Nachweis der gemeinsamen Blutversorgung bei parabiotischen Mäusen durch Kaudalenvene Glucose Injection

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die erfolgreiche Etablierung der gemeinsamen Durchblutung von zwei Parabionten durch eine kaudale Veneninjektion von Glukose zu erkennen, die minimale Schäden verursacht und für die Parabionten nicht tödlich ist.

Zusammenfassung

Parabiose ist eine experimentelle Methode zur chirurgischen Kombination von zwei parallelen Tieren entlang der Längsachse des Körpers. Wir präsentieren ein Protokoll zum Nachweis der erfolgreichen Etablierung von Blutchimäremismus in Parabionten durch eine kaudale Veneninjektion von Glukose. Parabiotische Mäuse wurden konstruiert. Glukose wurde der Spendermaus durch die Schwanzvene injiziert, und die Fluktuation des Blutzuckerspiegels wurde bei beiden Mäusen mit einem Blutglukometer zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Blutzuckerspiegel bei Spendermäusen nach 1 min stark angestiegen ist und danach langsam abnahm. In der Zwischenzeit erreichte der Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse 15 min nach der Injektion. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Evans blue erzielt, der als Positivkontrolle für Glukose verwendet wird. Die synchrone Fluktuation des Blutzuckerspiegels zeigt an, dass der Blutfluss zwischen den beiden Mäusen erfolgreich nachgewiesen wurde.

Einleitung

Parabiose ist eine Modellierungsmethode, bei der zwei lebende Organismen chirurgisch miteinander verbunden sind und sich als ein einziges physiologisches System mit einem gemeinsamen Kreislaufsystem entwickeln¹. Solche Modelle wurden häufig für das Studium der Physiologie verwendet, da der Vorteil besteht, dass die von einem einzelnen Individuum produzierten Substanzen über das gemeinsame Kreislaufsystem gleichzeitig auf beide Tiere wirken können. Seit Mitte des 18. Jahres, als parabiotische Experimente von Paul Bert²entwickelt wurden, sind die Methoden zur Konstruktion parabiotischer Modelle standardisiert. Es fehlt jedoch eine einfache und bequeme Methode, um die erfolgreiche Etablierung des Blutchimertums zu überprüfen. Es wurde berichtet, dass die Kreuzzirkulation erfolgreich durch intraperitoneally Injektion 0,5% Evans blauer Farbstoff in einem der Parabionten gefolgt von der Messung der Absorption von Evans blau im Blut der beiden Parabionten mit einem Mikroplattenleser³. Eine andere Methode erfordert eine bestimmte Mausrasse, die CD45.1⁺- und CD45.2⁺- markierte Monozyten in jedem Parabiont enthält. Die Zellzytometrie wird dann verwendet, um den Blutchimärerum zu bestimmen, indem die Häufigkeit der beiden Marker in Monozyten aus Milz oder Blut gemessen wird⁴. Jedoch, Diese Methoden sind oft tödlich oder umständlich für die Tiere, und eine sichere und einfache Methode für eine schnelle und zuverlässige Überprüfung von parabiotischen Modellen ist sehr wünschenswert. In dieser Studie haben wir eine neue Methode zu diesem Zweck etabliert, die in einem Mausmodell der Parabiose validiert wurde. Die Glukosekonzentration in Blutproben aus einer Schwanzvene wird mit einem Glukometer gemessen, und das Muster der Veränderungen des Glukosespiegels bei Spender- und Empfängermäusen gilt als Hinweis auf Zirkulationschimäre. Wir nannten diese Methode die "Glucose-Schwankungsmethode". Die Anwendung dieser Validierungsmethode ist nicht auf Mäuse beschränkt, sondern könnte auf verschiedene pathologische Modelle mit Ausnahme von Modellen mit schwerer Dysregulation des Glukosestoffwechsels ausgedehnt werden. Das Verfahren ist einfach, zeitsparend und sicher.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiere und ihre Pflege beteiligt waren, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Harbin Medical University genehmigt.

ANMERKUNG: Die für die Methode erforderlichen Werkzeuge und Ausrüstungen sind in der Materialtabelleaufgeführt.

1. Herstellung von Materialien und Tieren

1. Bestellen Sie C57BL/6 männliche Mäuse mit einem Gewicht zwischen 20 g-25 g bei einem Standard-Labortierlieferanten.
2. Die Mäuse in einem Zyklus von 12 h Licht: 12 h Dunkelheit bei 24 bis 26 °C mit ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung.

2. Parabiose

1. Anästhetisieren Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 20 g/L 2,2,2-Tribromoethanol in einer Konzentration von 0,1 ml/10 g. Bestätigen Sie die richtige Anästhesisierung, wie durch Muskelentspannung, langsame und stetige Atmung, Verlust des Hautstimulationsreflexes und Das Verschwinden des Hornhautreflexes angezeigt wird.
2. Ophthalmologische Salbe mit einer Q-Spitze auftragen, um trockene Augen zu verhindern.
3. Führen Sie das Parabiose-Verfahren wie zuvor beschrieben⁵.
   1. Setzen Sie die Mäuse in die Supine-Position. Rasieren Sie die linke Seite einer Maus und die rechte Seite der anderen Maus ab ca. 1 cm über dem Ellenbogen bis 1 cm unterhalb des Knies mit einem elektrischen Rasierer. Verwenden Sie Enthaarungscreme, um das Fell auf der rasierten Haut vollständig zu löschen.
   2. Wischen Sie die rasierten Bereiche mit Iodophor ab. Legen Sie die Mäuse auf ein beheiztes Pad, das von einem sterilen Pad bedeckt ist.
   3. Erstellen Sie Längshauteinschnitte von 0,5 cm über dem Ellenbogen bis 0,5 cm unterhalb des Kniegelenks mit einer scharfen Schere auf der rasierten Seite jedes Tieres.
   4. Die Haut nach dem Schnitt sanft von der subkutanen Faszie lösen.
   5. Verbinden Sie das Olecranon und das Knie des Parabionts mit einer 3-0-Naht.
   6. Nahn die rasierte Haut mit einer kontinuierlichen 5-0 Naht.
4. Injizieren Sie 0,5 ml 0,9% NaCl subkutan in jede Maus, um Austrocknung zu verhindern.
5. Injizieren Tramadol (10 mg/25 g/Tag) intramuskulär zu jeder Maus, um Schmerzen zu lindern.

