Clonale genetische Tracing mit der Konfetti-Maus zur Untersuchung mineralisierter Gewebe

Zusammenfassung

Diese Methode beschreibt die Verwendung des R26R-Konfetti (Konfetti) Mausmodells zur Untersuchung mineralisierter Gewebe, die alle Schritte von der Zuchtstrategie bis zu den Bilderfassungen abdeckt. Enthalten ist ein allgemeines Protokoll, das auf alle Weichgewebe angewendet werden kann, und ein modifiziertes Protokoll, das auf mineralisierte Gewebe angewendet werden kann.

Zusammenfassung

Eine einzelne Zelle im Körper zu beschriften, um zu überwachen, welche Zelltypen sie hervorrufen kann, und ihre Migration durch den Organismus zu verfolgen oder ihre Langlebigkeit zu bestimmen, kann eine leistungsfähige Möglichkeit sein, Mechanismen der Gewebeentwicklung und -erhaltung aufzudecken. Eines der wichtigsten Derzeit verfügbaren Werkzeuge zur Überwachung von Zellen in vivo ist das Konfetti-Mausmodell. Das Konfetti-Modell kann verwendet werden, um einzelne Zellen bei lebenden Mäusen mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen zelltypspezifisch genetisch zu kennzeichnen und ihr Schicksal sowie das Schicksal ihrer Nachkommen im Laufe der Zeit zu überwachen, in einem Prozess, der als klonale genetische Tracing oder klonale Linienverfolgung. Dieses Modell wurde vor fast einem Jahrzehnt erstellt und hat zu einem besseren Verständnis vieler biologischer Prozesse beigetragen, insbesondere im Zusammenhang mit der Stammzellbiologie, der Entwicklung und der Erneuerung von erwachsenen Geweben. Die Erhaltung des fluoreszierenden Signals bis zur Bildaufnahme und gleichzeitigen Erfassung verschiedener fluoreszierender Signale ist jedoch technisch eine Herausforderung, insbesondere für mineralisiertes Gewebe. Diese Publikation beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Verwendung des Konfetti-Modells zur Analyse des Wachstumsplattenknorpels, der auf jedes mineralisierte oder nichtmineralisierte Gewebe aufgebracht werden kann.

Einleitung

Verbesserte Methoden zur Überwachung des Zellverhaltens sind wünschenswert, um die experimentelle Effizienz bei der Verwendung von Tiermodellen zu erhöhen. Einer der informativsten Ansätze zur Überwachung des Zellverhaltens in vivo ist die klonale Linienverfolgung mit mehrfarbigen Reporter-Mausstämmen¹, einschließlich der weit verbreiteten R26R-Konfetti (Confetti) Maus². Durch die genetische Kennzeichnung einzelner Zellen mit fluoreszierenden Proteinen und die Verfolgung dieser Zellen im Laufe der Zeit haben Forscher in vielen Bereichen die Konfetti-Maus verwendet, um Einblicke in eine Vielzahl verschiedener biologischer Systeme zu gewinnen.

Die Konfetti-Maus ist ein loxP-basiertes Reportersystem, bei dem eine creabhängige DNA-Rekombination die permanente Expression eines von mehreren möglichen fluoreszierenden Proteinen in stochastischer Weise verursacht². Das R26R-Konfetti-Allel enthält den allgegenwärtig ausgedrückten CAGG-Promotor, der unmittelbar vor einer loxP-flankierten Neo^R-Kassette2liegt, deren Polyadenylierungssequenz die Transkription³beendet, gefolgt von der Brainbow 2.1 Konstrukt⁴. Daher wird die Neo^R-Kassettedurch cre-vermittelte Rekombinationen gleichzeitig ausgeschnitten und führt zur Produktion bestimmter fluoreszierender Proteine, je nachdem, welche Teile des Brainbow 2.1-Konstrukts verbrauchen. Diese Funktion macht die Konfetti-Maus extrem anpassungsfähig, da sie verwendet werden kann, um jede zelluläre Population in einer Maus anzusprechen, für die ein bestimmter Cre-Stamm verfügbar ist. Die Überquerung eines gewebespezifischen Cre-Stamms mit dem R26R-Konfetti-Stamm sorgt für die Spezifität der Etikettierung. Der Cre-Stamm sollte jedoch auch induzierbar sein (z. B. CreERT oder CreERT2, die eine Tamoxifenbindung erfordern, damit sie in den Zellkern gelangen und eine DNA-Rekombination induzieren⁵), so dass die Kennzeichnung zu bestimmten Zeitpunkten erreicht werden kann. So kann eine zelluläre Population durch Injektion des resultierenden CreERT-positiven/Konfetti-positiven Nachwuchses mit Tamoxifen zum gewünschten Zeitpunkt markiert und bis zu einem bestimmten Alter verfolgt werden, wenn die gewebe von Interesse zur Analyse gesammelt werden können. Nach der Gewebeverarbeitung können die fluoreszierend gekennzeichneten Zellen direkt durch konfokale Mikroskopie visualisiert werden, so dass die Nachkommen jeder ursprünglich beschrifteten Zelle von der Nachkommenschaft getrennt werden können, die von jeder anderen markierten Zelle auf der Grundlage ihrer spezifischen fluoreszierenden klonalen genetischen Spuren) zu ermöglichen, wodurch die Klonalität beurteilt werden kann.

