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Methodenartikel

In Vitro Einrichtung einer gentechnisch veränderten Murine Kopf- und Halskrebszelllinie mit einem Adeno-assoziierten Virus-Cas9-System

7.6K Ansichten

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DOI:

10.3791/60410

⸱

9. Januar 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology and Genetics, Ben-Gurion University of the Negev, 2Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 3Human Oncology & Pathogenesis Program (HOPP), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Institute of Pathology, Barzilai University Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Für das Verständnis von Neoplasie ist die Entwicklung von murinen Modellen mit spezifischen Genen erforderlich, die bei Kopf- und Nackenkrebspatienten mutiert sind. Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vitro-Transformation von primären murinen Zungenzellen unter Verwendung eines adeno-assoziierten Virus-Cas9-Systems vor, um murine HNC-Zelllinien mit spezifischen genomischen Veränderungen zu erzeugen.

Zusammenfassung

Die Verwendung von primären normalen Epithelzellen ermöglicht es, genomische Veränderungen, die für die zelluläre Transformation erforderlich sind, reproduzierbar zu induzieren, indem spezifische Mutationen in Onkogene und Tumorsuppressor-Gene eingeführt werden, indem clustered regulatory interspaced kurze palindromische Wiederholung (CRISPR)-basierte Genom-Editing-Technologie bei Mäusen. Diese Technologie ermöglicht es uns, die genetischen Veränderungen, die bei menschlichen Krebserkrankungen auftreten, mit Mäusen genau nachzuahmen. Durch die genetische Umwandlung muriner Primärzellen können wir die Entwicklung von Krebs, progression, Behandlung und Diagnose besser untersuchen. In dieser Studie verwendeten wir creinduzible Cas9-Maus-Zungenepithelzellen, um die Genombearbeitung mit Adeno-assoziiertem Virus (AAV) in vitro zu ermöglichen. Insbesondere durch veränderung von KRAS, p53 und APC in normalen Zungenepithelzellen, erzeugten wir eine murine Kopf- und Halskrebs-Zelllinie (HNC) in vitro, die bei syngenischen Mäusen tumoriogen ist. Die hier vorgestellte Methode beschreibt detailliert, wie MAN HNC-Zelllinien mit spezifischen genomischen Veränderungen erzeugt und erklärt ihre Eignung zur Vorhersage der Tumorprogression bei syngenischen Mäusen. Wir stellen uns vor, dass diese vielversprechende Methode informativ und nützlich sein wird, um Tumorbiologie und Therapie von HNC zu studieren.

Einleitung

HNC ist eine häufige Bösartigkeit weltweit1. Die Modellierung der Entstehung der HNC Neoplasie befindet sich derzeit an einem wissenschaftlichen Wendepunkt2. Während viele genetische Mutationen in HNC2,3,4 (z. B. TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 und RAS) identifiziert wurden, bleiben die spezifischen Kombinationen genomischer Veränderungen, die zusammen erforderlich sind, um HNC zu induzieren, unklar.

Die aktuelle Verwendung menschlicher HNC-Zelllinien hat wesentlich dazu beigetragen, die Mechanismen im Zusammenhang mit Pathogenese und Behandlung zu klären3. Die Untersuchung menschlicher Zelllinien in immungeschwächten murinen Systemen hat jedoch ihre Grenzen, da diese Systeme den in vivo neoplastischen Prozess, die Rolle spezifischer Genmutationen und Behandlungsreaktionen in einer Immunmikroumgebung nicht behandeln. Daher ist die Entwicklung und Etablierung von murinen Zelllinien mit spezifischen genetischen Veränderungen von vorrangiger Bedeutung, um zu untersuchen, wie verschiedene Gene zum Transformationsprozess beitragen, und um neuartige molekülbasierte Therapien an immunkompetenten Mäusen zu testen.

