Okulomotorische Neuronen (CN3s) und Trochlea-Neuronen (CN4s) weisen eine bemerkenswerte Resistenz gegen degenerative motorische Neuronenerkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS) im Vergleich zu Spinalmotorneuronen (SMNs) auf. Die Fähigkeit, primäre Maus-CN3s, CN4s und SMNs zu isolieren und zu kultiieren, würde einen Ansatz zum Untersuchen von Mechanismen bieten, die dieser selektiven Sicherheitsanfälligkeit zugrunde liegen. Bis heute verwenden die meisten Protokolle heterogene Zellkulturen, die die Interpretation experimenteller Ergebnisse verwirren können. Um die Probleme im Zusammenhang mit gemischten Zellpopulationen zu minimieren, sind reine Kulturen unverzichtbar. Hier wird im ersten Protokoll detailliert beschrieben, wie CN3s/CN4s zusammen mit SMNs-Gegenstücken aus denselben Embryonen mit embryonalen Tag 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgene Mausembryonen effizient gereinigt und kultiviert werden können. Das Protokoll enthält Einzelheiten zur Gewebesektion und -dissoziation, zur FACS-basierten Zellisolierung und zur In-vitro-Kultivierung von Zellen aus CN3/CN4- und SMN-Kernen. Dieses Protokoll fügt bestehenden Protokollen ein neuartiges In-vitro-Kultursystem cN3/CN4 hinzu und bietet gleichzeitig eine reine spezies- und altersgerechte SMN-Kultur zum Vergleich. Analysen, die sich auf die morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften motorischer Neuronen konzentrieren, sind in diesem Kultursystem möglich. Dieses Protokoll wird die Erforschung der Mechanismen ermöglichen, die die Entwicklung des motorischen Neurons, die selektive Anfälligkeit und die Krankheit definieren.