Summary
Kurkumin, amiloid beta proteinine tercihli bağlanması ve diğer geleneksel amiloid bağlayıcı boyalarla yapısal benzerlikleri nedeniyle beyin dokusundaki amiloid beta protein plaklarının etiketlenmesi ve görüntülenmesi için ideal bir florofordur. Amiloid beta protein plaklarını geleneksel yöntemlere göre daha verimli ve ucuz bir şekilde etiketlemek ve hayal etmek için kullanılabilir.
Abstract
Amiloid beta proteininin (Aβ) ekstra ve hücre içi alanlarda birikintisi Alzheimer hastalığının (AD) ayırt edici patolojilerinden biridir. Bu nedenle, AD beyin dokusunda Aβ varlığının tespiti AD ilerlemesini önlemek için yeni tedaviler geliştirmek için değerli bir araçtır. Ad beyin dokusunda Aβ histokimyasal olarak saptanmak için çeşitli klasik amiloid bağlayıcı boyalar, florokrom, görüntüleme probları ve Aβ'ya özgü antikorlar kullanılmıştır. Aβ tespiti için bu bileşiklerin kullanımı maliyetli ve zaman alıcıdır. Ancak, yoğun floresan aktivitesi, yüksek afinite ve Aβ özgüllüğü ve geleneksel amiloid bağlayıcı boyalar ile yapısal benzerlikler nedeniyle, curcumin (Cur) postmortem aβ plakların etiketlenmesi ve görüntülenmesi için umut verici bir adaydır beyin dokusu. Bu bitki Curcuma longadoğal bir polifenol olduğunu. Bu çalışmada Cur, 5x ailesel Alzheimer hastalığının genetik fare modeli (5xFAD) ve insan AD dokusundan bir dakika içinde aβ plaklarını histokimyasal olarak etiketlemek için kullanılmıştır. Cur'un etiketleme yeteneği, tioflavin-S (Thio-S), Kongo kırmızısı (CR) ve Floro-yeşim C (FJC) gibi geleneksel amiloid bağlayıcı boyalarla ve Aβ'ya özgü antikorlarla (6E10 ve A11) karşılaştırıldı. Cur'un bu geleneksel boyalarla karşılaştırıldığında Aβ plaklarını etiketlemenin ve imajanın en ucuz ve en hızlı yolu olduğunu ve Aβ'ya özgü antikorlarla karşılaştırılabilir olduğunu gözlemledik. Buna ek olarak, Cur oligomerler ve fibriller gibi çoğu Aβ türü ile bağlanır. Bu nedenle Cur, Aβ plakları için en uygun maliyetli, basit ve hızlı florokrom algılama ajanı olarak kullanılabilir.
Introduction
Alzheimer hastalığı (AD) en yaygın biridir, yaşa bağlı, ilerleyici nörolojik bozukluklar ve ölüm önde gelen nedenlerinden biri dünya çapında1,2. Öğrenme, hafıza ve biliş bozukluğu, nöropsikiyatrik bozukluklar ile birlikte, yaygın belirtiler AD3tezahür vardır. AD'nin etiyolojisi tam olarak açıklanmamakla birlikte, mevcut genetik, biyokimyasal ve deneysel kanıtlar Aβ'nın kademeli birikiminin AD4için kesin bir biyobelirteç olduğunu göstermektedir. Bu yanlış katlanmış protein hücre içi ve hücre dışı alanlarda birikir ve sinaptik kaybı dahil olduğu düşünülmektedir, artan nöroinflamasyon, ve beyinde kortikal ve hipokampal bölgelerde nörodejenerasyon AD etkilenen5. Bu nedenle, AD dokusunda Aβ histochemical tespiti AD ilerlemesini önlemek için toksik olmayan, anti-amiloid ilaçların geliştirilmesinde önemli bir ilk adımdır.