3. Validierung des Zirkulationschimmers

1. Glukose-Schwankungsmethode
   HINWEIS: Überprüfen Sie die erfolgreiche Konstruktion des Zirkulationschimimismus zwischen Parabionten mit der Glukosefluktuationsmethode (kein Fasten) am 10. Tag nach der Parabiose-Operation.
   1. Anästhetisieren Sie die Parabionten durch intraperitoneale Injektion von 20 g/L 2,2,2-Tribromethanol an jede Maus in einer Konzentration von 0,1 ml/10 g.
   2. Fixieren Sie die Spendermäuse in einem Venous Visual-Mouse Schwanzfixator.
   3. Reiben Sie die kaudalen Venen in der Flanke eines Schwanzes des Parabionts mit einer In 70-75% Alkohol getränkten Baumwollkugel, um den Schwanz zu reinigen und die Blutgefäße zu verdünnen.
   4. Halten Sie eine 1,0 ml Spritze mit Glukose in der rechten Hand und halten Sie die Nadel parallel zur Vene (weniger als 15°).
   5. Setzen Sie die Nadel an einer Position von ca. 2 x 4 cm von der Schwanzspitze ein.
   6. Injizieren Sie 100 l Glukose (1,2 g/kg) innerhalb von 10 s in den Spender.
      HINWEIS: Der Begriff Spender bezieht sich auf das Parabiont, das die Glukose-Injektion durch die Schwanzvene erhält. Der Empfänger ist der andere Parabiont, der Glukose nicht direkt erhält.
   7. Reinigen Sie die Zehen mit Iodophor. Schneiden Sie die Zehen der Spender- und Empfängermäuse mit einer Schere ab und sammeln Sie einen Tropfen Blut zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion von Glukose (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min und 60 min). Entfernen Sie das Blutgerinnsel an jedem Sammelzeitpunkt, um weitere Schäden zu vermeiden.
      HINWEIS: Das Volumen des gesammelten Blutes war 10-25 ul für einen Test, und 90-225 ul insgesamt.
   8. Tropfte das Blut in die Mitte der Glucometer-Teststreifen für den Nachweis des Glukosespiegels.
2. Verwenden Sie Evans blauen Counterstain als Positivkontrolle³.
   1. Injizieren Sie 200 l 0,5% Evans blaues Gegenfleck intraperitoneal in die Spendermaus.
   2. 2 h später die Parabionten durch intraperitoneale Injektion von 20 g/L 2,2,2-Tribromoethanol an jede Maus in einer Konzentration von 0,2 ml/10 g einschläfern und Blut aus beiden Parabionten durch Herzpunktion sammeln.
   3. Zentrifuge die Blutproben bei 916 x g für 15 min.
   4. Serum vom Überstand sammeln.
   5. Das Serum mit 0,9% NaCl bei 1:50 verdünnen.
   6. Messen Sie die Absorption der verdünnten Serumproben bei 620 nm mit einem Spektralphotometer.

Ergebnisse

Bei sechs Spendermäusen stieg der Blutzuckerspiegel bei durchschnittlich 1 min nach der Injektion von 100 l Glukose (1,2 g/kg) durch die Schwanzvene drastisch auf 26,5 mol/L (173% Anstieg) und sank dann nach und nach auf 13,3 'mol/L bei 60 min. Bei Empfängermäusen erhöhte sich der Blutzucker nach der Injektion langsam und erreichte den ersten Spitzenwert nach 15 min (47% Anstieg, 12,2 mol/L). Basierend auf den obigen Ergebnissen wurde der Standard für Zirkulationschimäre wie folgt festgel...

Diskussion

Parabiose bezieht sich auf die chirurgische Technik der Verbindung zweier lebender Tiere, um ein gemeinsames Gefäßsystem mit experimentellen Mitteln zu etablieren^6,7,8. Der Vorteil dieses Modells ist, dass die von einem einzelnen Individuum produzierten Substanzen auf beide Tiere gleichzeitig wirken können. So kann das Parabiose-Modell verwendet werden, um die Rolle eines Stoffes oder Faktors bei einer verwandten Krankheit zu er...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
gebogene Pinzette	JZ surgical Instruments, China	J31340
feine Schere	JZ surgical Instruments, China	WA1030
Nadelzange	JZ surgical Instruments, China	60017961
2,5 mL Spritzen	Agilent, USA	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
Penicillin	Solarbio, China	IP0150
Tramadol	Yijishiye, China	YJT712520
Blutzuckermessgerät	Roche Diabetes Care, Indiana	Accu-Chek Active Teststreifen
Evan's blue Counterstain	Solarbio, China	G1810
Enthaarungscreme	Nair, USA	LL9161
Wärmedecke ( Heizkissen)	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
Elektrorasierer	Codos, China	CP-5000
3-0,5-0 chirurgisches Nahtmaterial	Shanghai Medical Nahtnadelfabrik, China	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#