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Methodenartikel

Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Islmn:GFP Transgene Mäuse

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DOI:

10.3791/60440

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12. November 2019

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1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit stellt ein Protokoll vor, um homogene Zellkulturen von primären okulomotorischen, Trochlea- und Spinalmotorneuronen zu ergeben. Diese Kulturen können für vergleichende Analysen der morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften von augen- und spinalmotorischen Neuronen verwendet werden.

Zusammenfassung

Okulomotorische Neuronen (CN3s) und Trochlea-Neuronen (CN4s) weisen eine bemerkenswerte Resistenz gegen degenerative motorische Neuronenerkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS) im Vergleich zu Spinalmotorneuronen (SMNs) auf. Die Fähigkeit, primäre Maus-CN3s, CN4s und SMNs zu isolieren und zu kultiieren, würde einen Ansatz zum Untersuchen von Mechanismen bieten, die dieser selektiven Sicherheitsanfälligkeit zugrunde liegen. Bis heute verwenden die meisten Protokolle heterogene Zellkulturen, die die Interpretation experimenteller Ergebnisse verwirren können. Um die Probleme im Zusammenhang mit gemischten Zellpopulationen zu minimieren, sind reine Kulturen unverzichtbar. Hier wird im ersten Protokoll detailliert beschrieben, wie CN3s/CN4s zusammen mit SMNs-Gegenstücken aus denselben Embryonen mit embryonalen Tag 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgene Mausembryonen effizient gereinigt und kultiviert werden können. Das Protokoll enthält Einzelheiten zur Gewebesektion und -dissoziation, zur FACS-basierten Zellisolierung und zur In-vitro-Kultivierung von Zellen aus CN3/CN4- und SMN-Kernen. Dieses Protokoll fügt bestehenden Protokollen ein neuartiges In-vitro-Kultursystem cN3/CN4 hinzu und bietet gleichzeitig eine reine spezies- und altersgerechte SMN-Kultur zum Vergleich. Analysen, die sich auf die morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften motorischer Neuronen konzentrieren, sind in diesem Kultursystem möglich. Dieses Protokoll wird die Erforschung der Mechanismen ermöglichen, die die Entwicklung des motorischen Neurons, die selektive Anfälligkeit und die Krankheit definieren.

Einleitung

Die Kultur der primären motorischen Neuronen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Untersuchung der neuronalen Entwicklung, Funktion, und Anfälligkeit für exogene Stressoren ermöglicht. Motorische Neuronenkulturen sind besonders nützlich für die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS)1,2, deren Krankheitsmechanismen unvollständig verstanden werden. Interessanterweise sind trotz des signifikanten Zelltodes von Spinalmotorneuronen (SMNs) bei ALS-Patienten und ALS-Modellmäusen der Zelltod in okulomotorischen Neuronen (CN3s) und Trochlea-Neuronen (CN4s) relativ knapp1,3,4,5,6,7,8,9. Daher könnten vergleichende Analysen reiner Kulturen von CN3s/CN4s und SMN wichtige Hinweise auf Mechanismen liefern, die der relativen Verwundbarkeit zugrunde liegen. Leider war ein großes Hindernis für solche Analysen die Unfähigkeit, gereinigte Kulturen dieser motorischen Neuronen zu züchten.

Viele Protokolle wurden für die Reinigung von SMNs aus Tiermodellen beschrieben. Die meisten dieser Protokolle verwenden Dichtegradientzentrifugation10,11,12 und/oder p75NTR-Antikörper-basierte Zellsortierungs-Schwenktechniken13,14,15,16. Die Dichtegradientenzentrifugation nutzt die größere Größe von SMNs im Vergleich zu anderen Rückenzellen aus, während p75NTR ein extrazelluläres Protein ist, das ausschließlich von SMNs im Rückenmark exprimiert wird. Fast 100% reine SMN-Kulturen wurden von einem oder beiden dieser Protokolle11,12,14erzeugt. Diese Protokolle waren jedoch nicht erfolgreich bei der Erzeugung von CN3/CN4-Kulturen, da CN3s/CN4s p75NTRnicht ausdrücken und andere spezifische CN3/CN4-Marker nicht identifiziert wurden. Sie sind auch kleiner als SMNs und daher schwieriger zu isolieren, basierend auf der Größe. Stattdessen haben sich In-vitro-Studien von CN3s oder CN4s auf dissoziierte17,18,19,20,21, Explant17,22,23,24,25,26und Slice27,28 Kulturen, die aus heterogenen Zelltypen bestehen, und keine Protokolle für die Isolation und Kultur von primären CN3s oder CN4s.

Hier wird ein Protokoll für die Visualisierung, Isolierung, Reinigung und Kultivierung von CN3s, CN4s und SMNs vom selben Embryonaltag 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgene Mäuse29 (Abbildung 1, Abbildung 2A) beschrieben. IslMN:GFP kennzeichnet speziell motorische Neuronen mit einem farnesylierten GFP, das auf die Zellmembran lokalisiert. Dieses Protokoll ermöglicht einen art- und altersgerechten Vergleich mehrerer Arten von motorischen Neuronen, um pathologische Mechanismen bei motorischen Neuronenerkrankungen aufzuklären.

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Protokoll

Alle Experimente mit Labortieren wurden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und mit Genehmigung des Animal Care and Use Committee des Boston Children es Hospital durchgeführt.