Son birkaç on yıl içinde, birçok araştırma laboratuarı tarafından beyin dokusundaki Aβ plaklarını etiketlemek ve görüntülemek için çeşitli boyalar ve antikorlar kullanılmıştır, ancak bu yöntemlerden bazıları zaman alıcıdır ve kullanılan boyalar veya antikorlar pahalıdır ve birkaç aksesuar gerektirir. Kimyasal. Bu nedenle, AD beyninde Aβ plakların tespit ucuz bir araç geliştirilmesi hoş bir yeni araç olacaktır. Birçok laboratuvar cur kullanmaya başladı, umut verici bir anti-amiloid doğal polifenol, etiketleme ve görüntüleme Aβ için, yanı sıra AD için bir terapötik ajan6,7,8,9. Hidrofobikliği ve lipofilik yapısı, klasik amiloid bağlayıcı boyalarla yapısal benzerlikleri, güçlü floresan aktivitesi ve Aβ ile bağdaştırılan güçlü yakınlığı, Aβ dokudaki Aβ plaklarının etiketlenmesi ve görüntülenmesi için ideal bir florofon yapar10 . Aβ-plaklar ve oligomerler ile cur bağlanır ve varlığı da hücre içi alanlarda tespit edilir7,11,12,13. Buna ek olarak, bu minimal miktarda (1−10 nM) Cur 5x ailesel Alzheimer hastalığı (5xFAD) beyin dokusu nda Aβ plaklar etiket olabilir gösterilmiştir7. 1 nM konsantrasyonu Aβ plakların sayımı için optimum floresan yoğunluğunu sağlamasa da, 10 nM veya daha yüksek cur konsantrasyonu yapar. Ran ve meslektaşları14 gibi düşük dozlarda 0.2 nM difluoroboron-türevleştirilmiş Cur olarak yaklaşık bir kızılötesi prob in vivo Aβ mevduat tespit edebilirsiniz bildirdi. Bu dozun dokudaki Aβ plaklarını etiketlemek için yeterli olup olmadığı henüz belli değildir. Daha önceki çalışmaların çoğunda Cur kullanarak Aβ plaklarını boyamak için 20−30 dk kullanılmıştır, ancak optimal boyama çok daha az zaman gerektirebilir.
Bu çalışma, Cur'un AD beyin dokusundaki Aβ plaklarını etiketlemek için gerekli olduğu minimum süreyi test etmek ve Cur ile diğer konvansiyonel ile boyandıktan sonra 5xFAD farelerinden beyin dokusundaki Aβ plaklarının etiketlenmesi ve görüntülenmesi hassasiyetini karşılaştırmak için tasarlanmıştır. Thioflavin-S (Thio-S), Kongo kırmızısı (CR) ve Floro-yeşim C (FJC) gibi aβ bağlayıcı boyalar. Bu klasik amiloid bağlayıcı boyaların Aβ etiketleme yeteneği, 5xFAD farelerinden parafin gömülü ve kriyostat koronal beyin kesitlerinde ve yaşlı uyumlu insan AD ve kontrol beyin dokusundan Cur boyama ile karşılaştırıldı. Bulgular, Cur'un Aβ plaklarını Aβ spesifik antikorlara (6E10) benzer ve Thio-S, CR veya FJC'den orta derecede daha iyi bir şekilde etiketlediğini göstermektedir. Buna ek olarak, 5xFAD fareler için Cur intraperitoneal enjeksiyonları 2−5 gün boyunca uygulandığında, kan-beyin bariyerini geçti ve Aβ plaklar ile bağlı7. İlginçtir, Cur nanomolar konsantrasyonları etiketleme kupuran ve görüntü Aβ plaklar 5xFAD beyin dokusu7,14. Ayrıca, çekirdek, neuritik, diffüz ve yanmış plaklar gibi morfolojik olarak farklı Aβ plaklar Cur tarafından diğer konvansiyonel amiloid bağlayıcı boyalardan daha verimli olarak etiketlenebilir7. Genel olarak Cur, Ad hayvan modellerinden ve/veya insan AD dokusundan postmortem beyin dokusundaki Aβ plaklarını, Aβ'ya özgü antikorlara güvenilir bir alternatif olarak kolay ve ucuz bir şekilde etiket ve görüntü ye uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Saginaw Valley State University Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. İnsan dokusu Arizona Banner Sun Sağlık Enstitüsü'nde kurulmuş bir beyin bankası elde edildi15,16.
1. Hayvanların perfüzyonu
- Fiksatif ve perfüzyon tamponlarını hazırlayın.
- 80 g sodyum klorür (NaCl), 2 g potasyum klorür (KCl), 21,7 g disodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4·7H2O), 2,59 g potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO 4) ekleyerek 0,1 M sodyum fosfat tamponu hazırlayın ), ve çift distile su toplam 1 L yapmak.
- Hazırlamak 4% paraformaldehit (PFA).
- PBS 1 L (0.1 M, pH 7.4) paraformaldehit 40 g ekleyin.
- PFA çözeltisini 60−65 °C'ye ısıtın ve manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın.
NOT: Sıcaklık 65 °C'yi geçmemelidir. - PfA'yı tamamen eritmek için damlalıkla birkaç damla NaOH (1 N) ekleyin.
- PFA çözeltisini orta ve ince filtre kağıdıyla filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
NOT: Çözüm bir ay için iyidir.
- Hayvan anestezisi ve perfüzyon uyguluyor.