Aufgrund der Flexibilität des Konfetti-Modells wurde es angewendet, um die Entwicklung und Wartung vieler verschiedener Gewebe in Gesundheit und Krankheit zu studieren^{2,6,7,8,9, 10,11}. Eine gängige Möglichkeit, das Modell zu verwenden, besteht darin, eine bestimmte Population von Zellen zu kennzeichnen und zu bestimmen, zu welchem Gewebe sie (und/oder ihre Nachkommen) beigetragen haben. Ein solcher Befund mit diesem Ansatz war, dass der erwachsene Zahn aus Zellen mit einem gliaalen Ursprung^{besteht 6}. Eine weitere Anwendung des Modells ist die Untersuchung der Stammzellhomöostase. Zum Beispiel zeigte das Konfetti-Modell, dass Stammzellnischen in den Darmkrypten allmählich monoklonal werden, weil einige Stammzellklone im Wettbewerb zwischen Stammzellen²dominant sind. Das Modell kann auch verwendet werden, um die Zellproliferation zu bewerten, was besonders nützlich für die Untersuchung langsam teilender Zellen ist. Zum Beispiel wurde die klonale Bildung im Gelenkknorpel¹² untersucht, und die kurzfristigen Auswirkungen eines Igelantagonisten auf Wachstumsplattenchondrozyten bei fünf Wochen alten Mäusen wurden untersucht¹³.

Trotz der relativen Einfachheit des Konfetti-Modells kann das fluoreszierende Signal technisch schwierig sein, bis zur Bildsammlung zu erhalten, insbesondere bei der Analyse mineralisierter Gewebe. Hier beschreibt das Protokoll ein optimiertes Modell zur Verwendung der Konfettimaus mit dem postnatalen Knochen (bis zu 6 Monaten), so dass fluoreszierende Proteine direkt durch konfokale Mikroskopie visualisiert werden können, ohne dass eine Immundetektion erforderlich ist. Dieses vereinfachte Protokoll kann auf nichtmineralisierte Gewebe angewendet werden. Darüber hinaus enthält eine Beschreibung, wie die Proben zu speichern, um das Fluoreszenzsignal für einen längeren Zeitraum von mindestens 3 Jahren zu erhalten. Eine Übersicht des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.

Protokoll

Alle Mausarbeiten wurden vom Ethikausschuss für Tierversuche (Stockholm North Committee/Norra Djurförsöksetiska Nämd) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Bestimmungen und Richtlinien der Schwedischen Tieragentur für Tierversuche durchgeführt.

1. Mauszucht

1. Um die Spannung zu erzeugen, überqueren Sie die R26R-Konfetti-Maus mit der Cre-Linie von Interesse. Entwöhnen Sie die Welpen im Alter von 21 Tagen.
   HINWEIS: Mäuse können für die Zucht ab ca. 8 Wochen alt oder nach den lokalen Richtlinien verwendet werden. Genotypisierung (hier nicht beschrieben) kann aus Biopsien durchgeführt werden, die bei der Entwöhnung gesammelt werden. Das Alter bei der Entwöhnung kann gemäß den lokalen Richtlinien angepasst werden.

2. Konfetti-Etikettierung

HINWEIS: Diese Etikettierungsstrategie eignet sich für tamoxifen induzierbare Cre-Stämme.

1. Bereiten Sie eine Lösung von bis zu 2,5 mg/ml Tamoxifen in Maisöl in einer Glasflasche vor. Durch Erhitzen auf 37 °C im Ofen bis zu 60 min auflösen und alle 5 min mit einem Wirbel aufrühren, bis sich das Pulver aufgelöst hat.
   HINWEIS: Für erhöhte Dosen von Tamoxifen können mit dieser Methode Lösungen bis zu 20 mg/ml hergestellt werden.
2. Bei 4 °C bis zu 3 Monate vor Licht schützen.
3. Induzieren Sie eine Rekombination durch Verabreichung von 50 l 2,5 mg/ml Tamoxifen, die am ersten postnatalen Tag intraperitoneal in Maisöl gelöst werden (P1).
   HINWEIS: Grundsätzlich kann Tamoxifen bereits in der F1-Generation in jedem Alter verabreicht werden. Die Dosis von Tamoxifen sollte basierend auf Cre-Expression, Mausalter und experimenteller Anwendung variiert werden. Weitere Informationen finden Sie im Diskussionsbereich. Cre negative Mäuse auf die gleiche Weise behandelt kann als negative Kontrolle für Konfetti Fluoreszenzsignale verwendet werden.
   VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Tierhalter vor der Verwendung von Tamoxifen gewarnt werden und stellen Sie sicher, dass Käfigmaterialien gemäß den örtlichen Umwelt- und Sicherheitsrichtlinien entsorgt werden.

