,2 mm, ML = -1,5 mm; für die Masseelektrode: AP = -5,2 mm, ML = +1,5 mm; für die Aufnahmeelektroden: AP = -2,3 mm, ML = 2,7 mm, mit Vin+ rechts und Vin- links.
    2. Fügen Sie drei Schrauben für eine verbesserte Stabilität der Kopfstufe hinzu. Drehen Sie mit einem Schraubendreher jeweils 1,5 x Schrauben, die stabil im Schädel befestigt werden.
      HINWEIS: Das Tieferlegen der Schrauben wird das Gehirn schädigen.
    3. Setzen Sie den 1EEG-Kopfhalter in einen stereotaktischen Halterarm ein und positionieren Sie den Kopfhalter so, dass sich die drei Elektroden entlang der Schädelmittellinie befinden. Bei dieser Konfiguration befindet sich die Bodenelektrode und ihre entsprechende Öffnung auf der Oberseite des Kopfteils im Rücken, die Vin+-Elektrode in der Mitte und die Vin-Elektrode vorne. Eine Markierung kann auf dem Kopfteil mit einem permanenten Marker gemacht werden.
    4. Biegen Sie jede Elektrode um 90° so, dass das Ende jedes Drahtes nach unten gebogen und über dem entsprechenden Gratloch positioniert wird. Messen Sie dann 1 mm Länge des Teils des Drahtes, der jetzt senkrecht zum Gratloch ist, und trimmen Sie den Überschuss ab (Abbildung 3). Dadurch wird die epidurale Platzierung der Elektroden sichergestellt. Die Elektroden sollten die Dura-Mater-Oberfläche kaum berühren.
    5. Senken Sie die Kopfhalterung und stellen Sie alle drei Elektroden so ein, dass sie dem jeweiligen Gratloch entsprechen. Für die Epiduralaufnahme müssen die Elektroden über oder kaum berühren die Dura mater platziert werden.
    6. Bereiten Sie Zahnzement für die Anwendung vor, indem Sie einen 1/2-Löffel Pulver mit mehreren Tropfen Lösungsmittel mischen. Verwenden Sie einen Mischspachtel und rühren Sie, bis die endgültige Mischung putty-like, klebrig, aber formbar und steif genug ist, um richtig kondensiert zu werden, wenn sie auf den Schädel des Tieres gelegt werden.
    7. Tragen Sie das Zahnzementgemisch auf, das alle Schrauben und Elektroden abdeckt, und warten Sie 3 bis 5 min, bis sie erstarrt ist. Achten Sie darauf, den Kunststoffsockel nicht mit Zahnzement zu bedecken, da es unmöglich ist, das Tier mit einem Tether an den Kommutator zu verbinden.
    8. Lassen Sie die Hämostate, die die Hautklappen halten, los und schließen Sie den Schnitt, indem Sie die Hautklappen um den Kunststoffsockel verbinden. Tragen Sie mehrere Tropfen Gewebekleber auf (siehe Tabelle der Materialien), um die Hautklappen zu versiegeln.
    9. Chlorhexidin antiseptisch auf den Bereich um das Implantat anwenden, um eine Infektion zu vermeiden. Wenn das Tier länger als 2 h nach der vorherigen Injektion der Natriumlaktatlösung, die während der TBI-Induktion verabreicht wurde, länger als 2 h unter Anästhesie ist, eine weitere Injektion subkutan verabreichen. Um die richtige Hydratation des Tieres aufrechtzuerhalten, wiederholen Sie die Injektion alle 2 h, die das Tier unter Anästhesie verbringt.
    10. Nach der Operation, geben Sie eine endgültige Injektion von Natriumlaktat-Lösung 2 h nach der vorherigen Injektion. Wenn die Operation weniger als 2 h lang ist, verabreichen Sie die endgültige Erholungsdosis der Natriumlaktatlösung 2 h ab der ersten Injektion.