NOT: On iki aylık B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J (5×FAD) yaşuyumlu kontrol fareleri (grup başına n = 6) satıcılardan satın alınmış ve Saginaw Valley State Üniversitesi hayvan evinde yetiştirilmiştir. Genotipleme polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tarafından daha önce açıklandığı gibi doğrulandı7. İnsan AD beyin dokusu postmortem AD beyin dokusu ve yaş uyumlu kontrol dokusu içerir.- Sodyum pentobarbital (390 mg/kg vücut ağırlığı) veya ketamin/ksilazin karışımı (80 mg/kg vücut ağırlığı ketamin ivedi ve 10 mg/kg vücut ağırlığı xylazine) gibi uygun bir anestezik ajanla hayvanı intraperitoneal enjeksiyon (27 G iğne ve 1) ile anestezik mL şırınga). Bir parmak çimdikleme anestezi düzeyini kontrol edin. Hayvan tepkisiz ise, o zaman perfüzyon cerrahisi için hazırdır.
- Perfüzyon ameliyat tepsisi üzerinde supine pozisyonda anestezi hayvan yerleştirin ve küçük iris makas kullanarak sol ventrikül arka ucuna bir kesi yapmak.
- Sol ventriküle 22 G perfüzyon iğnesi yerleştirin ve perfüzyon sıvısını vücuttan çıkarmak için sağ auricle'da küçük bir kesi yapın. Buz gibi perfüzyon sıvısının (0,1 M PBS, pH 7,4) 5−6 dk (akış hızı 20−25 ml/dk) akmasını sağlamak için yer çekimiyle beslenen perfüzyon sistemini kullanın.
NOT: Berrak bir karaciğer optimum perfüzyonun göstergesidir. - Tampon valfi sabitleme için buz gibi %4 paraformaldehit çözeltisine geçirin ve 8−10 dk boyunca akmasını bekleyin.
NOT: Sertleşmiş veya sertleşmiş uzuvların takip ettiği titreme iyi bir fiksasyon göstergesidir. - Makas kullanarak kafatasından beyni çıkarın. Bir spatula kullanarak, beyni toplayın ve %4'lük pfa (beyin hacminin en az 10 katı) bir şişeye yerleştirin ve daha fazla kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
2. Doku işleme
- Cryostat bölümlerini kesin.
- Beyni dereceli sakkaroz çözeltilerine aktarın (%10, %20 ve %30) ve kullanım anına kadar her biri 24 saat boyunca 4 °C'de saklayın.
- -22 °C'de kriyostat kullanarak 40 μm kalınlığında kesin. PBS ve sodyum azid (%0.02) ile dolu 6 kuyuluk tabakasında kuyu başına 10−20 kesit toplayın.
- Parafin fare ve insan beyin dokusu için bölümleri gömmek.
- Parafin kesitleri için perfüzyonve 24 saat post-sabit beyin dokusunu dereceli alkollerle susuz düşürün (%50, %70, %90) 2 saat için, 1 saat için% 100 alkol 2x takip), ve sonra xylene 2x ile 1 saat her) oda sıcaklığında.
- Alüminyum folyo ile kaplı cam konik bir şişe de 56 °C'de 1 saat için ksilen-parafin (1:1) 2x ile doku nüfuz.
- 4−6 saat boyunca eritilmiş parafin (56 °C) doku batırın.
- Oda sıcaklığında döner bir mikrotom kullanarak 5 μm kalınlığında keserek 45 °C'de bir doku suyu banyosuna yerleştirin.
- Histokimyasal Cur ile kriyostat bölümlerde Aβ plaklar etiket.
- Her biri 5 dk için PBS (pH 7.4) 3x ile 2.1.2 adımdan bölümleri durulayın.
- Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca% 70 etanol içinde bölümleri batırın.
- 10 μM'lik son çalışma konsantrasyonunu elde etmek için stok Cur'u (1 mM) metanolve seyrelti% 70 etanol ile çözün.
- 150 rpm'de bir çalkalayıcıüzerinde oda sıcaklığında 1−5 dk çalışan Cur çözeltisi ile bölümleri batırın.
- Cur çözeltisini atın ve her biri 2 dakika boyunca %70 etanol 3x ile yıkayın.
- Bölümleri poli-L-l-lizin kaplı cam kaydıraklarüzerine koyun ve distiren plastikleştirici ksilen (DPX) gibi organik montaj ortamı nı kullanarak bir kapaklı monte edin.
- 480/550 nm uyarma/emisyon filtrelerini kullanarak floresan mikroskop altında görüntüle.
- Histokimyasal cur ile parafin gömülü fare ve insan beyin bölümlerinde Aβ plaklar etiket.
- Oda sıcaklığında her biri 5 dk için ksilen 2x ile adım 2.2.4 doku bölümlerini deparaffinize.
- Dereceli alkol solüsyonları ile rehydrate (100%, 80%, 70%, 50% 1 dakika her biri için) ve distile su ile 2x oda sıcaklığında 5 dakika.
- 150 rpm sallayarak, karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika cur (10 μM) ile leke bölümleri. Her biri 2 dakika için %70, %90 ve %100 alkol ile yıkayın.
- Her biri 5 dk için ksilen 2x ile temizleyin ve DPX ile kapak fişi.
- Adım 2.3.7'de belirtildiği gibi floresan mikroskobu altında görselleştirin.
