Etablierung und Analyse von dreidimensionalen (3D) Organoiden, abgeleitet von Patienten prostatakrebs Knochenmetastasen Proben und ihre Xenografts

Dreidimensionale kultivierte Organoide haben die Aufmerksamkeit auf ihr Potenzial gelenkt, die In-vivo-Architektur, die zelluläre Funktionalität und die genetische Signatur ihrer ursprünglichen Gewebe^1,2,^3,4,5zu rekapitulieren. Am wichtigsten ist, 3D-Organoide aus Patiententumorgewebe oder Patienten abgeleitet Xenograft (PDX) Modelle bieten unschätzbare Möglichkeiten, Mechanismen der zellulären Signalisierung auf Tumorigenese zu verstehen und die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf jede Zellpopulation^{6,7,8,9,10,11,12,13}zu bestimmen. Drost et al.⁵ entwickelten ein Standardprotokoll zur Etablierung von Prostataorganoiden von Mensch und Maus, das im Bereich der Urologie weit verbreitet ist. Darüber hinaus wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um 3D-Organoide weiter zu charakterisieren und die detaillierten Mechanismen der Tumorgenese und Metastasierung^4,12,14,15zu verstehen. Neben dem zuvor etablierten und weithin akzeptierten Protokoll für 3D-Organoidkulturen beschreiben wir hier ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die 3D-Kultur von pDO mit drei verschiedenen Doming-Methoden unter optimierten Kulturbedingungen.

In diesem Manuskript wurden 3D-Organoide als ex vivo Modell von Knochenmetastasierung Prostatakrebs (BMPC) etabliert. Die für diese Kulturen verwendeten Zellen stammten aus der Serie Prostate Cancer San Diego (PCSD) und wurden direkt von patienten ProstatakrebsKnochenmetastasen-Tumorgeweben (PCSD18 und PCSD22) oder von Patienten abgeleiteten Xenograft-Tumormodellen (PDX) (Proben mit den Namen PCSD1, PCSD13 und PCSD17) abgeleitet. Da spontane Knochenmetastasen von Prostatakrebszellen in gentechnisch veränderten Mausmodellen¹⁶selten sind, haben wir die direkte intrafemorale (IF) Injektion menschlicher Tumorzellen in männliche Rag2^-/-'c^-/- Mäuse verwendet, um die PDX-Modelle von Knochenmetastasatasanasanzen zu etablieren¹⁷.

Sobald 3D-Organoide aus heterogenen Patiententumorzellen oder von Patienten abgeleiteten Xenografts nachgewiesen wurden, ist es wichtig, ihre Identität als Prostatatumorzellen zu bestätigen und ihre Phänotypen in den 3D-Organoidkulturen zu bestimmen. Die Immunfluoreszenzchemie (IFC) ermöglicht die Visualisierung der Proteinexpression vor Ort in jeder Zelle, was häufig auf die potenziellen Funktionen für bestimmte Zellpopulationen^2,4hinweist. Im Allgemeinen sind IFC-Protokolle für eine große Anzahl von Proben, einschließlich Geweben und Zellen, einfach und vollständig optimiert. Die Zelldichte und die Anzahl der Organoide können jedoch deutlich niedriger sein als die der konventionellen Kultur. Daher erfordert das IFC-Protokoll für Organoide zusätzliche Schritte, um eine ordnungsgemäße Verarbeitung und Einbettung in Paraffin für alle Organoide in die Proben zu gewährleisten. Wir beschreiben zusätzliche Schritte für einen Agarose-Voreinbettungsprozess und Tipps, um die Position von schnittförmigen Organoiden auf der Folie zu kennzeichnen, die die Erfolgsrate von IFC auf Organoiden erhöht, insbesondere wenn die Proben von Organoiden eine geringere Zelldichte als gewünscht aufweisen.