3. Gewebesammlung

1. Euthanisieren Sie Mäuse am postnatalen Tag 27 (P27), indem Sie den Raum, der die Mäuse enthält, schrittweise mit Kohlendioxid bis zu mindestens 80 Volumenprozent füllen und diese Konzentration für 3 min beibehalten. Führen Sie zervikale Dislokation durch. Halten Sie Mäuse während der Zerlegung der anderen Tiere auf Eis.
2. Sezieren Sie das Gewebe von Interesse. Im Folgenden ist ein Protokoll zum Sammeln der proximalen tibialen und distalen femoralen Wachstumsplatten und des Gelenkknorpels des Knies beschrieben, geeignet für postnatale Mäuse bis zum Alter von 6 Monaten.
   1. Entfernen Sie die Haut um die Hinterbeine bis zum Fuß, mit scharfer Schere und Zahnzange.
   2. Schneiden Sie den Muskel und das Fettgewebe grob mit einer scharfen Schere von den Beinen.
      HINWEIS: Reinigen Sie die Knochen nicht perfekt, da die umgebenden Gewebe beim Schnitt eine gewisse strukturelle Unterstützung bieten, aber sicherstellen, dass die gesamte Haut entfernt wird.
   3. Mit einem Skalpell durch schneiden Sie das Weichgewebe, wo die Oberseite des Beins trifft den Körper, bis der Oberschenkelkopf sichtbar ist, dann schneiden Sie die Bänder in der Hüftgelenk, um das Bein zu entfernen.
      HINWEIS: Alternativ, wenn es nicht möglich ist, den Oberschenkelkopf zu finden, durchschneiden Sie den Oberschenkelknochen in der Nähe der Hüfte mit einer starken Schere.
   4. Sezieren Sie den Fuß vom Rest des Beins mit einem Skalpell oder einer scharfen Schere.

4. Gewebefixierung und -verarbeitung

HINWEIS: Folgen Sie auf der Grundlage des gewebes von Interesse eines der beiden unten aufgeführten Protokolle (4.1 für Weichgewebe oder 4.2 für mineralisiertes Mausgewebe im Alter von etwa 45 Tagen, wie unten beschrieben). Bei beiden Methoden die sezierten Proben in der 3,7%igen Formaldehyd/Phosphatgepufferte Saline (PBS) Lösung auf Eis lagern, während die verbleibenden Tiere seziert werden.

1. Bei Weichteilen und mineralisierten Tibia und Femora bis zum Alter von ca. P45 das Gewebe in vorgekühltem 3,7% Formaldehyd/PBS für 6 h fixieren und bei 4 °C sanft auf einem Rotator rollen. Verwenden Sie ein Volumen, das mindestens 10x größer ist als das des Gewebes. Fahren Sie direkt mit Schritt 4.3 fort.
2. Für mineralisierte Gewebe, einschließlich Tibiae und Femora über das Alter von ca. P45, ist ein Entkalkungsschritt erforderlich.
   1. Bereiten Sie 1 L von 10% EDTA/dH2 O Lösung mit dem pH-Wert auf 8,05 mit Natriumhydroxid eingestellt. Als nächstes verdünnen Sie das Formaldehyd mit dieser Lösung auf 3,7 %. Die Arbeitskonzentration von EDTA wird 9 % betragen.
   2. Befestigen Sie das Gewebe, indem Sie es über Nacht in vorgekühltes 3,7% Formaldehyd/PBS legen und bei 4 °C sanft auf einem Rotator rollen.
   3. Legen Sie das Gewebe in vorgekühlte 3,7% Formaldehyd/9% EDTA/dH2 O Lösung (pH 8.05), und drehen Sie sich vorsichtig bei 4 °C in einem Volumen, das mindestens 10x größer ist als das des Gewebes. Wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie die Knochen in frische, vorgekühlte 3,7% Formaldehyd/9% EDTA/dH₂O für 3x über die nächsten 48 h legen.
      HINWEIS: Diese kurze Entkalkung reicht aus, um die Knochen der Oberschenkelknochen und Tibia knochen von bis zu 6 Monate alten Mäusen zu sektionieren. Für dichter mineralisierte Gewebe kann eine weitere Entkalkung erforderlich sein, um die Histologie zu verbessern.
3. Übertragen Sie das Gewebe in vorgekühlte 30% Saccharose/dH₂O. Achten Sie darauf, den Behälter bis zum Rand zu füllen, und drehen Sie sich vorsichtig über Nacht bei 4 °C. Verwenden Sie ein Volumen, das mindestens 10x größer ist als das des Gewebes. Das Gewebe schwimmt oft, wenn es zuerst in diese Lösung gelegt wird und sinkt bis zum Morgen auf den Boden der Flasche.
4. Um die Restsucrose-Lösung zu entfernen, waschen Sie das Gewebe kurz, indem Sie es mit Zangen aus der Saccharoselösung entfernen und die Probe für einige Sekunden vollständig mit ca. 5 ml optimaler Schnitttemperaturverbindung (OCT) abdecken.
5. Füllen Sie einen voretikettierten Kryomold mit OCT und positionieren Sie das Gewebe an der Unterseite. Arbeiten Sie schnell, um zu vermeiden, dass die Proben zu lange bei Raumtemperatur sitzen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Probe in einer praktischen Ausrichtung für den Schnittschritt zu platzieren. Um die Wahrscheinlichkeit des Schnittes durch ganze Wachstumsplattensäulen nach der Rückverfolgung mit Col2CreERT:Confetti zu erhöhen, legen Sie die mediale Seite nach unten mit dem Oberschenkelkopf als Führung, und positionieren Sie die Probe so flach wie möglich am Boden der Form.
6. Die Probe einbetten, indem Sie die Form auf Trockeneis legen und darauf warten, dass das OCT vollständig erstarrt. Legen Sie die Kryomolde so flach wie möglich, um Bewegung/ Gleiten des Gewebes in der Form zu vermeiden. Nach der Fertigstellung die Proben bei -20 °C lagern, wenn sie nicht sofort verwendet werden.
   HINWEIS: Verwenden Sie innerhalb von 12 Wochen, weil mit dem Alter die Blöcke schwieriger zu abschnitten.