- Cur'u Aβ plakları ve oligomerlerde Aβ antikorile birleştirir.
- 12 kuyu plakalı PBS 3x ile adım 2.1.2'den cryostat bölümleri yıkayın.
- PBS'de %10 normal keçi serumu (NGS) çözünmüş ve %0,5 Triton-X-100 ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca çözünmüş olan bölümleri bloke edin.
- Engelleme çözümlerini atın. Aβ-spesifik antikorlar (6E10 veya A11, seyreltilmiş 1:200) ile bölümleri kuluçkaya yatırın ve %10 NGS ve %0,5 Triton-X100 içeren taze bloklama çözeltisinde bir gecede 4 °C'de 150 rpm'de bir çalkalayıcıda çözünün.
- Antikor çözeltisini atın ve bölümleri Her biri 10 dakika PBS 3x ile yıkayın.
- Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca kırmızı florofor (örneğin Alexa 594) ile ikincil antikor etiketi ile kuluçka.
- Her biri 10 dakika boyunca PBS 3x ile yıkayın.
- % 70 alkol 1x ile yıkayın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Cur (10 μM) ile bölümleri kuluçkaya yatırın.
- Her biri 1 dk için %70 alkol 3x ile yıkayın.
- Her biri 1 dk için %90 ve %100 alkol le susuz kalın, her biri 5 dk için ksilen 2x ile temizleyin ve DPX kullanarak slaytlara monte edin.
- Kırmızı ve yeşil sinyaller için uygun uyarma/emisyon filtreleriyle floresan mikroskobu kullanarak görselleştirin.
- Hücre içi Aβ kolokalizasyonu için, Aβ-antikor (6E10), 150 rpm'de sallayarak karanlıkta oda sıcaklığında Cur ile restain ve 10 dakika oda sıcaklığında 10 dakika boyunca Hoechst-33342 (1 mg/ml) ve/veya DAPI (1ug/ml) ile karşı lekesi 150 rpm sallayarak ile karanlık. PBS 3x ile yıkayın.
- 100x hedefi (toplam büyütme 1.000x) ile kırmızı, yeşil ve mavi filtreler ile görüntü alın.
- Thio-S, CR ve FJC ile Etiket Aβ plaklar.
NOT: Thio-S ve CR etiketleme için ayrıntılı protokoller daha öncebildirilmiştir 7.- FJC boyama için, adım 2.1.2'den elde edilen serbest yüzen bölümleri PBS 3x ile 5 dakika boyunca yıkayın.
- Bölümleri 12 kuyu plakası ve FJC ile lekeye yerleştirin (%0.001) oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika.
- FJC çözeltisi atın ve her biri 5 dakika PBS 3x ile yıkayın.
- Amonyum klorür ile inkübül (NH4Cl, 50 mM PBS çözünmüş) oda sıcaklığında 10 dakika.
- NH4Cl çözeltisini atın ve her biri 5 dakika PBS 3x ile yıkayın.
- Bölüm 2.4'teki adımları takiben, 450/520 nm uyarma/emisyon filtrelerini kullanarak floresan mikroskop altında dereceli alkol solüsyonu, açık, montaj lı ve görünümiçeren dehidrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Curcumin bir dakika içinde Aβ plakları etiketler. Cur ile 5xFAD dokusunu boyadığımızda, Cur etiketia Aβ plaklarının 1 dk içinde olduğunu bulduk. Cur ile artan kuluçka süresi Aβ plaklarının floresan yoğunluğunu biraz artırsa da, gözlenen Aβ plaklarının sayısı 1 dk ile 5 dk boyama süresi arasında anlamlı olarak farklı değildi(Şekil 1).
Cur, aβ plaklarını kriyostat-hazır, parafin gömülü fare ve fare AD beyin dokusunda Aβ spesifik antikorlarla biraraya getiren insan AD dokusunda etiketleyebilir. Kriyokesit, parafin le gömülü kesitler(Şekil 2A)ve insan AD dokusunu(Şekil 2B)boyadığımızda, her türlü doku kesitinde Cur etiketli Aβ plakları gözlemledik. Ayrıca, Cur'un Aβ plaklarına bağlı olduğunu doğrulamak için plakları önce 6E10 ile etiketledik, ardından Cur boyama. Cur'un 6E10 'u(Şekil 2C)birbirine bağlayan aynı plaklarda Aβ ile tamamen birlikte lokalize olduğunu gözlemledik.
Cur Aβ oligomerleri ve hücre içi Aβ agregaları olarak etiketlenmiştir. Cur'un Aβ oligomerleri etiketleyip etiketlemediğini kontrol etmek için 5xFAD fare bölümleri Aβ oligomer spesifik antikor (A11) ile boyandı ve ardından Cur boyama yapıldı. Cur'un Aβ plaklarında A11 ile birlikte lokalize olduğunu gözlemledik (Şekil 3A). Benzer şekilde Cur, hücre içi alanlarda ki 6E10 antikorile(Şekil 3B)birlikte lokalize ederek hücre içi Aβ'yı etiketleyebilenbir rol de çekebiliyor.