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Guide for the University of California San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB) durchgeführt. IRB #090401 Die Zulassung wurde vom UCSD Institutional Review Board (IRB) erhalten, um chirurgische Proben von Patienten zu Forschungszwecken zu sammeln. Von jedem Patienten wurde eine informierte Einwilligung eingeholt und eine Probe für chirurgische Knochenprostatasierungen durch orthopädische Reparatur einer pathologischen Fraktur im Oberschenkelknochen erhalten. Tierprotokolle wurden im Rahmen des Tierschutzes der University of California San Diego (UCSD) und des vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Protokolls #S10298 durchgeführt. Zellen aus mechanisch und enzymatisch dissoziiertem Patiententumorgewebe wurden intrafemoral in 6 bis 8 Wochen alte männliche Rag2^-/-;-c^-/- Mäuse injiziert, wie zuvor beschrieben¹⁷. Das Xenograft-Tumorvolumen wurde mit Hilfe eines In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebungssystems und Sättelmessungen ermittelt. Bei Tumorwachstum bis zu 2,0 cm (die maximal zulässige Größe, die von IACUC genehmigt wurde), wurde der Tumor für 3D-Organoide etabliert geerntet.

ANMERKUNG: Abbildung 1 zeigt den Workflow zum Einrichten von 3D-Organoiden und eine Protokollnummer für jeden Schritt der experimentellen Verfahren.

1. Verarbeitung von Xenograft (PDX) Tumorgeweben des Patienten

HINWEIS: Dies ist ein erster Schritt für die organoide Etablierung für einen Tumor, der von einem Xenograft-Mausmodell abgeleitet wurde. Dieses Protokoll wurde von einer früheren Veröffentlichung von Drost et al.⁵ angepasst und wir haben die Medienbedingungen so geändert, dass sie die Serumergänzung zu organoiden Medien einschließen.

1. Verarbeiten Sie die Tumorprobe wie unten beschrieben.
   1. Tumorproben auf 1-3 mm³ große Stücke zerkleinern und die Proben mit 10 ml Zelldissoziationslösung für 45 min bei Raumtemperatur verdauen.
   2. Um die Verdauung zu beenden, fügen Sie den Proben 20 ml DMEM-Gesamtmedium hinzu.
   3. Filtern Sie die Suspension durch ein 70-m-Zellsieb. Verwenden Sie einen sterilen Kolbenflansch, um übrig gebliebenes Gewebe auf die Oberseite des 70-m-Zellsiebes zu schieben.
   4. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
   5. Waschen Sie das Zellpellet dreimal mit frischen adDMEM Komplettmedien. Passen Sie das Medienvolumen zum Waschen und Resuspension mit dem in Tabelle 3vorgeschlagenen Medienvolumen an. Bei einem Zustand der Wellplattenkultur von 24 Wellplatten sollte das Volumen für die Wäsche beispielsweise 500 l betragen.
      HINWEIS: Wie in Tabelle 3dargestellt, ist das Protokoll auf verschiedene Kulturbedingungen anwendbar.
   6. Bestimmen Sie die endgültige Zellzahl mit Trypan-Blaufarbstoff und einem Hämozytometer.
   7. Nach Erhalt der Zellzahl wird das Zellpellet in 80 l von 2% FBS in PBS pro 2 x 10⁶ Tumorzellen erneut ausgesetzt.
   8. Fügen Sie 20 L Mouse Cell Depletion Cocktail pro 2 x 10⁶ Tumorzellen hinzu. Gut mischen und 15 min bei 2-8 °C inkubieren.
   9. Passen Sie das Volumen auf 500 l mit 2% FBS im PBS-Puffer pro 2 x 10⁶ Tumorzellen an.
      HINWEIS: Bis zu 1 x 10⁷ Tumorzellen in 2,5 ml Zellsuspension können auf einer LS-Säule verarbeitet werden.
   10. Laden Sie die LS-Säulen auf den Magnetsäulenabscheider und legen Sie ein 15 ml kegelförmiges Rohr auf ein Gestell darunter, um den Durchfluss zu erfassen.
   11. Spülen Sie jede Spalte mit 3 ml von 2% FBS im PBS-Puffer. Entsorgen Sie das konische Rohr mit dem Waschdurchfluss und ersetzen Sie es durch ein neues, steriles 15 ml konisches Rohr.
   12. Fügen Sie die Zellsuspension (bis zu 2,5 ml von 1 x 10⁷ Tumorzellen) auf die Säule ein. Sammeln Sie durchfließend, dass die mit menschlichen Tumorzellen angereichert werden.
   13. Waschen Sie die Säule zweimal mit 1 ml 2% FBS im PBS-Puffer.
       HINWEIS: Es ist wichtig, Waschschritte durchzuführen, sobald die Spalte leer ist. Versuchen Sie auch, luftblasen zu vermeiden.
2. Aliquot das entsprechende Volumen der Zellsuspension zu einem 1,5 ml Rohr für die gewünschte Kultur eingerichtet (Tabelle 3).
3. Zentrifugieren Sie das 1,5 ml-Rohr bei 300 x g und 4 °C für 5 min.
4. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.