5. Schnitt

HINWEIS: Führen Sie Kryosektionen mit einem Kryostat mit Einwegklingen durch, die für Hartgewebe geeignet sind. Jeder Standard-Kryostat ist geeignet.

1. Entfernen Sie den Block aus der Form und befestigen Sie ihn an der Spannvorrichtung, indem Sie OCT zwischen der Oberseite des Blocks und dem Futter und abkühlen im Kryostat bei -20 °C für mindestens 5 min, so dass das OCT vollständig verfestigt ist.
2. Sowohl den Probenhalter als auch den Klingenhalter auf -20 °C vorkühlen und dann die Probe/das Futter in den Futterhalter und die Klinge in den Klingenhalter legen, um sie für mehrere Minuten auszubalancieren.
   HINWEIS: Die angegebenen Temperaturen können je nach Kryostat und Gewebe von Interesse um mehrere Grade variiert werden.
3. Verwenden Sie den Kryostat, um den Block zu trimmen und Gewebeabschnitte mit einer geeigneten Dicke zu schneiden, um die Visualisierung der Klone im Gewebe von Interesse zu ermöglichen.
   1. Für die postnatale Wachstumsplattenanalyse können Sie Abschnitte von 30 bis 160 m vorbereiten und auf Dias sammeln. Einige Kryostatmodelle erlauben möglicherweise nur die Sammlung dicker Abschnitte mit der Trimmeinstellung.
4. Die Dias trocknen die Dias bei Raumtemperatur bis sie vollständig trocken sind.
   HINWEIS: Die Dauer dieses Schritts kann je nach Gewebeeigenschaften und Schnittdicke variieren. Die Temperatur des Raumes wird wahrscheinlich auch die Geschwindigkeit dieses Schritts beeinflussen.
5. Bewahren Sie die Dias bis zu 36 Monate bei -20 °C auf, oder fahren Sie bei sofortiger Verarbeitung mit Schritt 6.2 fort.

6. Schiebevorbereitung und -montage

1. Entfernen Sie die Rutsche aus dem Gefrierschrank und bringen Sie sie horizontal in einem Schiebehalter auf Raumtemperatur. Lassen Sie jegliche Kondensation verdampfen.
2. Entfernen Sie das OCT, indem Sie eine Pasteur-Pipette verwenden, um PBS bei Raumtemperatur vorsichtig auf das Dia aufzutragen. Je dicker der Abschnitt, desto länger ist die Zeit erforderlich. Für 160 m dicke Abschnitte zwei Spülungen durchführen: einmal für 15 min inkubieren und die Flüssigkeit entfernen, und dann frisches PBS für 5 min auftragen und die Flüssigkeit entfernen.
   HINWEIS: Dieser Schritt dient zum Entfernen des OCT und kann je nach Gewebeeigenschaften und Schnittdicke entsprechend variiert werden. Die Temperatur des Raumes wird wahrscheinlich die Geschwindigkeit dieses Schritts beeinflussen.
3. Montieren Sie die Schlitten in einer Lösung von 75% 2,2-Thiodiethanol/dH₂O bei Raumtemperatur mit 60 mm langen Deckschlips.
   HINWEIS: Dias können unmittelbar vor der Bildgebung vorbereitet werden, aber das fluoreszierende Signal ist für 1 bis 2 Wochen stabil, wenn es in einer befeuchteten Kammer bei 4 °C aus dem Licht gehalten wird.