Cur, Aβ'yı klasik amiloid bağlayıcı boyalardan daha belirgin bir şekilde etiketledi. Cur tarafından Aβ etiketleme ticari olarak kullanılabilir amiloid bağlayıcı boyalar Thio-S, CR, FJC ile karşılaştırıldı. Aβ-spesifik antikor 6E10 standart kontrol olarak kullanılmıştır. Cur'un Aβ'yı konvansiyonel amiloid bağlayıcı boyalardan daha belirgin olarak etiketlediğini gözlemledik (Şekil 4).
Zerdeçal ekstresinde de bulunan bis-demethoxycurcumin (BDMC) ve demethoxycurcumin (DMC) cur türevleri, 5xFAD beyin dokusunda Nispeten Aβ plaklarını Cur'a etiketler. BDMC ve DMC gibi diğer iki ana bileşen zerdeçal ekstresinde bulunur. Bu iki bileşiğin Cur'a benzer Aβ plaklarını etiketleyip etiketlemediğini test ettik. 5xFAD fare beyin bölümleri bu türev lerle boyandığında, hem BDMC hem de DMC, Cur'a paralel olarak Aβ plakları olarak etiketlenmiştir (Şekil 5A). Cur ile boyandıktan sonra Aβ-görüntüleme ile girişim olup olmadığını kontrol etmek için farklı montaj ortamları araştırıldı. Floresan sinyal, DPX (Şekil 5B)gibi hem sulu hem de organik montaj ortamlarında sağlamdı. Aβ plaklarının Cur ile boyanarak immünororesan etiketlemeden sonra uygun olduğu ve ardından Hoechst 33342 solüsyonu (1 mg/ml) veya 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, 1μg/ml) ile karşı boyama yapıldı. İmmünofloresan sinyalleri ve karşı boyama yoğunluğu Cur boyama sonra muhafaza edildi(Şekil 5C).
Şekil 1: Curcumin bir dakika içinde Aβ plakları etiketler. (A) 5xFAD fareveya insan kontrolü ile AD kortikal dokusundan beyin kesitleri 1−5 dk kür (10 μM) ile boyandı ve görünür plak sayısı sayıldı. (B). Aβ-plak sayısı nın 1 dk ile 5 dk boyama süreleri arasında bir fark gözlenmedi. Veriler ortalama ± standart hatası (SEM) olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Aβ plaklarında Kür'ün Aβ antikor ile birlikte lokalizasyonu. Cur, Aβ plaklarını kriyostat-hazır, parafin gömülü kesitlerde(A)ve insan AD dokusunda(B)etiketleyebilir. Aβ etiketleme, etiketlemeyi Aβ'ya özgü antikor (6E10, DAB boyama) ile paralel olarak etiketledi. (C) 5xFAD bölümleri ilk olarak Aβ antikor (6E10) ile etiketlendi ve ardından Cur ile boyama yapıldı. Kırmızı = 6E10 Alexa florofor 594 ile etiketlenmiş ikincil bir antikor ile bağlı. Yeşil = Cur. Cur, 6E10'a bağlı aynı plaklarda Aβ ile tamamen kolokalize edin. Oklar Aβ plaklarını gösterir. Ölçek çubuğu soldaki üç görüntüde 50 μm (toplam büyütme = 400x) ve 10 μm (toplam büyütme = 400x) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Curcumin etiketleri Aβ oligomerler ve hücre içi Aβ. (A) Aβ-oligomer immünohistokimyasal olarak Aβ-spesifik antikor (A11) kullanılarak saptanır ve ardından Cur ile boyama yapılır. Cur, A11'in bağlandığı aynı oligomerde Aβ ile tamamen kolokalize edin. Ölçek çubuğu = 250 μm ve toplam büyütme = 100x. (B) Benzer şekilde, hücre içi Aβ immünohistokimyasal olarak Aβ'ya özgü bir antikor (6E10) kullanılarak saptanır ve ardından Cur ile boyama yapılır. Cur'un 6E10'a bağlı aynı alanlarda Aβ ile tamamen birlikte lokalize olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu = 50 μm ve toplam büyütme = 1.000x. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farklı amiloid bağlayıcı boyaların Cur ile karşılaştırılması aβ plakları etiketlemek. 