    11. Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Apparat und messen Sie das Gewicht des Tieres nach der EEG-Operation als Referenz für die zukünftige Überwachung. Durch das Implantat ist das Gewicht des Tieres größer als vor der Operation.
    12. Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig auf einem warmen Heizkissen für die Erholung.
  2. Implantieren Sie die beiden EEG- und eine EMG(2EEG/1EMG) Kanalmontage.
    1. Verwenden Sie das Bregma als Landmark für die Platzierung des Kopfteils. Tragen Sie eine kleine Menge Gewebekleber (siehe Materialtabelle)auf die Unterseite des 2EEG/1EMG Kopfteils auf, um die vier Schraubenlöcher zu vermeiden und den 2EEG/1EMG Kopfhalter auf die Oberfläche des Schädels zu legen.
      HINWEIS: Es gibt keine spezifischen Koordinaten für die Platzierung dieses Kopfteils. Die Kopfhalterung ist 8 mm lang und 5 mm breit, die den größten Teil der Schädeloberfläche bedeckt. Die Positionierung des Kopfteils mit seiner Vorderkante von 3,0 mm vor dem Bregma ist optimal und sorgt für eine gute Signalqualität. Schnelle manuelle Platzierung ist notwendig, bevor der Tropfen der Gewebeklebstoff aushärtet. Lassen Sie ca. 5 min für Gewebekleber vollständig zu heilen.
    2. Verwenden Sie eine sterile 23 G Nadel, um Pilotbohrungen für die Schrauben durch die vier Öffnungen im Kopfhalter zu erstellen. Um dies zu erreichen, drücken Sie vorsichtig die Nadel und drehen Sie langsam, bis die Spitze der Nadel in den Schädel eindringt, ohne das Gehirn zu beschädigen. Entfernen Sie alle Blutungen aus den Pilotlöchern mit einem sterilen Wattestäbchen.
    3. Setzen Sie die 0,10 in Schrauben in die Pilotlöcher ein und drehen Sie sie, bis sie jeweils im Schädel fixiert sind. Dies kann bis zur Hälfte der Schneckenlänge sein, aber nicht die volle Länge, da dies die Dura mater und Cortex beschädigen würde. Wenn der Kopfhalter so positioniert ist, dass es einen Spalt zwischen der Schädeloberfläche und dem hinteren Ende des Kopfteils gibt, verwenden Sie zwei 0,12 in Schrauben im hinteren Teil.
    4. Machen Sie eine kleine Öffnung an den Seiten des Zweikomponenten-Epoxidbeutels (Silber-Epoxy). Nehmen Sie einen doppelseitigen Spachtel und verwenden Sie jede Seite, um eine kleine und gleiche Menge jeder Komponente aus dem Beutel zu schöpfen und sie zusammen zu mischen. Verwenden Sie nur eine kleine Menge ausreichend für eine einzelne Operation, da die Mischung verfestigt sich innerhalb von 20 min. Versiegeln Sie die Seiten des Beutels, um eine Trocknung zu verhindern.
      HINWEIS: Das Silber-Epoxid ermöglicht einen richtigen elektrischen Kontakt zwischen Schraube und Kopfhalterung und verbessert die Stabilität der Schrauben.
    5. Tragen Sie eine kleine Menge dieser Mischung zwischen Schraubenkopf und Schraubloch auf, dann ziehen Sie jede Schraube fest, bis ihr Kopf auf der Basis des Implantats ruht. Stellen Sie sicher, dass kein Silber-Epoxid Kontakt zwischen den beiden Schrauben herstellt, da jede Schraube als individuelle Elektrode dient und, um ein genaues Signal zu gewährleisten, sollte sie keinen Kontakt mit der anderen Schraube herstellen.