7. Bildgebung durch konfokale Mikroskopie

1. Richten Sie das Mikroskop ein.
   1. Schalten Sie das Mikroskop ein und öffnen Sie die Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche System starten.
   2. Wählen Sie die Kanäle aus, indem Sie zuerst auf Smart Setup unter der Registerkarte "Erfassung" klicken und dann die drei Kanäle auswählen, die dem roten fluoreszierenden Protein (RFP), dem gelben fluoreszierenden Protein (YFP) und dem Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP) unter dem Farbstoff Überschrift. Klicken Sie auf Bestes Signal, und wählen Sie dann die Laser aus.
      HINWEIS: Der Inhalt der Registerkarte "Erwerb" wird in der Zusatzdatei 1Aangezeigt. Wenn die erforderlichen Kanäle nicht vorhanden sind, fügen Sie sie mit der Schaltfläche '+' unter der Überschrift Farbstoff hinzu. Die notwendigen Informationen über Laser, Anregungswellenlängen und den Bereich der aufgezeichneten Emissionswellenlängen werden für die drei Konfetti-Fluoreszenzproteine in der Zusatzdatei 1B-Ddargestellt.
   3. Wählen Sie das 20-fache Objektiv unter der Überschrift Objektiv auf der Registerkarte Erfassungsmodus aus.
2. Suchen Sie die Wachstumsplatte oder ein anderes Gewebe von Interesse.
   1. Um eine eindeutige Ansicht bereitzustellen, wählen Sie zuerst den RFP-Kanal aus, indem Sie auf der Registerkarte Kanäle auf seinen Namen klicken. Dadurch werden Details des RFP-Kanals auf der Registerkarte Lichtpfad angezeigt. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen neben T-PMT.
      HINWEIS: Der T-PMT-Kanal zeigt nicht reflektiertes Laserlicht, das zur Visualisierung der nicht fluoreszierenden Teile des Gewebes verwendet wird.
   2. Platzieren Sie den Schlitten in den Schiebehalter und positionieren Sie die Wachstumsplatte oder ein anderes Gewebe von Interesse direkt zwischen dem Lichtpfad und der Objektivlinse.
   3. Um die Lokalisierung des Gewebes zu vereinfachen, deaktivieren Sie die YFP- und CFP-Kanäle mithilfe der Kontrollkästchen unter der Überschrift Tracks der Registerkarte Kanäle.
   4. Wählen Sie den T-PMT-Kanal aus, indem Sie in der Überschrift Tracks auf seinen Namen klicken. Klicken Sie auf der Registerkarte "Erfassung" auf Live und erhöhen Sie den Gain (Master) für den T-PMT-Kanal, um den Gewebeabschnitt auf dem Bildschirm zu visualisieren, der in Graustufen angezeigt wird.
   5. Bewegen Sie die Position des Dias mit dem Joystick, um den Interessenbereich zu lokalisieren, und fokussieren Sie dann mit dem entsprechenden Mikroskopknopf.
   6. Klicken Sie auf der Registerkarte "Erfassung", um die Laserbelichtung zu deaktivieren.
3. Definieren Sie die Bildparameter.
   1. Verwenden Sie die Kontrollkästchen auf der Registerkarte Kanäle, um einen der Kanäle auszuwählen, und klicken Sie auf der Registerkarte "Erfassung", um das Bild dieses Kanals auf dem Bildschirm anzuzeigen. Passen Sie dann mit der Linksklicktaste auf der Maus die Schiebeleisten an, um den Erfassungsbereich des emittierten Fluoreszenzsignals, die Laserleistung (Schiebeleiste unter Laserüberschrift), Gain (Master) und Digital Offset im Channels-Registerkarte, um die Konfetti-beschrifteten Zellen auf dem Bildschirm zu visualisieren. Richtlinienwerte für alle diese Parameter werden in der Zusatzdatei 1B-D für RFP, YFP und CFP bereitgestellt. Führen Sie diesen Schritt für jeden Kanal nacheinander aus.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass das visualisierte Signal keine Autofluoreszenz ist, kann ein Abschnitt von einem Cre-Negativtier während dieses Schritts als Negativkontrolle verwendet werden. Da T-PMT mit dem RFP-Laser (Schritt 7.2.1) kombiniert wurde, wirkt sich die Anpassung der Laserleistung für RFP auf das T-PMT-Signal aus.
   2. Passen Sie die Pinhole-Größe an, um bei Bedarf die Fluoreszenzerkennung zu erhöhen.
      HINWEIS: Je höher die Lochgröße, desto mehr fluoreszierendes Signal wird in Z-Richtung erkannt. Eine Richtlinie hierfür ist die resultierende Airy Unit (AU), die automatisch unter dem Pinhole-Indikator angezeigt wird, wobei 1 AE für die Bildqualität optimal ist. Eine zu große Erhöhung der AU wird die spätere Analyse beeinträchtigen, da es schwieriger wird, einzelne Zellen in Z-Richtung zu unterscheiden).
   3. Überprüfen Sie das Setup, um sicherzustellen, dass sich die aufgezeichneten Signale nicht überlappen.
      1. Klicken Sie auf die Kontrollkästchen in der Registerkarte Kanäle, um alle drei Kanäle auszuwählen und die Schaltfläche "Fangen" in der Registerkarte "Erfassung" zu drücken.
      2. Scrollen Sie im resultierenden Bild zwischen den angezeigten Kanälen, indem Sie auf die blau markierten Kästchen über jedem aufgelisteten Kanal auf der Registerkarte Dimensionen klicken. Überprüfen Sie manuell die Überlappung zwischen den Kanälen auf dem Bildschirm. Wenn sich die Signale überlappen (z. B. wenn jede rote Zelle auch gelb ist), kehren Sie zum Anfang von Schritt 7.3 zurück und wiederholen Sie die Parameter für die überlappenden Kanäle, bis sie voneinander unterschieden werden können. Stellen Sie sicher, dass für jedes Etikett (d. h. RFP, YFP oder CFP) mindestens ein Klon visualisiert werden kann, der nur eine der Beschriftungen enthält.
4. Bild erfassen.
   1. Wählen Sie die Registerkarte Erfassungsmodus aus, um die Bildqualität mithilfe der Werte Frame Size, Speedund Averaging Number anzugeben.
      HINWEIS: Die typischen Einstellungen für diese Experimente sind in der Zusatzdatei 1Aangegeben. Durch das Reduzieren des Zooms unter der Überschrift Scanbereich auf der Registerkarte Erfassung kann das Sichtfeld vergrößert werden, ohne die für die Bildaufnahme erforderliche Zeit zu ändern.
   2. Klicken Sie auf der Registerkarte "Akquisition" unter der Überschrift Dimensionserfassung auf das Kontrollkästchen Z-Stack. Öffnen Sie die Registerkarte Z-Stack, um das Intervall zwischen den Bildern in Z-Richtung auf 2,5 m festzulegen.
   3. Um die richtigen Positionen festzulegen, wählen Sie nur das RFP/T-PMT auf der Registerkarte Kanäle aus, und klicken Sie auf Live, um die roten Klone mit einem sichtbaren Umriss des Gewebes zu visualisieren. Legen Sie das erste und letzte Slice fest, indem Sie auf "Erstes festlegen" und "Letzte" auf dem entsprechenden Slice klicken und den Fokus mit dem Mikroskopknopf einstellen.
   4. Klicken Sie auf die Registerkarte Kachelscan auf der Registerkarte "Erfassung", und geben Sie die Gesamtzahl der Kacheln in horizontalen und vertikalen Richtungen in den entsprechenden Feldern ein.
   5. Wählen Sie für die Bildaufnahme alle gewünschten Kanäle auf der Registerkarte Kanäle aus, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Fangen", um ein einzelnes Bild zu sammeln, oder auf die Schaltfläche Experiment starten, um einen Z-Stack/Kachel-Scanzu sammeln.
5. Nachdem das Bild aufgenommen wurde, klicken Sie auf Datei speichern und speichern Sie das Bild in einem Dateityp, der so viele Informationen wie möglich über die Einstellungen des Mikroskops speichert, um eine spätere Überprüfung und Wiederverwendung zu ermöglichen.
6. Führen Sie weitere Analysen mit Bildanalysesoftware durch.