12 aylık 5xFAD farelerinin korteksinden kriyostat kesitleri (40 μm) Cur, Thioflavin-S, Kongo kırmızısı, Floro-yeşim C ve 6E10 antikor ile boyandı. Cur, Aβ plaklarını Thio-S, CR ve FJC'den daha belirgin bir şekilde etiketledi. Oklar Aβ plaklarını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Cur-türevleri bis-demethoxy curcumin ve demethoxy curcumin de Cur benzer Aβ etiket. (A) Hem kriyostat hem de parafin le revirlenmiş 5xFAD kesitleri Cur-türevleri bis-demethoxy curcumin ve demethoxy curcumin ile boyandı. Her iki türev de Aβ plaklarını Cur'a benzer bir şekilde etiketler. (B) Aβ plaklarını Cur ile etiketledikten sonra doku kesitlerini monte etmek için hem sulu hem de organik montaj ortamı (DPX) kullanılmıştır. (C) Cur ile Aβ etiketlemeiçin immunolabeled kesitler kullanılmıştır. Beyaz oklar Aβ plaklarını, yeşil ok aktif astrositi (GFAP) ve sarı ok nükleer lekeyi (DAPI) gösterir. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Özellik | Aβ-antikor | Curcumin | Thio-S | Kongo kırmızısı | Floro-Yeşim C |
| Boyama süresi | ~24-48 saat | ~1-5 dk | ~10 dk | ~60 dk | ~30 dk |
| Aksesuar kimyasalları | Sekonder antikorlar, tampon yapmak için çeşitli kimyasallar, normal keçi serumu | Metan -ol | Etanol | NaOH ve etanol | NaOH ve etanol, potasyum permanganat |
| Maliyet | Pahalı: bir Aβ-spesifik antikor şişe ~ $ 200-300 gerektirir | Maliyet etkin: ~ $ 5-10/1 g Cur ve birçok dokuiçin uygulanabilir | Maliyet etkin: ~$5/1 g, birkaç doku için uygulanabilir | Maliyet etkin: >$5/1 g Kongo kırmızısı, ve çeşitli dokular için uygulanabilir | Pahalı: ~$15.500/1 g FJC tozu |
| Özgüllüğü | Aβ oligomerler ve fibriller için farklı antikorlar gereklidir | Curcumin Aβ oligomerler ve fibriller ile bağlanır | Sadece fibriller bağlayabilirsiniz, monomerler değil, veya oligomerler | Sadece Aβ-protofibrils ve fibrils16,17 ile bağlanabilir | Sadece Aβ-fibriller ve dejenere nöronlar ile bağlanabilir |
| Istikrar | İkincil antikora bağlı boyaya bağlı olarak | Aβ ile bağlı yken oda sıcaklığında bile çok kararlı | Metanolde stabil | Etanolde stabil | Kararlı değil |
| Boyama sonrası bakım | Karanlıkta tutulmak ve sürekli dondurulması gibi boyama dan sonra ekstra bakıma ihtiyaç duyar | Oda sıcaklığında ışığa duyarlı ve daha kararlı değil | Işığa duyarlı | Işığa duyarlı değil | Işığa duyarlı |
| Mikroskop gerekli | Bileşik ışık veya floresan (ikincil antikor kullanımına bağlı olarak) | Flore -san | Flore -san | Işık mikroskop veya polarize mikroskop veya polarize filtre | Flore -san |
| Arka plan boyama | Genellikle, hiçbir arka plan | Çok düşük arka plan | Hücredeki lipid membran veya lipid bileşikleri ile bağlanmaya bağlı yüksek arka plan | Düşük arka plan | Yüksek arka plan |
| In vivo Aβ-görüntüleme | Geçerli olmayabilir | Son derece uygulanabilir | Geçerli olmayabilir | Geçerli olmayabilir | Geçerli olmayabilir |
Tablo 1: Aβ etiketlemenin farklı amiloid bağlayıcı boyalar ve Cur 7 ile karşılaştırılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hipotezimiz, Cur'un diğer klasik amiloid bağlayıcı boyalarla karşılaştırıldığında postmortem AD beyin dokusundaki Aβ plaklarını etiketlemenin ve iletmenin en hızlı, en kolay ve en ucuz yolu olarak kullanılabileceğini ve aβ'ya özgü antikorlar olabileceğini ileri sürüyordu. Bu çalışmanın amacı, Postmortem AD beyin dokusunda Cur tarafından Aβ plaklarının etiketlenip görüntülemesi için gereken minimum süreyi belirlemek ve Cur'un Aβ plaklarını etiketlemek için Aβ antikora alternatif olarak kullanılıp kullanılamayacağını belirlemekti. Bu amaçla, Cur'un Aβ-etiketleme yeteneği farklı zaman noktalarında gözlenmiştir. Cur bir dakika içinde Aβ'yı etiketlemeyi başardı. Buna ek olarak, Aβ by Cur'un etiketlemesi Thio-S (%0.1), CR (%1) ve FJC (%0.001) gibi diğer konvansiyonel amiloid bağlayıcı boyalardan daha büyüktü.