Genfunktionsstudien in der biomedizinischen Forschung wurden durch Fortschritte in der DNA-Editing-Technologien erheblich beeinflusst, indem beispielsweise Doppelstrangbrüche (DSBs) eingeführt wurden, zum Beispiel5. Diese Technologien, einschließlich der Verwendung von Zinkfingernukleasen, Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektornukleasen und gruppierten regulatorischen interspaceierten kurzen palindromischen Wiederholungen (CRISPR/Cas9), ermöglichen die Manipulation jedes Gens, das an seinem Ort von Interesse ist. Die neuesten CRISPR/Cas9-Systeme bestehen aus einer Guide-RNA (gRNA), die die Cas9-Nuklease anweist, um ein DSB an einem bestimmten Standort im Genom zu erzeugen. Dieses System hat eine umfassende Anerkennung bei der Modifizieren endogener Gene in jeder Zelle oder Zielgewebe gewonnen, selbst in den traditionell schwer zu behandelnden Organismen5. Es hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Systemen aufgrund seiner Einfachheit, Geschwindigkeit und Effizienz.

In der Onkologie hat die CRISPR/CAS9-Technologie die Notwendigkeit erfüllt, Krebszellen effektiv zu imitieren. Um dieses System im HNC zu etablieren, haben wir das potente KRAS-Onkogen und zwei wichtige Tumorsuppressorgene, APC und p536,manipuliert. Laut der GENIE-Datenbank7ist diese Kombination im HNC selten. RAS-Mutationen (HRAS, NRAS und KRAS) sind nur in 7 % aller HNC-Populationen vorhanden. Diese Tumoren neigen dazu, resistent gegen Therapie8,9.

Die Lieferung von Cas9 und seiner gRNA erfolgt durch virale Transduktion mit AAVs oder Lentiviren. Rekombinantes AAV ist oft die bevorzugte Methode zur Bereitstellung von Genen an Zielzellen aufgrund seiner hohen Titer, milde Immunantwort, Fähigkeit, eine breite Palette von Zellen zu transduzieren, und allgemeine Sicherheit. Mit Hilfe eines AAV-Systems wurden verschiedene gewebespezifische Mauszelllinien generiert, und neue Zelllinien werden noch entwickelt10,11,12. Es muss jedoch noch ein effizientes genomisches Bearbeitungssystem entwickelt werden, das murine HNC-Zelllinienmodelle erzeugen kann. In dieser Studie versuchten wir, ein in vitro AAV-Cas9-basiertes System zur Umwandlung von primären murinen Zungenzellen in einen tumorgenen Zustand zu entwickeln. Dieses einzigartige CRISPR/Cas9-Transformationsprotokoll und die etablierte Tumorzelllinie können verwendet werden, um die Biologie von HNC, die durch eine Vielzahl von genomischen Veränderungen induziert wird, besser zu verstehen.

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Protokoll

Diese Studie wurde von der Ben Gurion University of the Negev Animal Care and Use Committee genehmigt. Tierversuche wurden von der IACUC genehmigt (IL.80-12-2015 und IL.29-05-2018(E)). Alle Aspekte von Tierversuchen, -unterkünften und Umweltbedingungen, die in dieser Studie verwendet wurden, entsprachen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren13.