Ergebnisse

Um Chondrozyten im epiphysealen Knorpel zu kennzeichnen und ihre klonale Expansion mit dem Alter mit Tamoxifen-Verabreichung auf P1 zu visualisieren, wurden Col2CreERT:Konfetti-Mäuse beschriftet und ihre Hinterbeine wurden auf P27 gesammelt. Der mittelgroße Abschnitt wurde durch Visualisierung des Kreuzbandes bestimmt (Abbildung 2A) und Klone in der proximalen tibialen Wachstumsplatte wurden visualisiert (Abbildung 2B). Diese Daten zeigen, dass einzelne Zellen, die Col2-positiv auf P1 waren und bei der Verabreichung von Tamoxifen mit Konfetti-Fluoreszenzproteinen gekennzeichnet wurden, klonal enthiv ausexpandierten und anschließend bis P27 in der Wachstumsplatte verblieben. Die ersten Veränderungen der klonalen Expansion von einem ähnlichen Entwicklungszeitpunkt aus sind in Abbildung 1 einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung¹³zu sehen.

Um ein Beispiel für das fluoreszierende Signal nach langzeitlagerung (Schritt 5.5) zu geben, wurde der gesammelte Abschnitt unmittelbar danach (siehe Abbildung 2A,B) mehr als 3 Jahre lang gespeichert, bevor es vorbereitet und abgebildet wurde (Abbildung 2C, Video 1) .

Um einige häufige Probleme mit dem Protokoll zu veranschaulichen, wird in Abbildung 3Aein Abschnitt dargestellt, der während des Kryosektionsschritts unterbrochen wurde. Der in Abbildung 3B erweiterte Bereich des Abschnitts (zwischen Wachstumsplatte und Gelenkknorpel), der in Abbildung 3B erweitert wurde, zeigt, dass diese Dosis von Tamoxifen zu einem so hohen Rekombinationsgrad in diesem Bereich führt, dass eine klonale Analyse ausgeschlossen würde.

Abbildung 1: Experimentelle Übersicht. Flussdiagramm, das die wichtigsten Phasen der Methode zusammenfasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Konfetti-Bilder von einer Col2CreERT:Konfetti-Maus. (A) Proben von Col2CreERT:Konfettimäuse wurden ohne Entkalkung oder langzeitlagerungsschritt verarbeitet. Der mittelgroße Abschnitt wurde mit dem Kreuzband als Marker lokalisiert. Dieses Bild wurde mit einem Kachelscan visualisiert, nachdem RFP mit T-PMT erkannt wurde (Scale bar = 300 m). (B) Clonalsäulen werden innerhalb der proximalen Tibia der Wachstumsplatte angezeigt, die in (A) nach 3D-Rekonstruktion sichtbar ist. (C) Für die Bildgebung und die 3D-Rekonstruktion wurde eine benachbarte Folie zu der in (A) undB) in Langzeitlagerung gehaltenen Folie verarbeitet. RFP, YFP und CFP werden in (B) und (C) (Scale bars = 50 'm) angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Herausforderungen bei der Verwendung der Methode. (A) Die weißen gestrichelten Linien umreißen einen Split im Abschnitt durch die Wachstumsplatte von Col2CreERT:Konfetti-Mäusen (Scale bar = 50 m). Der Bereich innerhalb des weißen Feldes ist in (B) (Skalenleiste = 25 m) dargestellt. RFP, YFP und CFP werden in beiden Panels angezeigt, und der nicht reflektierte Laserlichtkanal (T-PMT) wird auch in (A) angezeigt, um das Gewebe zu visualisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Dreidimensionale Rekonstruktion einer Wachstumsplatte von Col2CreERT: Konfettimaus. Eine Folie aus einem Col2CreERT vorbereitet: Konfetti-Maus wurde in Langzeitlagerung nach dem Schnitt für mehr als 3 Jahre gehalten, und dann für die Bildgebung verarbeitet. Die dreidimensionale Rekonstruktion wurde automatisch mit Bildanalysesoftware durchgeführt und als Video exportiert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: Typische Einrichtung des Konfokalmikroskops. (A) Die hauptsteuerelemente in der Erfassungsregisterkarte. (B-D) Die Laserparameter, die Anregungswellenlänge und der Bereich der aufgezeichneten Emissionswellenlängen werden für drei Konfetti-Fluoreszenzproteine angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Das Konfetti-Modell wurde ausgiebig verwendet, um mineralisierte Knorpelgewebe^12,13,14 zu untersuchen und das optimierte Protokoll zu beschreiben. Konfettimäuse² mit einer oder zwei Kopien des R26R-Konfetti-Alleels können für Zucht und Experimente verwendet werden. Die Rekombination bei Mäusen mit einem Allel des Brainbow 2.1-Konstrukts gibt vier potenzielle Bezeichnungen: rotes fluoreszierendes Protein (RFP, zytoplasmatisch), gelbes fluoreszierendes Protein (YFP, zytoplasmatisch), Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP, membranlokalisiert) und grün fluoreszierendes Protein (GFP, Nucleus-lokalisiert), während die Rekombination in den homozygoten Konfetti-Mäusen (d.h. zwei Kopien des Brainbow 2.1-Konstrukts) 10 mögliche Farbausgänge (RFP+RFP, RFP+YFP, RFP+GFP, RFP+GFP, YFP+YFP, YFP+CFP, YFP+ GFP, GFP+CFP, GFP+GFP, GFP+GFP). Da die DNA-Exzisions- und Inversionsereignisse jedoch stochastisch auftreten, tritt die Rekombination zur Erzeugung von GFP nur in einem kleinen Bruchteil der Zellen auf, wie zuvor berichtet², und unterscheidet sich scheinbar nach Zelltyp oder Cre-Linie,^{die verwendet}wird 2^{, 12,13}. Angesichts des geringen Auftretens von Rekombinationsereignissen, die zum GFP-Ausdruck führen, sind daher sechs Farbausgänge die häufigsten bei homozygoten Konfetti-Mäusen.