Cur, Yapısal, fiziksel, kimyasal ve biyolojik özellikler10dahil olmak üzere konvansiyonel amiloid bağlayıcı boyaların çoğu tarafından sahip çoğu özelliğine sahip olduğu için, Aβ etiketleme için benzersiz ve ideal bir florofor olarak kabul edilir. Buna ek olarak, uygun fiyat nedeniyle, çoğu araştırmacı bu doğal polifenol kullanarak ilgileniyoruz. Cur'un Aβ plakları ve oligomerlere bağlanmasının özgüllüğünü göstermek için 6E10 ve A11 (Aβ-oligomer spesifik antikor) kullandık. Cur dokuda bulunan Aβ mevcut tüm farklı türleri ile neredeyse tam kolokalizasyon gösterdi, Hangi Cur son derece Aβözgüolduğunu göstermektedir7 ,17,18,19,20. Buna ek olarak, Cur aβ oligomerler (Şekil 3A) ve hücre içi Aβ agregaları (Şekil 3B) etiketli ve Aβ antikorları ile birlikte (Şekil 2B), Cur'un sadece hücre dışı Aβ plakları, aynı zamanda Aβ hücre içi alanlarda yatırılan7.
Son birkaç on yıl içinde, aβ plaklarını histokimyasal olarak etiketlemek ve görüntülemek için çeşitli floroforlar ve antikorlar geliştirilmiştir. Kuşkusuz, bunların çoğu hedeflenen Aβ türlerine ve Aβ plaklarını tespit etmeye çok özeldir, ancak bunlar çok daha pahalıdır ve kullanımları Cur kullanmaktan daha fazla zaman alıcıdır. Örneğin, Aβ'ya özgü antikor (6E10) referans kontrolü olarak kullanıldığı Thio-S, CR ve FJC gibi diğer amiloid bağlayıcı boyalarla Cur tarafından Aβ plak bağlamasını karşılaştırdık. Bu sonuçlar Cur'un Aβ plaklarını diğer floroforlardan daha güçlü bir şekilde etiketlediğini göstermektedir. En önemlisi, Cur'a göre, daha yaygın olarak kullanılan floroforların bazılarının etiketleme ve görüntüleme Aβ açısından belirgin dezavantajları vardır. Örneğin, Thio-S,21nolu hücredeki lipid zarları veya lipid bileşikleri ile bağlandığı için dikkat dağıtıcı, yüksek bir arka plan üretebilir. Benzer şekilde, Cr, yaygın Olarak Aβ etiketlemek için kullanılır, polarize mikroskop altında elma yeşili birefringence (Şekil 4) üretir. CR, Cur veya Thio-S gibi Aβ-plakları kolayca etiketlemez, Cur7tarafındantespit edilenlerden önemli ölçüde daha az Aβ plakları etiketlemez,22,23. Gutierrez ve ark bildirdi FJC, Hangi Aβ ile bağlanabilir ve dejenere nöronlar ile, ya Cur veya Thio-S24daha düşük bir frekansta etiketler . Bu sonuçlar, yaygın olarak kullanılan bu klasik belirteçlerin Aβ plaklarına bağlanmaya Cur'dan daha az yakınlık gösterdiğini göstermektedir.
Buna ek olarak, farklı Aβ-plak türlerinin (çekirdek, neuritik, diffüz, yanmış-dışarı) etiketlemesi, diğer amiloid bağlayıcı floroforlar yerine Cur ile optimize edilebilir, çünkü Cur morfolojik olarak farklı Aβ plaklarını görselleştirmeye ve ayırt etmeye yardımcı olabilir, oysa diğer teknikler bu morfolojik alt tipleri ayırt etmek için başarısız7. Benzer şekilde, Aβ'nın farklı türlerine çok özel olan Aβ spesifik antikorların kullanımı çok maliyetli dir ve zaman alıcıdır ve immünohistokimya yoluyla en az 24−48h alır. Ayrıca, Farklı Aβ türlerinin saptanması farklı antikorların yanı sıra çeşitli aksesuar kimyasalları da gerektirir ve bu da toplam maliyeti önemli ölçüde arttır. Açıkçası, Cur daha az maliyetli, daha kolay kullanılabilir, ve Aβ plaklar bağlanır zaman daha yüksek floresan yoğunluğu üretir. CR aynı zamanda Aβ plaklarının etiketlenmesi ve görüntülenmesi için nispeten uygun maliyetli bir teknik olmasına rağmen, Cur oligomers25 (Şekil 3 ve Şekil 4)gibi Aβ türlerinin daha fazlasını bağlayıp etiketleyebilir, CR ise sadece protofibrillere bağlanır ve fibrils23. Bu nedenle, Cur ile Aβ etiketleme Thio-S, CR veya FJC(Tablo 1)tarafından daha verimli ve maliyet-etkin elde edilebilir.