1. Adeno-assoziierte Virusproduktion

  1. Tag 1: Zellkultur
    1. Samen 4 x 106 HEK293T Zellen pro 14,5 cm Platte in 15 ml DMEM. Bereiten Sie 10 Platten für die Transfektion mit Polyethylenimin (PEI) (1 g/ l) vor.
  2. Tag 2: Transfektion von HEK293T-Zellen mit PEI
    1. Entfernen Sie die Medien und speisen Sie mit warmem DMEM 1 h vor der Transfektion.
    2. Vorwarme Transfektionsreagenzien und DMEM.
    3. Verwenden Sie 10 g des von Interesse sindden Plasmids, das AAV ITR enthält (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 g des AAV 2/9n Capsid-Plasmids (mit dem Rep-Gen von AAV2 und dem Cap-Gen von AAV9 und 10 g des Helferplasmids (pAdDelta F5-Helfer) pro Platte (siehe Tabelle).
      HINWEIS: Eine neue Generation von Helfer-Plasmid - pAdDeltaF614,15,16, die auch für die AAV-Produktion verwendet werden kann, ist verfügbar.
    4. Mischen Sie die Plasmide in 1 ml reines DMEM pro Platte. Dann fügen Sie 90 l Polyethylenimin (Gesamtplasmid: PEI-Konzentration = 1:3) kurz in die Plasmidmischung und Wirbel.
    5. Inkubieren Sie den PEI-Plasmid-DNA-Mix 20 min bei Raumtemperatur (RT).
    6. Fügen Sie die Mischung tropfenweise auf die HEK293T-Zellen und übertragen Sie die Platten auf den Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h.
  3. Tag 3: Mittlerer Wandel nach Transfektion
    1. Entfernen Sie das Medium vollständig und fügen Sie 15 ml frisches DMEM hinzu.
  4. Tag 5: Das Virus ernten
    1. Bereiten Sie ein Trockeneis/Ethanol-Bad vor.
    2. Sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber und übertragen Sie sie in 50 ml-Rohre (2 Platten pro 50 ml Rohr).
    3. Spin Rohre bei 800 x g für 15 min bei Raumtemperatur.
    4. Entsorgen Sie den Überstand aus allen Rohren. 0,5 ml des Lysepuffers (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) pro Platte (d.h. 5 ml für 10 Platten) nur in das erste Rohr geben. Setzen Sie die Zellen wieder auf, und übertragen Sie das Gesamtvolumen auf die nächste Röhre, und fahren Sie bis zur letzten Röhre fort.
    5. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein frisches 50 ml-Rohr. Waschen Sie die Rohre mit dem gleichen Volumen des Lysepuffers (0,5 ml pro Platte) nach dem gleichen Übertragungsverfahren wie in Schritt 1.4.4 beschrieben.
    6. Unterziehen Sie die Zellsuspension drei Runden von 10 min Gefrier-/Tauzyklen zwischen einem Trockeneis/Ethanol-Bad und einem 37 °C-Wasserbad. Wirbel kurz nach jedem Auftauen.
    7. Wenn die Reinigung am selben Tag durchgeführt wird, stellen Sie den Ausgleichs- und Elutionspuffer (siehe Tabelle 1 für das Rezept) auf RT fest.
    8. 50 Einheiten Benzonase pro Platte hinzufügen und bei 37 °C für 1,5 h brüten.
      HINWEIS: Benzonase wird verwendet, um Restnukleinsäuren aus den Wirtszellen und die Plasmid-DNA in der Zellsuspension zu verdauen.
    9. Drehen Sie die Rohre bei 3.000 x g für 15 min bei 4 °C.
    10. Sammeln Sie den Überstand in einer Spritze mit einer 18 G Stahlnadel und drücken Sie die Lösung durch einen 0,45 m Filter in ein 15 ml Rohr, um das rohe Lysat zu erhalten.
    11. Das Rohlysat einige Wochen bei 4 °C lagern, bis die Reinigung oder die weitere Reinigung andauert.

2. AAV-Reinigung

  1. Tag 5 oder später
    1. Platzieren Sie den Gleichgewichts- und Elutionspuffer bei RT.
    2. Waschen Sie Chromatographiesäulen mit 10 ml des Ausgleichspuffers.
    3. 0,5 ml pro Platte Heparin-Agarose in die Spalte17 geben und dann den Ausgleichspuffer (4x das Volumen der Heparin-Agarose) hinzufügen. Mischen Sie die Lösungen, indem Sie die Säule invertieren und lassen Sie die Agarose Sediment.
    4. Elute den Ausgleichspuffer aus der Spalte durch Schwerkraft.
      HINWEIS: Lassen Sie einen Gleichgewichtspuffer, um das Austrocknen der Agarose zu verhindern.
    5. Das rohe Lysat auf die Säule laden und bei 4 °C bei konstanter Rührung 2 h brüten. Bringen Sie die Säule in eine aufrechte Position und lassen Sie die Agarose sedimentieren.
    6. Elute das grobe Lysat durch die Schwerkraft.
    7. Waschen Sie die Säule mit Ausgleichspuffer (4x das Volumen der Heparin-Agarose).
    8. Legen Sie einen 100 kDa Zentrifugalproteinfilter unter die Säule und löschen Sie das Virus mit einem Elutionspuffer (3x des Volumens der Heparin-Agarose) in den Filter.
      HINWEIS: Der Elutionspuffer sollte 15 ml nicht überschreiten.
    9. Zentrifugieren Sie den Filter bei 3.000 x g für 30 min, bis weniger als 1 ml im Filter verbleibt.
    10. Füllen Sie den Filter mit PBS und Zentrifuge bei 3.000 x g für 30 min, bis weniger als 1 ml im Filter verbleibt. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um alle Salze zu entfernen.
    11. Konzentrieren Sie die Viruslösung im Filter durch Zentrifugierung auf 3.000 x g, um ein möglichst geringes Volumen (weniger als 200 l) zu erreichen.
    12. Saugen Sie die Viruslösung mit einer Nadel und Spritze und drücken Sie die Lösung durch einen 0,22 m Filter in ein Rohr.
    13. Machen Sie Aliquots von konzentrierten virusischen Partikeln für die Lagerung.
      ANMERKUNG: Die Aliquots sollten bei kurzfristiger Lagerung bei 4 °C 20 l und bei Langzeitlagerung bei -80 °C bei Langzeitspeicherung 20 L betragen.
    14. Bestimmen Sie die virale Titer- und virale Transduktionseffizienz, wie zuvor beschrieben14,18,19,20.