    6. Wenn die Silber-Epoxy-Mischung verlegt wurde, gibt es ein paar Sekunden Zeitfenster, um vorsichtig den Überschuss auszuhöhlen, um die Verbindung zu trennen. Biegen Sie beide EMG-Leitungen vorsichtig von der hinteren Kante des Kopfteils, um der Kontur des Kopfes und des Halses des Tieres zu folgen, und legen Sie sie dann in die Nuchalmuskulatur ein.
    7. Bereiten Sie Zahnzement für die Anwendung vor, indem Sie einen 1/2-Löffel Pulver mit mehreren Tropfen Lösungsmittel mischen. Verwenden Sie einen Mischspachtel und rühren Sie, bis die endgültige Mischung putty-like, klebrig, aber formbar und steif genug ist, um richtig kondensiert zu werden, wenn sie auf den Schädel des Tieres gelegt werden.
    8. Tragen Sie zahnärztliche Zementmischung auf, die den gesamten Kopfhalter abdeckt, ohne die Abdeckung der sechs Stiftlöcher, da dies den Anschluss des Vorverstärkers unmöglich macht. Warten Sie 3 bis 5 min, bis der Zement verfestigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Haut nicht mit Zahnzement am Kopfmontiert versiegelt ist.
    9. Lassen Sie die Hämostate, die die Hautklappen halten, los und schließen Sie den Schnitt, indem Sie die Hautklappen um den Kunststoffsockel verbinden. Tragen Sie mehrere Tropfen Gewebekleber auf, um die Hautklappen zu versiegeln.
      HINWEIS: Wenn der Hautschnitt länger gemacht wurde, um eine Begradigung der EMG-Drahtleitungen zu ermöglichen, kann die Haut mit Gewebekleber versiegelt oder genäht werden. Die Haut mit Gewebekleber zu versiegeln ist in der Regel ausreichend. Wenn jedoch während der postoperativen Überwachung die Öffnung des Schnittes beobachtet wird, werden stattdessen Nähte empfohlen.
    10. Chlorhexidin antiseptisch auf den Bereich um das Implantat anwenden, um eine Infektion zu vermeiden. Verabreichen Sie die Natriumlaktatlösung (3 l pro Gramm des Gewichts des Tieres) subkutan, um Flüssigkeiten und Elektrolyte zu ersetzen, wenn das Tier nach der vorherigen Injektion länger als 2 h unter Anästhesie ist.
    11. Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Apparat und messen Sie das Gewicht des Tieres nach der EEG-Operation als Referenz für die zukünftige Überwachung. Durch das Implantat ist das Gewicht des Tieres größer als vor der Operation.
    12. Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig auf einem warmen Heizkissen, mit Erholungsgel und ein paar befeuchteten Chow-Stücken für die Genesung.
  3. Implantieren Sie eine drei EEG-Kanäle (3EEG) Kopfhalterung.
    1. Verwenden Sie Hochgeschwindigkeitsbohrer mit einem Stahlbit (0,5 mm, rund, 1/4) bei 5.000 bis 6.000 Umdrehungen pro Minute, um sechs Gratlöcher (drei für Stabilitätsschrauben und drei für Elektroden) mit den mitgelieferten stereotaktischen Koordinaten12zu erzeugen. Für Boden- und gemeinsame Referenz für EEG1 und EEG2: AP = 5,2 mm, ML = 1,5 mm; für EEG1 und EEG2: AP = -3,0 mm, ML = 3,0 mm; für unabhängiges EEG3: AP =-1,4 mm, ML = 1,5 mm.
    2. Legen Sie die sechs Schneckenelektroden in die Gratlöcher.
      HINWEIS: Das Tieferlegen der Schrauben verursacht erhebliche Schäden am Gehirn. Schraubenelektroden sorgen für eine bessere Stabilität der Kopfhalterung.
    3. Bereiten Sie Zahnzement für die Anwendung vor, indem Sie einen 1/2-Löffel Pulver mit mehreren Tropfen Lösungsmittel mischen. Verwenden Sie einen Mischspachtel und rühren Sie, bis die endgültige Mischung putty-like, klebrig, aber formbar und steif genug ist, um richtig kondensiert zu werden, wenn sie auf den Schädel des Tieres gelegt werden.
