Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Islmn:GFP Transgene Mäuse

Ryosuke Fujiki; Joun  Y. Lee; Julie  A. Jurgens; Mary  C. Whitman; Elizabeth C. Engle

doi:10.3791/60440

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Methodenartikel

Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Isl^mn:GFP Transgene Mäuse

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DOI:

10.3791/60440

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12. November 2019

Ryosuke Fujiki¹^,²^,³^,⁴^,⁹ , Joun Y. Lee¹^,²^,¹⁰ , Julie A. Jurgens¹^,²^,³^,⁷ , Mary C. Whitman²^,⁵^,⁶ , Elizabeth C. Engle¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸

¹Department of Neurology, Boston Children's Hospital, ²FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, ³Department of Neurology, Harvard Medical School, ⁴Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, ⁵Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, ⁶Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, ⁷Broad Institute of M.I.T. and Harvard, ⁸Howard Hughes Medical Institute, ⁹Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, ¹⁰Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit stellt ein Protokoll vor, um homogene Zellkulturen von primären okulomotorischen, Trochlea- und Spinalmotorneuronen zu ergeben. Diese Kulturen können für vergleichende Analysen der morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften von augen- und spinalmotorischen Neuronen verwendet werden.

Zusammenfassung

Okulomotorische Neuronen (CN3s) und Trochlea-Neuronen (CN4s) weisen eine bemerkenswerte Resistenz gegen degenerative motorische Neuronenerkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS) im Vergleich zu Spinalmotorneuronen (SMNs) auf. Die Fähigkeit, primäre Maus-CN3s, CN4s und SMNs zu isolieren und zu kultiieren, würde einen Ansatz zum Untersuchen von Mechanismen bieten, die dieser selektiven Sicherheitsanfälligkeit zugrunde liegen. Bis heute verwenden die meisten Protokolle heterogene Zellkulturen, die die Interpretation experimenteller Ergebnisse verwirren können. Um die Probleme im Zusammenhang mit gemischten Zellpopulationen zu minimieren, sind reine Kulturen unverzichtbar. Hier wird im ersten Protokoll detailliert beschrieben, wie CN3s/CN4s zusammen mit SMNs-Gegenstücken aus denselben Embryonen mit embryonalen Tag 11.5 (E11.5) Isl^MN:GFP transgene Mausembryonen effizient gereinigt und kultiviert werden können. Das Protokoll enthält Einzelheiten zur Gewebesektion und -dissoziation, zur FACS-basierten Zellisolierung und zur In-vitro-Kultivierung von Zellen aus CN3/CN4- und SMN-Kernen. Dieses Protokoll fügt bestehenden Protokollen ein neuartiges In-vitro-Kultursystem cN3/CN4 hinzu und bietet gleichzeitig eine reine spezies- und altersgerechte SMN-Kultur zum Vergleich. Analysen, die sich auf die morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften motorischer Neuronen konzentrieren, sind in diesem Kultursystem möglich. Dieses Protokoll wird die Erforschung der Mechanismen ermöglichen, die die Entwicklung des motorischen Neurons, die selektive Anfälligkeit und die Krankheit definieren.

Einleitung

Die Kultur der primären motorischen Neuronen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Untersuchung der neuronalen Entwicklung, Funktion, und Anfälligkeit für exogene Stressoren ermöglicht. Motorische Neuronenkulturen sind besonders nützlich für die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS)¹^,², deren Krankheitsmechanismen unvollständig verstanden werden. Interessanterweise sind trotz des signifikanten Zelltodes von Spinalmotorneuronen (SMNs) bei ALS-Patienten und ALS-Modellmäusen der Zelltod in okulomotorischen Neuronen (CN3s) und Trochlea-Neuronen (CN4s) relativ k....