3. Isolation und Kultur von Primärzellen

  1. Tag 1
    1. Euthanisieren Sie ein 6 Wochen altes männliches oder weibliches B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J durchCO2-Erstickung oder ein anderes IACUC-zugelassenes Protokoll.
      HINWEIS: Diese CRISPR/Cas9-Knockin-Mäuse haben eine crerekombindienabhängige Expression von cas9-Endonuklease und EGFP, die von einem CAG-Promotor geleitet werden. Die vorgelagerte Lox-Stop-Lox (LSL) Sequenz, die im Genom dieser Mäuse vorhanden ist, verhindert die Expression von Cas9 und EGFP in Abwesenheit von Cre Recombinase. In Kombination mit Single Guide RNAs (sgRNAs) und einer Cre-Quelle ermöglichen sie die Bearbeitung von Einzel- oder Mehreren Mausgenen in vivo oder ex vivo14.
    2. Sezieren Sie die Zunge von den eingeschläferten Mäusen mit einer chirurgischen Schere.
    3. Trennen Sie das Gewebe manuell, indem Sie das Zungengewebe mit einem Skalpell in sehr kleine Fragmente zerkleinern. Sammeln Sie die Gewebefragmente in einem 15 ml-Röhrchen, das 4,5 ml RPMI-Normalmedium (mit Ausserum) enthält.
    4. Fügen Sie den dreifachen Enzymmix (200 l) (siehe Tabelle 1 für das Rezept) zu den Gewebefragmenten hinzu.
    5. Inkubieren Sie den Gewebe-Enzym-Mix bei 37 °C für 30 min und tippen Sie alle 10 min auf die Röhre, um die enzymatische Dissoziation des Gewebes zu verbessern.
    6. Fügen Sie 5% fetales Rinderserum (FBS) mit HBSS/PBS in den Gewebe-Enzym-Mix ein, um die Enzymwirkung zu stoppen.
    7. Filtern Sie die obige Zellsuspension durch ein steriles 70-m-Nylongewebe, um die dispergierten Zellen und größere Gewebefragmente zu trennen.
    8. Waschen Sie die gefilterte Zellsuspension durch Zentrifugation für 300 x g für 5 min in HBSS/PBS bei RT.
    9. Das Pellet im Kulturmedium (10% FBS in RPMI/DMEM) wieder aufhängen und in 60 mm Kulturgerichten wachsen, bis sich verschiedene Zellkolonien bilden.
      1. Kulturzellaggregate, die auf dem Filter in einer 60-mm-Kulturschale aufbewahrt werden, die 3 ml vollständige Medien (10% FBS in RPMI/DMEM) enthält, bis Zellkolonien gebildet werden.
    10. Mikroskopisch untersuchen Sie die Primärzellen auf das Vorhandensein von Fibroblastenkontamination nach 1 Woche Kultur. Behandeln Sie die aus Aggregaten und Zellsuspensionen entwickelten Primärzellen mit 0,25 Trypsin 0,02% EDTA-Lösung bei 37 °C für 1 min, um Fibroblasten zu entfernen.
      HINWEIS: Normalerweise erzeugt die Primärkultur aus Zellaggregaten mehr Kolonien als Einzelzellsuspensionen. Die Zellen aus diesen Kolonien sorgen für eine bessere Transduktionseffizienz mit AAV-Transduktion.