Özetle, Cur Ad beyin dokusundan Aβ plakları ve oligomerleri etkili, hızlı ve ucuz bir şekilde tespit edebilir. Buna ek olarak, Cur Aβ'ya bağlanma çok özeldir ve floresan aktivitesi çok kararlıdır. Aβ'yı etiketlemek için minimum miktarda (1-10 nM) gerekir. Ayrıca, Cur da fibrils veya plaklar gibi farklı Aβ türlerine çok özel, yanı sıra oligomers7. Benzer şekilde, Cur türevleri demethoxycurcumin ve bisdemethoxycurcumin de amiloid bağlayıcı özellikleri ve c etiket Aβ Cur benzer liman10 (Şekil 5A). Bu nedenle Cur, postmortem beyin dokusunda Aβ plaklarının etiketlenmesi ve görüntülenmesi için ideal bir florofordur. Ad'nin deneysel hayvan modellerinde anti-amiloid tedavisi sonrası Aβ plak yükünü tespit etmek için hızlı ve kolay bir alternatif olarak kullanılabilir. Bulgularımız Cur'un Aβ'ya olan yüksek yakınlığıraporlarını doğrulayarak, ölüm sonrası beyinde ve canlı dokuda Aβ-plakların izlenmesi için potansiyel kullanımını güçlendirmektedir.
Optimal Cur etiketlemeiçin Aβ'yı perdelik olmayan dokuda Cur ile etiketlememek ve perfüzyon da olsa daha büyük miktarda arka plan üretebildiği için uzun süreli doku depolanmasını önlemek önerilir. Colabeling için, cur ile boyama önce kullanılan spesifik antikor ile ilk immünohistokimya tamamlamak ve daha sonra DAPI veya Hoechst kullanarak karşı boyama ile bu takip önerilir.
Bu yöntemde yapılacak olası değişiklikler arasında Cur'un doku ile kuluçka süresinin 30 dakikaya kadar artırılması sayılabilir, bu da sinyal yoğunluğunu engellemez, ancak görüntüleme sırasında arka planı artırabilir. Cur konsantrasyonunun 10 μM'nin daha azına düşmesi Aβ etiketlemesini önemli ölçüde etkilemez. Insan beyin dokusu için arka plan azaltmak için, alternatif bir hazırlık yöntemi uygulanabilir. Örneğin, beyin bölümleri başlangıçta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %70 etanol (v/v) içinde %0.3 (w/v) Sudan Black B ile tedavi edilebilir. Sonra bölüm oda sıcaklığında 10 dakika Cur ile boyanmış olabilir ve 15 dakika pbs 3x ile yıkanmış, counterstained, ve antifading medya ile monte13. Kriyostat kesit kalınlıkları da 20−25 μm'ye düşürülebilir.
Bu yönteme olası uyarılar, hücre dışı Aβ plaklarından farklı olan kan damarlarında bulunan Aβ ile Cur bağlanmasını içerir. Bu nedenle araştırmacı, kan damarlarındaki Aβ plaklarının ve oligomerlerin morfolojisinin farkında olmalıdır. Araştırmacı otomatik floresan sinyalleri farkında olmalıdır. Aşırı yeşil arka plan Cur boyama sonra bazen görülebilir, ancak bu boyama süresini azaltarak veya Cur konsantrasyonu azaltarak azaltılabilir. Son olarak, diğer belirteçlerle birlikte etiketleme sinyali, takas maddesi (örn. ksilen) ile tekrarlanan tedaviler nedeniyle azaltılabilir.
Önemli sınırlamalar arasında floresan izotiyosiyanat (FITC) gibi yeşil floresan boya ile etiketlenmiş ikincil antikor kullanılarak herhangi bir marker proteini ile birlikte etiketlenememe yer almaktadır. Bunlar Cur'un benzer uyarılması/salınımı nedeniyle kullanılamaz. Ayrıca, M.S. erken aşamalarında, Sadece sınırlı miktarda Aβ Cur tarafından etiketlenebilir. Son olarak, herhangi bir floresan boya gibi karanlık ortamda çalışmak için bir ihtiyaç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma için destek St Mary's Yükselişi Alan Nörobilimler Enstitüsü geldi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1x70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
- Cummings, J. L.
- Jack, C. R., Holtzman, D. M.
- Tarawneh, R., Holtzman, D. M. The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Chen, M., et al. Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).
- Maiti, P., et al. A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice. Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42. International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).
- den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer's disease brains: Implications for in-vivo diagnostics. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).
- Koronyo, Y., et al. Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer's disease. JCI Insight. 2 (16), (2017).
- Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment. Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).
- Koronyo-Hamaoui, M., et al. Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model. NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).
- Ran, C., et al. Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits. Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).
- Beach, T. G. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007. Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).
- Green, S. J., Killiany, R. J. Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD. Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).
- Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro. Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).
- Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model. Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).
- Mutsuga, M., et al. Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer's brain. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).
- Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).
- Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product. Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).
- Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations. Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).
- Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).
- Gutierrez, I. L., et al. Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade. ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).
- Yang, F., et al. Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo. Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).