2. Verarbeitung von primären Tumorgeweben des Patienten

HINWEIS: Dies ist ein erster Schritt für die organoide Einrichtung.

1. Befolgen Sie alle Schritte 1 mit Ausnahme des Erschöpfungsprozesses der Mauszelle, der für die Verarbeitung von primärem Tumorgewebe des Patienten nicht erforderlich ist.

3. Bildung einer befestigten runden Kuppel auf der Platte

HINWEIS: Dieses Manuskript beschreibt drei Möglichkeiten, eine Kuppel aus einer Mischung aus dem Zellpellet und der Kellermembran (z. B. Matrigel) herzustellen, wie in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellt. In den Schritten 2-4 sollten die Zellen und die Kellermembran auf Eis gehalten werden, um eine Erstarrung der Kellermembran zu verhindern.

1. Das Zellpellet im entsprechenden Volumen der Kellermembran (z.B. 40 l) für eine 24-Well-Platte aufstellen (Tabelle 3) wieder aufsetzen
2. Pipette sanft nach oben und unten, um sicherzustellen, dass die Zellen gut in der Kellermembran wieder aufgehängt werden.
3. Das entsprechende Volumen (Tabelle 3) des Zell-Keller-Membrangemisches (und optional 10 L adDMEM Komplettmedium) in die Mitte der vorgewärmten Gewebekulturplatte zu bringen.
4. Invertieren Sie die Platte und legen Sie die Platte sofort auf den Kopf in den CO2-Zellkultur-Inkubator, der 15 min auf 5%_CO2, 37 °C eingestellt ist. Dadurch wird verhindert, dass sich Zellen an der Plattenunterseite absetzen und festhalten, während die Kellermembran verfestigt werden kann.
5. Das entsprechende Volumen (Tabelle 3) des vorgewärmten Mediums, das 10 M Y-27632 Dihydrochlorid enthält, in jeden Brunnen geben.
6. Legen Sie die Platte rechts oben in den CO2-Zellkultur-Inkubator (5%_CO2, 37 °C).
7. Wechseln Sie alle 3-4 Tage die Medien. Verwenden Sie nach 5-7 Tagen das Kulturmedium ohne 10 M Y-27632 Dihydrochlorid, um die Kulturen zu erhalten.

4. Bilden einer schwimmenden Kuppel aus einer befestigten runden Kuppel auf der Platte

1. Lösen Sie die Kuppel nach Schritt 3.7 mit einem Zellschaber.

5. Formen von schwimmenden Perlen

HINWEIS: Dieses Protokoll wird als schwimmende Perlen benannt, da die Mischung aus Kellermembran, Medien und Organoiden wie Perlen aussieht.