Ein wichtiger Aspekt bei der Planung von Experimenten mit der Konfettimaus ist die Suche nach einem geeigneten Cre-Stamm. Erstens, da das Konfetti-Allel mehrere loxP-Sites hat, schließt ein Rekombinationsereignis ein zweites⁴nicht aus. Dies bedeutet, dass, wenn eine Zelle beschriftet ist und sich teilt, um einen Klon einer Farbe zu erzeugen, ein zweites Rekombinationsereignis in einer seiner Tochterzellen eine andere Farbe erzeugen würde, wodurch die wahre klonale Expansion maskiert würde. Daher sind nicht induzierbare Cre-Stämme, bei denen das Enzym immer aktiv ist, wenn der entsprechende Promotor aktiv ist, nicht ratsam. Zweitens geht die Expression der Cre-Recombinase bei einigen Stämmen oft auf Kosten eines endogene Proteins, wodurch ein eigener Phänotyp entsteht (z. B. für den Prg4-GFPCreERT2-Knock-in-Mausstamm, bei dem Mäuse zwei Cre-Allele beherbergen¹⁵), daher ist eine einzige Kopie des Cre-Alleels wünschenswert. In allen beschriebenen Experimenten wurde eine einzige Kopie des Col2CreERT¹⁶ entweder vom männlichen oder vom weiblichen Elternteil getragen, um Col2CreERT:Konfetti-Mäuse zu erzeugen, wie^{beschrieben 13}. Als nächstes ist die Spezifität der Cre-Linie für den Zelltyp des Interesses eine wichtige Überlegung. Zum Beispiel ist Col2CreERT chondrocyt-spezifisch, aber kennzeichnet mehrere verschiedene Populationen von Chondrozyten im frühen postnatalen Knorpel¹⁷. Schließlich kann sich die Aktivität verschiedener Cre-Stämme mit dem Alter der Tiere erheblich ändern, da sich die endogene Aktivität des für cre-Expression genutzten Promotors ändert, selbst in Zellen desselben Typs (z. B. Prg4-GFPCreERT2, die eine Erhöhung der Anzahl der Tamoxifen-Dosen zur Kennzeichnung oberflächlicher Zonenzellen als Mäuse im Alter von¹⁵Jahren ).

Die Anzahl der markierten Zellen wird durch die Menge an Tamoxifen angegeben, so ist es nicht immer wünschenswert, die maximale Dosis zu geben, weil die Unterscheidung klonen voneinander schwierig sein kann. Da Cre Ausdruck unter der Regulierung der verschiedenen Promotoren sowie mit dem Alter variieren, muss die Tamoxifen-Dosierung angepasst werden, um die Etikettierung zu optimieren. Es ist wichtig zu beachten, dass Zellen bei der Auslösen der Rekombination nicht sofort fluoreszierend sind, da Zeit benötigt wird, damit die Rekombination auftritt und sich die resultierenden fluoreszierenden Proteine ausreichend für die Bildgebung ansammeln. Es wird ein breites Stundenspektrum (zwischen 24 und 72 h) benötigt, das durch die Cre-Linie, den Zelltyp und das Alter der Tiere beeinflusst zu sein scheint. Da Tamoxifen lange nach Verabreichung¹⁸ biologisch aktiv sein kann, ist es immer ratsam, die Rekombinationseffizienz in jedem Modell gründlich zu überprüfen.