    4. Tragen Sie zahnärztlichezementgemisch auf, das die gesamte exponierte Oberfläche des Schädels und jeder Schneckenelektrode abdeckt. Stellen Sie sicher, dass die Haut nicht mit Zahnzement am Kopfmontiert versiegelt ist. Warten Sie auf 1 bis 2 min, bis der Zement leicht erstarrt ist. Es ist nicht notwendig, bis zur vollständigen Erstarrung zu warten, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    5. Schalten Sie das Lötkolben ein, um es aufzuheizen. Legen Sie den 3EEG-Kopfhalter in einen stereotaktischen Halterarm.
      HINWEIS: Positionieren Sie den Kopfhalter so, dass die sechs Drahtführungspositionen mit der Position der Drahtleitungen jeder Schneckenelektrode übereinstimmen.
    6. Senken Sie den Kopfhalter, so dass sein ventraler Teil auf dem Zahnzement ruht.
    7. Drehen Sie den Draht jedes Kabels von jeder der Schneckenelektroden mit dem entsprechenden Drahtvorsprung des Kopfteils.
      HINWEIS: Das Verdrehen der falschen Drahtleitungen macht die Dateninterpretation kompliziert oder unmöglich.
    8. Schneiden Sie den überschüssigen Draht vorsichtig mit einer Schere ab. Löten Sie jedes verdrehte Drahtpaar für die richtige Signalleitung.
      HINWEIS: Jedes Kabelpaar muss mit einem anderen Paar in Kontakt treten, da andernfalls die Signalqualität und die Dateninterpretation beeinträchtigt werden.
    9. Biegen Sie jedes gelötete Paar Draht um den Kopfhalter, um den Kontakt zwischen den einzelnen Paaren zu vermeiden.
      HINWEIS: Wenn die Drahtleitungen nicht kurz genug getrimmt sind, kann es schwierig sein, sie um den Kopfhalter zu biegen, ohne einen anderen Draht zu berühren. In diesem Fall, biegen Sie ein Paar zuerst, decken Sie es mit Zahnzement-Mischung, warten Sie 1 ,2 min zu erstarren, dann gehen Sie mit dem nächsten Paar in der gleichen Weise.
    10. Beenden Sie den gesamten Draht mit Zahnzement, so dass nur der schwarze Teil des Kopfteils freigelegt wird.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, kein Zahnzementpulver oder -gemisch auf die Oberseite des exponierten Teils des Kopfteils aufzutragen, da Schmutz oder Zement in den Löchern den Kontakt blockieren und entweder zu Signalabwesenheit oder Lärm führen.
    11. Lassen Sie die Hämostate, die die Hautklappen halten. Chlorhexidin antiseptisch auf den Bereich um das Implantat anwenden, um eine Infektion zu vermeiden.
    12. Verabreichen Sie die Natriumlaktatlösung (3 l pro Gramm des Gewichts des Tieres) subkutan, um Flüssigkeiten und Elektrolyte zu ersetzen, wenn das Tier nach der vorherigen Injektion länger als 2 h unter Anästhesie war.
    13. Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Apparat und messen Sie das Gewicht des Tieres nach der EEG-Operation als Referenz für die zukünftige Überwachung. Durch das Implantat ist das Gewicht des Tieres größer als vor der Operation.
    14. Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig auf einem warmen Heizkissen, mit Erholungsgel und ein paar befeuchteten Chow-Stücken für die Genesung.
      HINWEIS: Wasserstoffperoxid hilft bei der Entfernung des verbleibenden Weichgewebes aus dem Schädel.