1. Schneiden Sie ein 2 Zoll x 4 Zoll Stück Paraffin-Film.
2. Legen Sie die Paraffinfolie aus einer 1000-L-Kunststoff-Pipetten-Spitzenbox auf die Oberseite eines leeren Kippträgers.
3. Drücken Sie vorsichtig auf den Paraffinfilm, um die Divots mit einem gehandicapten Zeigefinger zu verfolgen, ohne jedoch den Paraffinfilm zu durchbrechen.
4. Sprühen Sie den Paraffinfilm mit 70% Ethanol und schalten Sie die UV-Lampe in der Zellkulturhaube ein, um den vorbereiteten Paraffinfilm mindestens 30 min lang zu sterilisieren.
5. Bereiten Sie eine Mischung aus Zellen und 20 L Kellermembran vor. Die Saatdichte kann 50.000 - 250.000 Zellen pro Kuppel betragen.
6. Pipette die Mischung der Zellen aus Schritt 1 oder 2 verarbeitet, und 20 l Kellermembran in die Form des Divot in der vorbereiteten Paraffinfolie gebildet.
7. Setzen Sie das Zellpellet in der Kellermembran wieder auf und pipette die Zellsuspension in dem vorbereiteten Paraffin gefilmt Eitel divots.
8. Legen Sie die erstarrten Perlen und Paraffinfolie in eine 6-Well-Platte. Ein Brunnen in einer 6-Well-Platte kann bis zu 5 Perlen passen.
9. Pipette 3-5 ml vorgewärmtes Medium mit 10 'M Y-27632 Dihydrochlorid in jeden Brunnen, während die Perlen sanft aus dem Paraffinfilm bürsten.
   HINWEIS: Als Mindestvolumen werden 3 ml empfohlen. Für eine maximale Anzahl von Perlen (N=5) pro Bohrgut werden 5 ml Medium empfohlen.
10. Legen Sie die Platte in einen_{CO2-Inkubator} (5%_CO2, 37 °C).
11. Ändern Sie die organoiden Medien alle 3-4 Tage. Verwenden Sie nach 5-7 Tagen das Kulturmedium ohne 10 M Y-27632 Dihydrochlorid, um die Kulturen zu erhalten.

6. In vivo Organoide Bildnähte mit Mikroskop⁸

HINWEIS: Bestimmte Mikroskope sind nicht in der Lage, den äußeren Umfang der Zellplatte (Kantenwand) zu erreichen; Daher empfehlen wir, die Brunnen in der Nähe des Umfangs der Zellplatte beim Annähen von Bildern zu verwenden.

1. Legen Sie die Zellkulturplatte in einer Aufwärtsposition in den Plattenhalter im Keyence-Mikroskop.
2. Platzieren Sie die Linse auf der Mitte der Zielkuppel.
3. Richten Sie den automatischen Nähvorgang ein, indem Sie die Anzahl der Rahmen auswählen. Zum Beispiel können 3 x 3 oder 5 x 5 ausgewählt werden, um insgesamt 9 Bilder oder 25 Bilder zu generieren.
4. Drücken Sie die Aufnahmetaste, um den Bildprozess zu initiieren.
5. Öffnen Sie die Bildbetrachter-Software, und laden Sie eine Gruppe von Bildern, die in Schritt 4 aufgenommen wurden.
6. Klicken Sie auf Bildheftung, um ein hochauflösendes genähtes Bild zu erstellen.
   HINWEIS: Die Erfassung von seriellen 9- oder 25-Bildern kann entweder manuell oder automatisch zur Fokussierung der Zellen durchgeführt werden.

7. Organoide Verarbeitung für die Histologie: die Agarose-Spin-down-Methode

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde an eine frühere Veröffentlichung von Vlachogiannis et al.⁷angepasst. Wir haben einen Schritt mit Agarose-Einbettung hinzugefügt, um alle Populationen von Organoiden erfolgreich einzubetten.