4. AAV-Transduktion von Primärzellen

  1. Tag 10
    1. Samen 2 x 105 Primärzellen pro Brunnen in 6 Brunnenplatten in 2 ml Gesamtmedien (10% FBS in RPMI/DMEM).
    2. Am nächsten Tag die Zellen mit 1012 viralen Genomen/ml (1010 Transducing Units/mL) zu transduzieren und die Zellen in viralen partikelhaltigen Medien für 48 h bei 37 °C zu inkubieren.
    3. Entfernen Sie die viralen partikelhaltigen Medien und füttern Sie die AAV-transduced Zellen mit vollständigen Medien.
      HINWEIS: Nur Zellen, die einer Transduktion unterzogen wurden, drücken GFP aus und beginnen sich zu vermehren. Zellen, die sich keiner Transduktion unterzogen haben, werden schließlich innerhalb von 2 Wochen sterben.
    4. Nach 2 Wochen Kulturerweiterung säen Sie die Zellen für die Validierung und die in vivo tumorigenen Experimente.
      HINWEIS: Genomische DNA aus AAV-transduzierten Zellen und normale Primärzellen von Cas9-Mäusen wurden extrahiert, um die spezifische Genombearbeitung mithilfe von Standardprotokollen zu validieren. Die Sequenzierung der extrahierten DNA und die Analyse der sequenzierten Daten (Tabelle 2) wurden mit einem hybridisierungserfassungsbasierten Sequenzierungstest der nächsten Generation (z. B. MSK-IMPACT-Plattform) durchgeführt, wie zuvorbeschrieben 21.