5. Verbinden von Tieren mit dem Erfassungssystem

  1. Bechern Sie das Tier mit beiden Händen, um es aus dem Anschaffungskäfig zu entfernen und es in einen sauberen Bereich mit einer flachen Oberfläche zu übertragen, wie eine Animal Transfer Station (ATS).
  2. Greifen Sie vorsichtig die Maus an der Haut ihres Rückens. Greifen Sie das Tier nicht am Schwanz, da dies Not verursacht.
  3. Identifizieren Sie die Öffnung im EEG-Kopfhalter entsprechend der Masseelektrode und passen Sie den entsprechenden Pin des Tethers für eine ordnungsgemäße Verbindung an.
    HINWEIS: Die umgedrehte Verbindung des Tethers vom Kommutator zum Kopfhalter des Tieres führt zu einer anderen Lesart als die Elektroden und potenziell verzerrte Wellenformen.
  4. Bringen Sie das Tier in den Erfassungskäfig zurück und schließen Sie das andere Ende des Tethers (EEG-System 1) oder Vorverstärker (EEG-System 2) an den Kommutator an.
    HINWEIS: Wenn Sie den Vorverstärker (EEG System 2) vom Kommutator an den Tether anschließen, stimmen Sie mit den weißen Markierungen an den Enden beider Tether überein. Der Rückanschluss führt zu dauerhaften Schäden am Verstärker und erfordert Reparaturen durch den Hersteller, die teuer sind.
  5. Drehen Sie den Tether, der das Tier mit dem Kommutator verbindet, sanft, um sicherzustellen, dass der Mechanismus ordnungsgemäß funktioniert und sich das Tier frei bewegen kann.

6. EEG-Datenerfassungseinstellungen

  1. Stellen Sie die Erfassungsparameter des EEG-Systems 1 ein.
    1. Abtastrate auf 500 Hz einstellen; 5.000 zu gewinnen; Modus Norm 35 Hz; LPN aus. Hochpassfilter auf 0,5 Hz einstellen.
      HINWEIS: 100 Hz (Tiefpass) ist eingebaut und erfordert keine manuelle Eingabe.
  2. Stellen Sie die Erfassungsparameter des EEG Systems 2 ein.
    1. Abtastrate auf 600 Hz einstellen; Vorverstärkerverstärkung 100; Gewinn 1 (EEG1,2). Stellen Sie den Tiefpassfilter auf 100 Hz ein.
      HINWEIS: 1 Hz (High Pass) ist eingebaut und erfordert keine manuelle Eingabe.

7. Einstellungen zur Videodatenerfassung

  1. Stellen Sie Erfassungsparameter für EEG System 1 ein.
    HINWEIS: Für die gleichzeitige Videoverarbeitung wird ein Videoerfassungssystem von Drittanbietern benötigt.
    1. Legen Sie die Bildrate zwischen 15 (minimum empfohlen) und 30 (maximal verfügbar) für eine entsprechende Videoqualität fest. Stellen Sie die Auflösung auf 640 x 640 Pixel ein. Stellen Sie den Komprimierungstyp auf H.264H ein.
  2. Stellen Sie Erfassungsparameter für EEG System 2 ein.
    HINWEIS: Dieses EEG-System bietet ein Videosystem und eine Software, die Video- und EEG-Daten in einer einzigen Datei für bis zu vier Tiere synchronisieren (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Legen Sie die Bildrate zwischen 15 (minimum empfohlen) und 30 (maximal verfügbar) für eine entsprechende Videoqualität fest. Stellen Sie die Auflösung auf 640 x 480 Pixel ein. Legen Sie den Komprimierungstyp auf das WebM-Dateiformat fest.

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Ergebnisse

Das hier skizzierte Protokoll beschreibt das Verfahren zur isolierten Induktion einer diffusen Verletzung (z. B. in Ermangelung einer fokalen Läsion) mit einem Mausmodell des sich wiederholenden diffusen TBI (Abbildung 1). Abbildung 1A zeigt die Gewichtsabnahmevorrichtung und ihre Komponenten ( Abbildung1A, a1-a5), die für die Induktion von TBI in diesem Modell verwendet wird, und entscheidende Schr...