1. Entfernen Sie vorhandene Medien aus dem Brunnen. Achten Sie darauf, die Kellermembrankuppeln nicht zu aspirieren.
2. Fügen Sie ein gleiches (gleich dem Volumen des Mediums, das aus Schritt 1 entfernt wird) Volumen der Zellwiederherstellungslösung hinzu und brüten Sie 60 min bei 4 °C.
3. Lösen Sie die Kellermembrankuppel mit einer Pipette und zerkleinern Sie die Kellermembrankuppel mit einer Pipettenspitze. Sammeln Sie die dissoziierte Kuppel- und Zellrückgewinnungslösung in einem 1,5 ml-Rohr.
4. Zentrifuge bei 300 x g und 4 °C für 5 min.
5. Entfernen Sie den Überstand (Zellwiederherstellungslösung). Speichern Sie alle Überräube in separaten Röhren bis zum Ende, wenn das Vorhandensein von Organoiden im letzten Pelletschritt bestätigt wird.
6. Fügen Sie das gewünschte Volumen (Tabelle 3) von kalten PBS und sanft Pipette nach oben und unten, um mechanisch stören Pellet hinzufügen.
7. Zentrifuge bei 300 x g und 4 °C für 5 min.
8. Entfernen Sie den Überstand (PBS).
9. Fixieren Sie das Pellet in einem abgestimmten Volumen (z.B. 500 l für ein Pellet aus dem Zustand der 24 Wellplattenkultur, Tabelle 3) von 4% PFA für 60 min bei Raumtemperatur.
10. Zentrifugieren Sie nach der Fixierung bei 300 x g und 4 °C für 5 min.
11. Entfernen Sie den Überstand (PFA).
12. Waschen mit abgestimmtem Volumen (z.B. 500 l für ein Pellet aus dem Zustand der 24 Wellplattenkultur, Tabelle 3) von PBS und Zentrifuge bei 300 x g und 4 °C für 5 min.
13. Bereiten Sie warme Agarose (2% Agarose in PBS).
    HINWEIS: Hier können Zellpellets für gefrorene Abschnitte ohne weitere Schritte in Protokoll 7 direkt in 200 l OCT-Verbindung wieder aufgehängt werden.
14. Setzen Sie das Zellpellet in 200 l Agarose (2% in PBS) wieder auf.
    1. Unmittelbar nach dem Hinzufügen von Agarose das Zellpellet vorsichtig von der Wand des 1,5 ml-Rohrs mit der 25 G-Nadel, die an 1 ml Spritze befestigt ist, lösen. Wie in Abbildung 3dargestellt, besteht die Gefahr, dass das Zellpellet während des Einbettungsprozesses der Agarose ganz oder teilweise von der Wand des 1,5 ml-Rohrs getrennt wird.
15. Warten Sie, bis die 2% Agarose in PBS vollständig verfestigt ist.
16. Lösen Sie den erstarrten Agaroseblock mit einer 25 G Nadel, die an der 1 ml Spritze befestigt ist, vom 1,5 ml-Rohr.
17. Übertragen Sie den abgetrennten Agaroseblock mit dem Zellpellet in ein neues 1,5 ml-Rohr.
18. Füllen Sie das Rohr mit 70% EtOH und fahren Sie mit dem herkömmlichen Protokoll zur Gewebedehydrierung und Paraffineinbettung fort.

8. Histologie und Immunfluoreszenzzytochemie (IFC) von Organoiden

1. Wählen Sie die Folie(n) für Histologie oder IFC aus.
2. Bevor Sie den Färbungsprozess einleitet, finden Sie heraus, wo sich die Zellen auf der Folie befinden, und zeichnen Sie mithilfe eines Markers einen Kreis um die Zellen auf der Folie.
3. Zeichnen Sie den Umfang um die Kante oder Diebe der Folie und an der Stelle, an der sich Kreise auf der Folie in einem Labornotizbuch befinden, um deren Positionen aufzuzeichnen.
4. Führen Sie die gewünschte Färbung durch.
   HINWEIS: Während dieses Prozesses verschwinden markierte Kreise, da der regelmäßige Hersteller nicht resistent gegen die Chemikalien ist. Sogar einige histologische Dauermarker können während des Färbeprozesses ausgeahandelt werden.
5. Platzieren Sie die Folie nach dem Färbevorgang über der Zeichnung im Labornotizbuch, um die Positionen der Zellen auf der Folie zu finden.