5. Validierung der Umwandlung normaler Zellen in tumorgene Zellen mittels Immunfluoreszenz und westlicher Blotting

  1. Immunofluoreszenz
    1. Samen 2 x 105 Zellen auf 12 mm Glasabdeckungen und legen Sie sie über Nacht in einen Inkubator.
    2. Fixzellen in 4% Paraformaldehyd in PBS (pH = 7.4) und Verfahren zur Immunfluoreszenzkennzeichnung.
    3. Inkubieren Sie die festen Zellen mit dem ersten primären Antikörper in 1% BSA oder 1% Serum in PBST in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C. Die primären Antikörper sind die monoklonalen Anti-KRT 14-Kaninchen-, monoklonalen Anti-E-Cadherin-Antikörper und Cas9-Maus mAb.
    4. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung aus den Abdeckungen, indem Sie die Zellen 3x für 5 min mit 1x PBS waschen.
    5. Inkubieren Sie die Zellen mit Cy3 Esel Anti-Kaninchen IgG und/oder Cy3 Ziege Anti-Maus-IgG sekundäre Antikörper in 5% BSA in PBST für 1 h bei RT im Dunkeln.
    6. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung aus den Abdeckungen und waschen Sie die Zellen wie in Schritt 5.1.4 beschrieben 3x.
    7. Montieren Sie die Abdeckungen mit einem Tropfen Montagemedium, das DAPI (DAPI Fluoromount) enthält.
    8. Im Dunkeln bei 4 °C lagern, bis die Dias mit der Fluoreszenzmikroskopie abgebildet sind.
  2. Western Blotting
    1. Samen 1 x 106 transformierte Zellen in einer 100 mm Kulturschale und legen Sie sie über Nacht in einen Inkubator.
    2. Waschen und kratzen Sie die umgewandelten Zellen in 200 l eiskalte PBS.
    3. Zentrifugieren Sie das Rohr, das die Zellsuspension für 10 min bei 2.000 x g bei 4 °C enthält, um die Zellen zu pellet.
    4. Aspirieren Sie den Überstand und lysieren Sie die Zellen mit Lysepuffer (siehe Tabelle 1), der Phosphatase-Inhibitor-Cocktails und einen Protease-Inhibitor für 10 min bei 4 °C enthält. Zentrifugieren Sie die Lysate 10 min bei 10.000 x g und 4 °C und sammeln Sie die gereinigten Lysate.
    5. Verwenden Sie ein handelsübliches Bradford-Assay-Kit, um die Proteinkonzentration nach dem Herstellerprotokoll zu bestimmen. Verwenden Sie 4x Probenpuffer (500 mM Tris pH = 6,8, 40% Glycerin, 8% SDS, 20%H2O, 0,02% Bromphenolblau), um die Proteinproben auf 0,5 oder 1 g/l einzustellen. Bei 96 °C für 5 min kochen.
      HINWEIS: Die Proben können bei -80 °C oder bis zur Durchgeführt einer Western Blot Analyse gelagert werden.
    6. Separate gleiche Mengen des Gesamtlysats (30 g) durch 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Stellen Sie sicher, dass der Farbstoff den Boden des Gels erreicht. Übertragen Sie das Protein 30 min durch halbtrockenes Blotting bei 25 V auf die Nylonmembran.
    7. Gießen Sie 5% BSA in Tris-gepufferter Kochsaline (TBS)-0,1% Tween (TBST) über die Membran, um sie vollständig zu bedecken. Blockieren Sie die Membran für 1 h bei RT. Inkubieren Sie das Mebranmit mit primären Antikörpern (Anti-Cre, Anti-Cas9, Anti-GFP, Anti-Catenin, Anti-p53, Anti-Phospho-ERK und Anti-A-Actin in 5% BSA TBST) bei 4 °C über Nacht verdünnt.
    8. Waschen Sie die Membranen nach der Inkubation 10 min mit 1x TBST, um sicherzustellen, dass die Lösung die Membran vollständig abdeckt. Führen Sie diese Wäsche 3x, und fügen Sie dann Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörper (verdünnt 1:10,000 in 5% BSA TBST) in die Membran. 1 h bei RT inkubieren.
    9. Waschen Sie die Membranen nach der Inkubation 10 min mit 1x TBST, um sicherzustellen, dass die Lösung die Membran vollständig abdeckt. Führen Sie die Chemilumineszenz-Bildgebung (siehe Tabelle der Materialien) durch, um die Bänder verfügbar zu machen und Bilder entsprechend zu erfassen.
  3. Validierung des tumorgenen Potenzials transformierter Zellen in immunkompetenten Mäusen
    HINWEIS: Mäuse wurden gemäß den institutionellen Richtlinien der Ben-Gurion-Universität des Negev gepflegt und behandelt. Nicken. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) und C57BL/6-Mäuse wurden für die In-vivo-Studien verwendet. Mäuse wurden in luftgefilterten laminaren Strömungsschränken mit einem 12-stündigen Licht-Dunkel-Zyklus untergebracht und mit Nahrungsmitteln und Wasser ad libitum gefüttert.
    1. Verwenden Sie 6-8 Wochen alte hündin NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) und C57BL/6-Mäuse für die Studie.
    2. Trypsinize die AAV-Cas9 transformierten Zellen. Stoppen Sie die Trypsinisierung mit DMEM vorgewärmt bei 37 °C und sammeln Sie in einem 50 ml Rohr.
    3. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 800 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in DMEM-Medium ohne FBS wieder auf. Führen Sie die Zentrifugation erneut durch und setzen Sie das Zellpellet in 1x PBS wieder auf.
      HINWEIS: Bewahren Sie die Zellen nicht zu lange in 1x PBS auf. Halten Sie die Zellsuspension immer auf Eis, um Zellverklumpung zu verhindern.
    4. Verwenden Sie einen automatischen Zellzähler, um die Zellen zu zählen und die Zellen mit 1x PBS auf die gewünschte Konzentration (2,5 x 107 Zellen/ml) zu verdünnen. Generieren Sie Tumore durch eine subkutane Injektion der AAV-Cas9 transformierten Zellsuspension in der rechten Flanke jedes NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) Maus (2 x 106 Zellen/Maus). Um ein orthotropes Modell bei syngenischen Mäusen zu erzeugen, injizieren Sie 0,5 x 106 Primärzellen oder die AAV-Cas9-transformierten Zellen in die Zunge von C57BL/6 immunkompetenten Mäusen.
    5. Euthanisieren Sie die Tiere 2 Wochen nach der Injektion durch CO2-Erstickung, und sezieren Sie die Tumoren von den eingeschläferten Mäusen für die Immunhistochemie-Analyse.

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Ergebnisse

Verwenden des AAV-Systems zum Transformieren normaler Cas9-Zellen
Abbildung 1 enthält eine detaillierte Vektorkarte des in dieser Studie verwendeten Transgenplasmids AAV. Abbildung 2 zeigt das Design und die Funktionsweise des AAV-Cas9-basierten Systems. Um virale Partikel zu produzieren, wurden die HEK293T-Zellen mit dem AAV-Transgenvektor und anderen viralen Verpackungsvektoren mit der PEI-Transfektionsmetho...

