Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen bildgebenden Ansatz zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von mEGFP-getaggten Rezeptor-Oligomeren, die durch Ligandenbindung in der Plasmamembran lebender Zellen induziert werden. Das Protokoll basiert auf der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie in Kombination mit der Number and Brightness (N&B)-Analyse.

Zusammenfassung

Trotz der Bedeutung und Allgegenwart der Rezeptor-Oligomerisierung sind nur wenige Methoden zum Erkennen von Clustering-Ereignissen und zur Messung des Clustering-Grades anwendbar. Hier beschreiben wir einen bildgebenden Ansatz zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von mEGFP-getaggten Rezeptor-Homokomplexen in der Membran lebender Zellen. Das Protokoll basiert auf der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie in Kombination mit der Number and Brightness (N&B)-Analyse. N&B ist eine Methode ähnlich der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) und dem Photonenzählhistogramm (PCH), die auf der statistischen Analyse der Schwankungen der Fluoreszenzintensität von Fluorophoren basieren, die in und aus einer Beleuchtung diffundieren. Volumen während einer Beobachtungszeit. Insbesondere ist N&B eine Vereinfachung von PCH, um Informationen über die durchschnittliche Anzahl von Proteinen in oligomeren Mischungen zu erhalten. Die Intensitätsschwankungsamplituden werden durch die molekulare Helligkeit des Fluorophors und die durchschnittliche Anzahl von Fluorophoren innerhalb des Beleuchtungsvolumens beschrieben. N&B berücksichtigt daher nur den ersten und zweiten Moment der Amplitudenverteilung, nämlich die mittlere Intensität und die Varianz. Dies ist gleichzeitig die Stärke und schwächelinde Methode. Da nur zwei Momente berücksichtigt werden, kann N&B den molaren Anteil unbekannter Oligomere in einer Mischung nicht bestimmen, sondern schätzt nur den durchschnittlichen Oligomerisierungszustand der Mischung. Dennoch kann es auf relativ kleine Zeitreihen (im Vergleich zu anderen Momentmethoden) von Bildern von lebenden Zellen pixelweise angewendet werden, einfach durch die Überwachung der Zeitschwankungen der Fluoreszenzintensität. Es reduziert die effektive Zeit pro Pixel auf wenige Mikrosekunden, wodurch die Erfassung im Zeitbereich von Sekunden bis Millisekunden möglich ist, was für eine schnelle Oligomerisierungskinetik erforderlich ist. Schließlich können große Zellbereiche sowie subzelluläre Kompartimente erkundet werden.

Einleitung

Wir beschreiben einen Bildansatz der totalen inneren Reflexionfluoreszenz-Anzahl und Helligkeit (TIRF-N&B) zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von Rezeptormolekülen an der Plasmamembran lebender Zellen mit dem Ziel, die Rezeptor-Baugruppe zu verknüpfen. Dynamik zur biologischen Funktion der Proteine (Abbildung 1).

Bei extrazellulärer Ligandenbindung initiieren Rezeptoren die intrazelluläre Signaltransduktion in Abhängigkeit von ihrer Konformation, Oligomerisierung, potenziellen Co-Rezeptoren und Membranzusammensetzung. Trotz der Bedeutung und Allgegenwart der Rezeptor-Oligomerisierung, anerkannt als sc....

Protokoll

1. Probenvorbereitung

1. Tag 1. Saat-HeLa-Zellen in vollständiger Medium mit einer Konzentration von 100.000-200.000 Zelle/ml in Glasbodenschalen. Samen 6-8 replizieren Gerichte.
   HINWEIS: In diesem Beispiel wird das Medium durch 10% hitzeinaktiviertes Fetal Bovine Serum (FBS), 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/100 g Penicillin/Streptomycin ergänzt. Mehrere nachgebildete Gerichte werden zubereitet.
2. Tag 2-3. Wenn Zellen in Subkonfluenz sind, transfezieren Sie die Hälfte der Gerichte mit dem Proteinplasmid und die zweite Hälfte mit Referenzplasmiden (Monomer und Dimer), in serumfreiem Medium.
   HINWEIS: Transfektion erfolgt....

Ergebnisse

Die Ergebnisse für zwei repräsentative HeLa-mEGFP-FGFR1-Zellen, die in derselben Kulturschale gesät sind, sind in Abbildung 5 und Ergänzender Tabelle 1dargestellt. Die beiden Zellen wurden zum Zeitpunkt 0 min(Abbildung 5A, oben) und 7 min (Abbildung 5A, unten) nach Zugabe des FGF2-Ligands erfasst.

Diskussion

N&B erfordert mehrere Vorsichtsmaßnahmen bei der Wahl des Zellmodells und der Kennzeichnungsstrategie. Sie kann nur auf lebende Zellen angewendet werden, die während der Bildaufnahmezeit stabil haften bleiben. Zusätzliche Schwankungen durch die gesamte Zelle starre Verschiebung kann mit entsprechenden Bildwiederherstellungsansätzen³⁸behandelt werden. Wenn sich jedoch eine Zelle bewegt, verformt sich die Zellmembran ebenfalls, und die Strukturverformung führt zu einer erheblichen zusätzlichen Varia.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3-Farben-Fast-TIRF Leica AM TIRF MC Inverses Mikroskop mit smi-automatischer TIRF-Ausrichtung. Das Mikroskop ist ausgestattet mit einem 488-nm-Diodenlaser, einem 100x 1,46 Öl-TIRF-Objektiv, Ex/Em-Bandpassfiltern bei 490/20 und 525/50, einem Temperatur-/CO2-Inkubator und einer Andor DU 8285 VP EMCCD-Kamera. Das Mikroskop wird von der Leica LIF-Software bedient.	Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland
Albumin aus Rinderserum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM ohne Phenolrot mit 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Gebrauchtes Serum frei für die Mikroskopie
DMEM High-Glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Verwendet für das Gesamtmedium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, Frankreich	X0515-500
Emissionsspaltungssystem Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fötales Rinderserum, qualifiziert, Brasilien	GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270106	10% inaktivierte Ergänzung für das vollständige Medium
Glasboden 35 mm steril 1,5 Schalen	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0,170-14-C	unbeschichtet, Glasstärke 0,17 μm
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Humanes Zervixkarzinom (HeLa), serumfreie tierische Zellen (AC)	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Deutschland	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (rückwärtig) ANDOR-Kamera, gesteuert von der ANDOR Solis-Software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		Diese Kamera, die in einem zusätzlichen Anschluss des Mikroskops installiert ist, wird für die Erfassung des N& B Zeitreihen
Matlab Ausführbare Datei N& B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spanien		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin für Gewebekultur 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	Ergänzung für Medium bei Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1-Expressionsvektor	Einheit für gynäkologische Onkologieforschung, Europäisches Institut für Onkologie IRCCS, Mailand, Italien		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI-Expressionsvektor	Einheit für Mikroskopie und dynamische Bildgebung, CNIC, Madrid, Spanien		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI-Expressionsvektor	Einheit für Mikroskopie und dynamische Bildgebung, CNIC, Madrid, Spanien		Hellriegel et al., 2011
Rekombinantes FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligandenlösung: 20 ng/ml FGF2 in PBS, ergänzt mit 0,01 % BSA.
Natriumpyruvat GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1 mM Supplement für Medium
TransIt-LT1 Transfektionsreagenz	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot	GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	25200056
Typ F Immersionsflüssigkeit 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/ml)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0,1% Ergänzungsmittel für Medium ohne Phenolrot für Transfektionen

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