3D-Organoide wurden erfolgreich aus einem vom Patienten abgeleiteten Xenograft(PDX)-Modell von Knochenmetastasierung Prostatakrebs (BMPC) sowie direkt aus patientenknochenmetastasischem Prostatakrebsgewebe(Abbildung 4) hergestellt. Kurz gesagt, unsere PDX-Modelle von BMPC wurden durch intrafemorale (IF) Injektion von Tumorzellen in männliche Rag2-/- c-/- Mäuse und dann PDX-Tumoren geerntet und verarbeitet, wie in diesem Manuskript beschrieben. Wie in Abbildung 4gezeigt, führte PDX-Tumorgewebe aus der PCSD-Serie zu 3D-Organoiden mit Differentialphänotypen, die sich als Zysten, Sphäroide und Organoide mit höherer Komplexität manifestierten, die sich mit diesem Protokoll bildeten.

Ein genähtes Bild aus 25 hochauflösenden 10-fachen Vergrößerungsbildern zeigte eine ganze Kuppel aus Kellermembran und Organoiden (Abbildung 5). Mit Bildanalyse-Software hat man die Möglichkeit, die Zellen oder Zellcluster zu sortieren, die größer als eine bestimmte Größe sind, oder Sphäroide oder Zysten manuell auszuwählen.

Die Schritte zur Agarose-Einbettung der Organoidkulturen und Tipps zur Beschriftung der Position der geschnittenen Organoide auf der Folie erhöhen den Erfolg der Durchführung von IFC auf den Organoiden, insbesondere wenn die Proben von Organoiden eine geringere Zelldichte als gewünscht haben. Abbildung 6 zeigt ein Beispiel für IFC auf einem 5 m dicken Paraffinabschnitt von Organoiden, die auf Cytokeratin 5 (CK5, Basalepithelzellmarker), Cytokeratin 8 (CK8, luminal epithelialer Zellmarker) und DAPI abzielen.

Abbildung 1: Etablierung und Charakterisierung von 3D-kultivierten Organoiden, die entweder aus Tumorgeweben des Patienten oder von Patienten abgeleiteten Xenograft (PDX)-Tumorgeweben stammen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Methoden zur Bildung einer Mischung aus Zellpellets und Kellermembran. Eine befestigte Kuppel (a), eine schwimmende Kuppel (b) und schwimmende Perlen (c). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Ein wichtiger Schritt für die erfolgreiche Einbettung von Agarose. Ein Prozess, um das Zellpellet von der Wand des 1,5 ml Rohres zu lösen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Differentialphänotypen von Organoiden aus einer Reihe von PCSD PDX-Tumoren, die einzelne Zellen, Zysten, Sphäroide und Organoide mit höherer Komplexität umfassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Beispiel für ein roh genähtes Bild aus insgesamt 25 hochauflösenden Bildern und dessen Anwendung für eine Follow-up-Analyse, um die Anzahl der Zellen zu zählen oder die Fläche von Zellen/Zellenclustern zu messen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Bild mit CK5 und CK8 IFC gebeiztpcSD1 Organoiden (5 m Dicke des Paraffinabschnitts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: adDMEM/F12 +/+/+ Vorbereitung. Diese Tabelle wurde bereits von Drost et al.5veröffentlicht.

Tabelle 2: Komponenten für C/S Human Media + 10 % FBS. Diese Tabelle wurde bereits von Drost et al.5veröffentlicht.

Tabelle 3: Saatdichte, Kellermembranvolumen und mittleres Volumen für eine Kuppel. Diese Tabelle wurde aus einer früheren Veröffentlichung von Drost et al.5geändert.

Sanghee Lee und Christina A.M. Jamieson sind die Gastredakteure der JoVE Methods Collection.