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Diskussion

Mehrere Methoden wurden zuvor verwendet, um primäre Zellen in Kultur mit variablen Erfolgsgraden25,26,27,28zu transformieren. Die meisten dieser Methoden verwenden Maus-Fibroblastenzellen für die Transformation14,17,18,19 oder verwenden Karzinogene wie 4-Nitrochinolin...

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Offenlegungen

M.S. ist Mitglied des Beirats des Bioscience Institute, und Menarini Ricerche hat Forschungsgelder von Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics und Menarini Ricerche erhalten. M.S. ist auch Mitbegründer von Medendi Medical Travel und wurde in den letzten 2 Jahren von Menarini Ricerche und ADC Pharma geehrt. Alle anderen Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Dr. Daniel Gitler für die Bereitstellung des pAd Delta 5 Helper Plasmids. Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (to ME), der United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (an ME und MS), der Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (to ME), der Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (to ME) und der Foundation Concern (#7895) (ME) (ME) (an ME) finanziert. Stipendium: das Alon-Stipendium für ME- und BGU Kreitman-Stipendien an SJ und MP.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Antibodies
Anti Maus HRPJackson ImmunoResearch115-035-146
Anti Kaninchen HRPJackson ImmunoResearch711-035-152
Cas9 Maus mAbCell Signaling Technology14697
CreBioLegend900901
Cy3-AffiniPure Ziege Anti-MausIgG Jackson ImmunoResearch115-165-062
Cy-AffiniPure Ziege Anti-KaninchenIgG Jackson ImmunoResearch111-165-144
GFPSanta Cruz Biotechnologiesc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)Zellsignaltechnologie4370
Kaninchen monoklonales Anti-E CadherinZellsignaltechnologie3195S
Kaninchen monoklonales Anti-KRT 14AbcamAB-ab181595
β AktinMP Biomedicals691001
β CateninCell Signaling Technology9582S
Cell lines
HEK93T ATCCCRL-3216
Nährmedien, Chemikalien und Reagenzien
Bradford ReagenzBio-Rad30015484
BSAAmresco0332-TAM-50G
DAPI FluoromountSouthern Biotech0100-20
DMEMBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.01-055-1A
ECL (Westar Supernova und Westar Nova 2.0)CyanagenXLS3.0100 und XLS071.0250
FBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.04-127-1A
HBSSSigmaH6648
Heparin - AgaroseSigmaH6508
Isolat II Genomic DNA KitBiolineBIO-52066
MgCl2Panreac AppliChem300283
NaClBio Lab Ltd1903059100
PBSBiological Industries Israel Beit-Haemek GmbH02-023-1A
PEIPolysciences23966-1
Stift-Streptokokken-LösungBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-031-1B
PFASanta Cruz Biotechnologie30525-89-4
Phosphatase-Inhibitor-CocktailBiotoolB15001A/B
Protease-Inhibitor-CocktailMilliporeSigmaP2714-1BTL
Tris-PufferMERCK Millipore648311-1KG
strong>Enzyme
BenzonaseSigmaE1014
Kollagenase IVThermo Fisher Scientific17104019
DNAseThermo Fisher Scientific18047019
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3506
TrypsinBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-050-1B
Glaswaren
AbdeckgläserBar NaorBNCB00130RA1
SlidesBar NaorBN9308C
Mouse strains
C57BL/6Envigo
B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/JJackson Labs24857
NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)Envigo
Plasmides
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDRBroad Institute of MITFreundliches Geschenk von Dr. Randall J Platt und Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT und Harvard, Cambridge, MA 02142, USA
AAV 2/9 KapsidvektorAddgene112865
pAD Delta F5-HelferBen-Gurion-Universität des NegevZur Verfügung gestellt von Dr. Daniel Gitler, Abteilung für Physiologie und Zellbiologie, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, und Zlotowski-Zentrum für Neurowissenschaften, Ben-Gurion-Universität des Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.
Plastic wares
Amicon-ULTRA Filter 100 KDaMilliporeUFC910024
0,22 µ m Sterilfilter, 4 mmMillexSLGV004SL
0,45 µ m Sterilfilter, 13 mmMillexSLHV013SL
KulturplattenGreiner Bio-One
Falcon RöhrchenGreiner Bio-One
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Referenzen

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