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Diskussion

Im Gegensatz zu CCI- und FPI-Modellen, die entweder fokale oder eine Kombination von fokalen und diffusen Verletzungen induzieren, ermöglicht das in diesem Protokoll beschriebene Modell des repetitiven diffusen TBI die Induktion diffuser Verletzungen ohne fokale Hirnverletzungen und erfordert keine Kopfhaut- oder Schädelöffnungen und die damit verbundene Entzündung. Ein zusätzlicher Vorteil des Fehlens von Kraniektomie in diesem Modell ist, dass es nicht nur erlaubt, die Elektroden für chronische kontinuierliche EEG-Aufn...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/United States und CURE auf der Grundlage eines Stipendiums, das CURE vom United States Army Medical Research and Materiel Command, Department of Defense (DoD), im Rahmen des Forschungsprogramms für psychische Gesundheit und traumatische Hirnverletzungen unter dem Award No erhielt. W81XWH-15-2-0069. Ivan Zuidhoek wird sehr geschätzt für das Korrekturlesen des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,10" SchraubePinnacle Technology Inc., KS, USA82090,10 Zoll lange
Edelstahlschraube 0,10Pinnacle Technology Inc., KS, USA84030,10 Zoll lang mit vorgelöteter Drahtleitung
0,12" SchraubePinnacle Technology Inc., KS, USA82120,12 Zoll lange
Invitro1 (Tochtergesellschaft von Plastics One), VA, USAMS333/8-A/SPC3 einzeln teflonisolierte Platin-Iridiumdrahtelektroden (verdrillt oder unverdrillt, 0,005 Zoll Durchmesser), die sich unter dem Gewindesockel aus Kunststoff erstrecken
2EEG/1EMG-KopfhalterungPinnacle Technology Inc., KS, USA82012EEG/1EMG-Kanäle
3% WasserstoffperoxidApotheke
3EEG-KopfhalterungPinnacle Technology Inc., KS, USA8235-SM-Ckundenspezifischer 6-Pin-Anschluss für 3EEG-Kanäle
BuprenorphinPar Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA060969
BuprenorphinPar Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA060969
C57BL/6 MäuseHarlan/Envigo Laboratories Incmännlich, 12-16 Wochen alt
C57BL/6 MäuseThe Jackson Laboratory altes
CarprofenZoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA026357HINWEIS: Dieses Medikament wird während der Gewichtsabnahme nur hinzugefügt, wenn die stereotaktische Elektrodenimplantation am selben Tag durchgeführt wird
Chlorhexidin AntiseptikumApotheke
Zahnzement und Lösungsmittel KitStoelting Co., USA51459
BohrerForedomHP4-917
BohrerMeisinger USA, LLC, USAHM1-005-HP0,5 mm, Rund, 1/4, Stahl
TrockensterilisatorCellpoint Scientific, USAGerminator 500
EEG System 1Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥ 70%VWR, USA71001-652KOPTEC USP, Biotechnologie Grade (140 Proof)
AugensalbePro Labs Ltd, USAPuralube Vet Salbe Steriles Augengleitmittel erhältlich in allgemeinen Online-Shops und Apotheken
Fluriso Flüssigkeit für InhalationsanästhesieMWI Veterinary Supply Co., USA502017
HaarentfernungsproduktKirche & Dwight Co., Inc., USANair Creme
IsofluranMWI Veterinary Supply Co., USA502017
Povidon-Jod chirurgische LösungPurdue Products, USA004677Betadine
Rimadyl/CarprofenZoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA026357
LötenHarware Store
LötkolbenWeller, USAWP35ST7 Spitze, 0,8 mm
EdelstahlscheibeSonderanfertigung
Sterile Wattestäbchen
Sterile MullbindenFisher Scientific, USA22362178
Sterile polygefütterte saugfähige HandtücherCardinal Health, USA3520
Gewebekleber3M Tierpflegeprodukte, USA1469SB
" Edelstahl-1EEG-Kopfhalterung männlich, 12-16 Wochen

Referenzen

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