Während des konfokalen Mikroskopieschritts erfordert die Anregung der Konfetti-Fluoreszenzproteine das Eindringen des Gewebes durch Laserlicht. Da verschiedene Gewebe unterschiedliche Eigenschaften haben, kann Laserlicht nicht 160 'm dicke Abschnitte aller Gewebe durchdringen. Solche dicken Abschnitte können jedoch für Wachstumsplattenknorpel verwendet werden, wie in Abbildung 2, Abbildung 3verwendet. Beachten Sie, dass jedes Mikroskop anders ist, und es ist unwahrscheinlich, dass die beschriebenen Einstellungen (Ergänzende Datei 1) ohne geringfügige Anpassungen perfekt funktionieren. Eine der größten Herausforderungen besteht darin, die verschiedenen fluoreszierenden Proteine zu unterscheiden, um sicherzustellen, dass es keine Kontamination von einem Kanal zum anderen gibt. Beispielsweise überschneidet sich das Signal im YFP-Kanal, das durch die Fluoreszenz von GFP verursacht wird, zwischen den YFP- und RFP-Kanälen. YFP- und GFP-Kanäle müssen ebenfalls sorgfältig geprüft werden. Dies kann auf verschiedene Weise erfolgen. Zunächst kann der Emissionsbereich von fluoreszierenden Lichtwellenlängen, die für jedes fluoreszierende Protein aufgezeichnet werden, verengt werden. Zweitens kann die Einstellung der Laserleistung in Kombination mit der digitalen Verstärkung das Signal optimieren. In dieser Studie waren diese Schritte ausreichend, aber sie verlassen sich auf ein starkes fluoreszierendes Signal. Dies bedeutet, dass theoretisch eine ineffiziente Gewebeverarbeitung die Aktivität der fluoreszierenden Proteine reduzieren kann oder eine schwache Laserlichtquelle die Kanaltrennung beeinträchtigen kann.

Einer der Vorteile der Konfetti-Maus ist, dass sie mit einer großen Anzahl von genetisch mutierten Stämmen kombiniert werden kann, die verfügbar sind, so dass der Einfluss bestimmter Gene auf die klonale Dynamik untersucht werden kann^{10,11,12 ,13,14,19,20}, wenn auch mit einigen Einschränkungen. Beispielsweise kann die Rekombination der Konfetti-Allele und des Gens von Interesse nicht getrennt werden, wenn Cre loxP-basierte Mutanten in Kombination mit klonaler Linienverfolgung verwendet werden. Dennoch können solche gleichzeitigen Rekombinationsereignisse wirksam sein^10,14,20. Zum Beispiel wurde diese Möglichkeit genutzt, um die erhöhte Zellzahl in der Ruhezone von Mäusen nach postnataler Chondrozyten-spezifischer Ablation von TSC1 in der Wachstumsplatte²¹ zu untersuchen und die klonale Beziehung zwischen diesen Zellen im Laufe der Zeit zu zeigen. ¹³. Zusätzlich kann die gewebespezifische klonale Analyse mit Konfetti-Mäusen mit nicht-Cre LoxP-basierten Mutantenmäusen¹¹verwendet werden, und es ist auch möglich, diese Ansätze mit pharmakologischen^{8,9 ,13} und/oder chirurgische Modelle^8, um klonale Reaktionen auf andere funktionelle Störungen zu visualisieren. Weitere Chancen ergeben sich bei der Kombination von Konfetti-gekennzeichneten Abschnitten mit immunemditionium endogene Proteine durch Immunfluoreszenz. Eine solche Analyse ermöglicht die Identifizierung von verfolgten Zellen und deren Kolokalisierung mit einem bekannten Marker. Mit der hier beschriebenen Fixierungsmethode ist es möglich, Immunfluoreszenz zu leiten und dennoch die Fluoreszenz der Konfettifluoreszenzproteine^12,13zu visualisieren. In den genannten Papieren war jedoch keine Antigenrückgewinnung erforderlich. Harte Antigen-Retrieval-Methoden, wie das Kochen im Citratpuffer, führt zu einem vollständigen Verlust der Konfettifluoreszenz. Obwohl die Konfetti-Fluoreszenzproteine dann mit Antikörpern²²nachgewiesen werden können, kann ein Verlust der klonalen Identität auftreten.

Zusammenfassend ist die Verwendung des Konfetti-Modells zur Kennzeichnung von Zellen in vivo ein informatives Werkzeug, um das Schicksal dieser Zellen im Laufe der Zeit zu analysieren. Die beschriebene Methode bietet eine schnelle und effiziente Möglichkeit, die fluoreszierende Proteinexpression in mineralisierten Geweben direkt zu visualisieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2,2-Thiodiethanol	Sigma	MKCF9328
60 mm lange Deckgläser	Mendel-Glä zer	220588
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss	LSM 710
Maisöl	Sigma	C8267
Cryomold (Standard)	Sakura	4557
Kryostat	Thermo	Modell: NX70
Einweg-Kryostat-Klingen	Histolab	207500014	Speziell für den Einsatz mit Hartgewebe
EDTA	Scharlan	AC0960005P
Formaldehydkonzentrat	Merck	8.18708.1000
Glasflaschen	Sigma	V7130	Kann zur Tamoxifenverdünnung und zur Gewebefixierung und -verarbeitung verwendet werden
Imaris Software	Oxford Instruments	N/A	Bildanalysesoftware für die 3D-Rekonstruktion
Isofluran	Zoetis	11-8162
OCT	Sakura	102094-104
Pasteurpipette	Sarstedt	86.1171
PBS	Gibco	14200075
Natriumhydroxid	Merck	1.06498.1000
Saccharose	Sigma	S0389
Superfrost UltraPlus Objektträger	Mendel-Glä zer	J3800AMNZ
Tamoxifen	Sigma	T5648
Zen2 Software	Zeiss	N/A	Freeware für konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie