Hier stellen wir ein Protokoll zur Induzieren von okulärer Hypertonie und glaukomatischer Neurodegeneration in Mausaugen durch intracameralInjektion von Silikonöl und das Verfahren zur Silikonölentfernung aus der vorderen Kammer vor, um erhöhten Augeninnendruck Normalen.
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Methodenartikel
Ein reversibles Siliziumöl-induziertes Okularhypertonie-Modell bei Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Erhöhter Augeninnendruck (IOP) ist ein gut dokumentierter Risikofaktor für Glaukom. Hier beschreiben wir eine neuartige, effektive Methode zur konsequenten Induktion einer stabilen IOP-Erhöhung bei Mäusen, die die postoperative Komplikation der Verwendung von Silikonöl (SO) als Tamponade-Mittel in der menschlichen Glaskörperchirurgie imitiert. In diesem Protokoll wird SO in die vordere Kammer des Mausauges injiziert, um die Pupille zu blockieren und den Zustrom von wässrigem Humor zu verhindern. Die hintere Kammer akkumuliert wässrigen Humor und dies wiederum erhöht den IOP des hinteren Segments. Eine einzelne SO-Injektion erzeugt eine zuverlässige, ausreichende und stabile IOP-Erhöhung, die eine signifikante glaukomatige Neurodegeneration induziert. Dieses Modell ist eine echte Replik des sekundären Glaukoms in der Augenklinik. Um die klinische Umgebung weiter nachzuahmen, kann SO aus der vorderen Kammer entfernt werden, um den Drainageweg wieder zu öffnen und den Zufluss von wässrigem Humor zu ermöglichen, der durch das trabekuläre Netz (TM) im Winkel der vorderen Kammer entwässert wird. Da IOP schnell wieder normal ist, kann das Modell verwendet werden, um die Wirkung der Senkung des IOP auf glaukomatous retinale Ganglienzellen zu testen. Diese Methode ist einfach, erfordert keine spezielle Ausrüstung oder Wiederholungsverfahren, simuliert klinische Situationen genau und kann auf verschiedene Tierarten anwendbar sein. Es können jedoch geringfügige Änderungen erforderlich sein.
Einleitung
Der fortschreitende Verlust von Netzhautganglienzellen (RGCs) und ihren Axonen ist das Kennzeichen des Glaukoms, einer häufigen neurodegenerativen Erkrankung in der Netzhaut1. Es wird bis 2040 mehr als 100 Millionen Personen im Alter von 40 bis 80 Jahren betreffen2. Der IOP bleibt der einzige veränderbare Risikofaktor bei der Entwicklung und Progression des Glaukoms. Um die Pathogenese, Progression und mögliche Behandlungen von Glaukom zu erforschen, ist ein zuverlässiges, reproduzierbares und induzierbares experimentelles okuläres Hypertonie-/Glaukommodell, das die wichtigsten Merkmale menschlicher Patienten repliziert, unerlässlich.
IOP hängt vom wässrigen Humorzufluss in die vordere Kammer vom Ziliarkörper in der hinteren Kammer ab und fließt durch das trabekuläre Netz (TM) im Winkel der vorderen Kammer aus. Bei Erreichen eines stabilen Zustands wird der IOP beibehalten. Wenn der Zufluss den Abfluss über- oder kleiner überschreitet, steigt bzw. fällt der IOP. Durch die Verringerung des wässrigen Abflusses entweder durch Verschluss des Winkels der vorderen Kammer oder durch Beschädigung der TM, wurden mehrere Glaukommodelle eingerichtet3,4,5,6,7,8,9,10. Diese Modelle sind normalerweise mit irreversiblen Augengewebeschäden verbunden, und der hohe IOP in der vorderen Kammer verursacht auch unerwünschte Komplikationen wie Hornhautödem eimten und intraokulare Entzündungen, die die Durchführung und Interpretation von Retinal-Bildgebung und sehischer Funktion erschweren.
Um ein Modell zu entwickeln, das diese Mängel überwindet, konzentrierten wir uns auf das gut dokumentierte Sekundärglaukom, das durch Silikonöl (SO) verursacht wird und als postoperative Komplikation der menschlichen vitreoinalen Chirurgie11,12auftritt. SO wird als Tamponade in Netzhautoperationen wegen seiner hohen Oberflächenspannung verwendet. SO kann die Pupille jedoch physisch ausblenden, da sie leichter ist als die wässrigen und glasigen Flüssigkeiten, was einen wässrigen Fluss in die Vorderkammer verhindert. Die Behinderung verursacht IOP-Erhöhung in der hinteren Kammer aufgrund der wässrigen Humor Akkumulation. Dies motivierte uns, ein neuartiges okulares Hypertonie-Mausmodell zu entwickeln und zu charakterisieren, das auf intracameraler SO-Injektion und Pupillenblock13basiert, mit den wichtigsten Merkmalen des Sekundärglaukoms: effektiver Pupillenblock, signifikante IOP-Erhöhung, die nach DER SO-Entfernung wieder normal werden kann, und glaukomatus Neurodegeneration.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für SO-induzierte okuläre Hypertonie im Mausauge vor, einschließlich SO-Injektion und -Entfernung und IOP-Messung.
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Protokoll
Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stanford University genehmigt.
1. Augen-Hypertonie-Induktion durch intracamerale Injektion von SO
- Bereiten Sie eine Glas-Mikropipette für intracameral SO Injektion durch Ziehen einer Glaskapillare mit einem Pipettenzieher, um eine Mikropipette zu erzeugen. Schneiden Sie eine Öffnung an der Spitze der Mikropipette und schärfen Sie die Spitze mit einer Mikroschleifer-Abschrägungsmaschine weiter, um eine 35°-40°-Abschrägung zu machen.
- Polieren Sie die Ränder der Abschrägung und entfernen Sie alle Trümmer durch Waschen mit Wasser. Autoclavieren Sie die Mikropipette vor der Verwendung.
- Bereiten Sie die Paracentese-Nadel für den Hornhauteintrag vor. Befestigen Sie dazu eine 32 G Nadel an einer 5 ml Spritze an einem Luer-Schloss und sichern Sie sie weiter mit Klebeband. Biegen Sie die Nadelschräge nach oben bei 30°.
- Bereiten Sie den SO-Injektor vor, indem Sie zuerst eine stumpfe 18 G Nadel auf einer 10 ml Spritze befestigen und sichern. Dann befestigen Sie ein Kunststoffrohr mit der 18 G Nadel an einem Ende und füllen Sie es mit SO nach Bedarf durch das andere Ende.
- Befestigen Sie die sterilisierte Mikropipette am Kunststoffrohr und drücken Sie den Spritzenkolben, um die gesamte Mikropipette mit SO zu füllen.
2. Intracameral SO Injektion für ein Auge
- Legen Sie eine 9-10 Wochen alte männliche C57B6/J-Maus in eine Induktionskammer mit 3% Isofluran, die mit Sauerstoff bei 2 L/min für 3 min gemischt wird.
- Intraperitoneal injizieren 2,2,2-Tribromethanol bei 0,3 mg/g Körpergewicht.
HINWEIS: Im Gegensatz zu Ketamin/Xylazin verursacht 2,2,2-Tribromethanol keine offensichtliche Pupillendilatation. - Prüfen Sie, ob auf eine Zehenklemme und die fehlende Bewegung der Schnurrhaare oder des Schwanzes reagiert wird, um die Anästhesiestärke zu bestimmen.
- Platzieren Sie die Maus in einer seitlichen Position auf einer Operationsplattform. Um seine Empfindlichkeit während des Verfahrens zu reduzieren, wenden Sie vor der Injektion einen Tropfen von 0,5% Proparacainhydrochlorid auf die Hornhaut an.
- Machen Sie einen Einstiegsschnitt mit der 32 G Paracentese-Nadel am superotemporalen Quadranten, ca. 0,5 mm vom Limbus entfernt.
- Tunnel durch die Schichten der Hornhaut für ca. 0,3 mm, bevor sie in die vordere Kammer eindringt. Achten Sie darauf, die Linse oder Iris nicht zu berühren.
- Ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um etwas wässrigen Humor (ca. 1,2 L) aus der vorderen Kammer durch den Tunnel (Parazentosien) freizusetzen.
- Warten Sie 8 min, um den IOP weiter zu verringern. Dies kann durch Messung des kontralateralen Kontrollauges bestimmt werden.
- Setzen Sie die mit SO vorinstallierte Glasmikropipette durch den Hornhauttunnel in die vordere Kammer ein, wobei die Abschrägung nach unten zur Irisoberfläche zeigt.
- Drücken Sie den Spritzenkolben langsam, um SO in die vordere Kammer zu injizieren, bis das SO-Tröpfchen den größten Teil der Irisoberfläche mit einem Durchmesser von 2,3 bis 2,4 mm bedeckt.
- Lassen Sie die Mikropipette in der vorderen Kammer für 10 s mehr, bevor Sie sie langsam zurückziehen.
- Drücken Sie vorsichtig das obere Augenlid, um den Hornhautschnitt zu schließen, um SO-Leckage zu minimieren.
- Antibiotikum Salbe (Bacitracin-Neomycin-Polymyxin) auf die Augenoberfläche auftragen.
- Während des gesamten Eingriffs befeuchten Sie häufig die Hornhaut mit künstlichen Tränen.
- Halten Sie die Maus auf dem Heizkissen, bis vollständig von der Anästhesie erholt.
3. SO Entfernung
- Bereiten Sie das Bewässerungssystem vor.
- Bereiten Sie die Bewässerungslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und legen Sie sie in die Bewässerungsflasche. Elevate die Bewässerungslösungflasche auf 110 x 120 cm (81 x 88 mmHg) über der Operationsplattform.
- Befestigen Sie einen IV-Verwaltungssatz an der Bewässerungslösungsflasche. Entfernen Sie Luftblasen aus dem IV-Schlauch. Schließen Sie eine 33 G Nadel, die auf 20° gegenüber gebogen ist, bis zum IV-Schlauch an.
- Um das Entwässerungssystem vorzubereiten, entfernen Sie den Kolben aus einer 1 ml Spritze. Befestigen Sie eine 33 G Nadel an der Spritze und biegen Sie die Nadel auf 20°.
- Entfernen Sie SO aus der vorderen Kammer.
- Intraperitoneal injizieren 2,2,2-Tribromethanol (0,3 mg/g Körpergewicht). Prüfen Sie, ob die Zehenzange nicht reagiert, um die Anästhesiestärke und die bewegungsunbewegte Kraft der Schnurrhaare oder des Schwanzes zu bestimmen.
- Legen Sie die Maus auf eine Operationsplattform und befestigen Sie sie in der seitlichen Position mit Klebeband. Tragen Sie einen Tropfen 0,5% Proparacainhydrochlorid auf die Hornhaut auf, um ihre Empfindlichkeit zu reduzieren.
- Machen Sie zwei Einschnitte im zeitlichen Quadranten der Hornhaut zwischen 2 und 5 Uhr am Rand des SO-Tröpfchens mit der vorgefertigten 32 G Paracentesis-Nadel.
- Setzen Sie eine 33 G Bewässerungsnadel, die mit der Bewässerungslösung verbunden ist, durch einen Hornhautschnitt, maximale Geschwindigkeit.
- Setzen Sie eine weitere 33 G Drainagenadel an der Spritze ohne Kolben durch den anderen Hornhautschnitt befestigt, damit das SO-Tröpfchen die vordere Kammer verlassen kann, während es mit Bewässerungslösung bewässert wird.
- Ziehen Sie die Drainagenadel, dann die Bewässerungsnadel.
- Injizieren Sie eine Luftblase in die vordere Kammer, um ihre normale Tiefe zu erhalten, und drücken Sie, um den Hornhautschnitt zu schließen.
- Antibiotikum Salbe auf beide Augen auftragen.
- Halten Sie die Maus auf dem Heizrückgewinnungspad, bis vollständig aus der Anästhesie erholt.
4. IOP-Messung einmal pro Woche
- Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer, die mit 3% Isofluran, gemischt mit Sauerstoff, bei 2L/min für 3 min durchsetzt ist.
- Intraperitoneal injizieren Xylazin und Ketamin (0,01 mg Xylazin/g, 0,08 mg Ketamin/g).
- Halten Sie die Hornhaut feucht, indem Sie künstliche Tränen während des gesamten Verfahrens anwenden.
- Warten Sie ca. 15 min, damit sich der Schüler vollständig vermehren kann.
- Messen Sie den IOP beider Augen mit einem Tonometer gemäß produktanweisungen. Bringen Sie das Tonometer in die Nähe des Mausauges. Halten Sie den Abstand von der Spitze der Sonde zur Maushornhaut bei ca. 3 x 4 mm. Drücken Sie die Messtaste 6x, um einen Messwert zu erzeugen. Von jedem Auge werden drei maschinengenerierte Messwerte erhalten, um den mittleren IOP zu erhalten.
- Opfern Sie die Tiere nach 8 Wochen nach der SO-Injektion und führen Sie die Immunhistochemie der gesamten Netzhaut, RGC-Zählung, Sehnerv (ON) halbdünnen Abschnitte und Quantifizierung der überlebenden Axone, die vor13beschrieben wurden.
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Ergebnisse
Bald nach der Injektion können wir leicht Mäuse identifizieren, die keine stabile okuläre Hypertonie erzeugen, weil die SO-Tröpfchen zu klein sind (ca. 1,5 mm)13. Diese Tiere sind von späteren Versuchen ausgeschlossen. Nach den Injektionsverfahren erhalten mehr als 80 % der SO-injizierten Mäuse Tröpfchen, die größer als 1,6 mm sind. Wir haben den IOP dieser Mausaugen einmal pro Woche für 8 Wochen nach einer einzigen SO-Injektion gemessen. Der IoD des Auges, das SO erhielt, blieb hoch, im Allgemein...
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Diskussion
Hier zeigen wir ein einfaches, aber effektives Verfahren zur Induktion einer anhaltenden IOP-Erhöhung im Mausauge durch intracameral Injektion von SO. Dieses Verfahren kann schnell von jedem erlernt werden, der Erfahrung mit Mikrodissektion unter dem Mikroskop hat. Das primäre potenzielle Ausfallrisiko ist das Auslaufen von SO aus dem Hornhautschnitt. Einer der Vorteile der Verwendung von SO ist jedoch, dass wir, da das Öltröpfchen sichtbar und messbar ist, Leicht Mäuse identifizieren können, die Tröpfchen zu klein erhie...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wird durch die NIH-Zuschüsse EY024932, EY023295 und EY028106 an YH unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,5% Proparacainhydrochlorid | Akorn, Somerset | ||
| 10mL Syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G Nadel | BD | mit normaler Abschrägung, Nadellänge:25,4 mm | |
| 2,2,2-Tribromethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Nadel-32G 4mm |
| 33G Ophalmologie-Nadel | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL Syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (Xylazin) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| künstliche Tränen | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Spüllösung | Alcon Laboratories | ||
| Zweistufiger Glas-Mikropipettenabzieher | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ System | ||
| Isofluran | VetOne | 502017 | Isofluran, USP, 250ml/Flasche |
| IV Verabreichungssets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINHYDROCHLORID INJEKTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| Microgrind-Anfasmaschine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniatur-EVA-Schlauch | McMaster-Carr | 1883T4 | 0,05" ID, 0,09" AD, 10 ft. Länge |
| Silikonöl (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1.000 mPa.s |
| Standard-Glaskapillaren | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100 mm) OD 1,5 mm ID 0,84 mm |
| TonoLab Tonometer | Colonial Medical Supply, Finnland | ||
| Veterinär-Antibiotika-Salbe | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP Augensalbe, Vetropolycin |
Referenzen
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