1. Einrichten von zeitierten Matings vor der Zerlegung

  1. Um pränatale embryonale Mäuse für die motorische Neuronenernte zu erzeugen, wiegen Sie jede weibliche Maus und richten Sie eine zeitgefällige Paarung zwischen erwachsenen IslMN:GFP transgenen Mäusen 11,5 Tage vor dem Tag der Neuronenisolation ein. Für die Entwicklung dieses Protokolls wurden 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP-Mäuse im Alter von 2 bis 9 Monaten verwendet und am Abend eine zeitgefällige Paarung eingerichtet.
  2. Untersuchen Sie weibliche Mäuse am nächsten Morgen auf Vaginalstecker. Betrachten Sie das Datum, an dem der Stecker als embryonaler Tag (E) 0,5 identifiziert wird.
  3. Wiegen Sie weibliche Mäuse und untersuchen Sie Welpen mit Ultraschall (siehe Materialtabelle)zwischen E8.5-11. Überprüfen Sie die Anzeichen einer erfolgreichen Paarung.
    1. Bestätigen Sie die erfolgreiche Paarung, indem Sie Gewichtszunahme bei weiblichen Mäusen erkennen (in der Regel >1,5 g bei E9.5, wenn es mehr als 5-6 Embryonen gibt).
    2. Bestätigen Sie Embryonen visuell unter Ultraschall. Embryonen sind nach E9.5 leicht durch Ultraschall nachweisbar. Ultraschall wird nur an Frauen durchgeführt, die an Gewicht gewonnen haben, weil sie häufiger schwanger sind als solche, die es nicht tun.
      HINWEIS: Weibliche Mäuse können Gewicht aus anderen Gründen als der Schwangerschaft zu gewinnen, so Gewichtszunahme allein ist kein zuverlässiger Indikator für eine Schwangerschaft. Ultraschall-Bestätigung verhindert unnötige Opfer von Frauen, die nicht schwanger sind, aber nicht entscheidend ist, wenn nicht verfügbar.

2. Sezierbedingungen und Vorbereitung von Instrumenten

  1. Führen Sie alle Beschichtungen (außer Säurereinigung von Coverlips), Medienvorbereitung, Gewebedissoziation (außer Zentrifugation und Inkubation) und Kulturarbeit in einer laminaren Durchflusshaube durch, um die Sterilität der Medien und embryonalen motorischen Neuronen zu gewährleisten.
  2. Führen Sie mit sorgfältiger Aufmerksamkeit auf sterile Technik die Gewebesektion außerhalb einer laminaren Durchflusshaube mit minimalem Kontaminationsrisiko durch.
  3. Sterilisieren Sie eine Sezierplatte, eine Mikrosezierende Schere, ein Paar Daumenverbandszange, zwei Paar Dumont #5 Pinzette, ein Mikrosezierendes Messer und einen Moria Mini perforierten Löffel, indem Sie vor der Verwendung in 70% Ethanol eintauchen.

3. PDL/Laminin Beschichtung von Geschirr/Coverslips

HINWEIS: Kultur dissoziierte primäre motorische Neuronen in 96 Brunnen oder 24 Brunnenplatten, abhängig von der Anzahl der Zellen, die für die Anwendung benötigt werden. Zellen können direkt in der Gewebekulturplatte ohne Verwendung von Decklippen abgebildet werden, wenn die Brunnen optisch transparent sind und die Dicken mit der Bildgebung kompatibel sind.

  1. Für Anwendungen, die Abdeckungen benötigen, bereiten Sie säuregereinigte, sterilisierte und luftgetrocknete Abdeckungen mindestens 2 Tage vor der Neuronenisolation vor, wie zuvor beschrieben30. Chargen von Coverlips können auf diese Weise rechtzeitig vor Experimenten hergestellt und bis zu 6 Monate ohne Auswirkungen auf die experimentelle Qualität gelagert werden.
  2. Bereiten Sie 2 Tage vor der Neuronenisolation eine Arbeitslösung aus 20 g/ml Polyd-Lysin (PDL) in phosphatgepufferter Saline (PBS) vor.
    1. Aliquot PDL (1 mg/ml) im Voraus und bei -20 °C als Lagerlösung lagern.
  3. Bedecken Sie die Oberfläche jedes Abdeckrutsches oder des Brunnens der Gewebekulturplatte mit ausreichender PDL-Lösung (z. B. 100 l pro Brunnen auf 96 Wellplatten oder 500 l pro Brunnen auf 24 Wellplatten mit oder ohne Decklippen). Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  4. Am nächsten Tag 3x mit sterilisiertem Wasser waschen.
    1. Versiegeln Sie die Platten mit Paraffinfolie und lagern Sie die gewaschenen PDL-beschichteten Platten bei 4 °C bis zu 1 Monat, wenn sie nach der letzten Wäsche vollständig getrocknet werden.
  5. Bereiten Sie eine Arbeitslösung mit 10 l Laminin (1,1 x 1,2 mg/ml) in 1,2 ml PBS vor.
    1. Aliquot Lamininvorräte (1,1 bis 1,2 mg/ml) im Voraus und bei -80 °C lagern.
  6. Bedecken Sie die Oberfläche jedes Coverslips oder gut mit genügend Lamininlösung, um die Oberfläche gleichmäßig zu beschichten. Vor der Anwendung mindestens 2 h bei 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: PDL/lamininbeschichtete Platten und Decklippen können bis zu 1 Woche bei 37 °C gelagert werden, aber es wird frisch beschichtetes Laminin bevorzugt. Laminin direkt vor der Beschichtung30entfernen. Laminin darf nicht austrocknen. Wenn die Platten länger als mehrere Stunden gelagert werden sollen, sollten sie in Paraffinfolie eingewickelt werden.

4. Vorbereitung von Dissektions-, Motorneuron-Kulturmedien und Dissoziationslösungen

HINWEIS: Die Konzentrationen in Klammern geben die Endkonzentrationen jedes Reagenzes an.

  1. Bereiten Sie das Seziermedium vor.
    1. Das wärmeaktivierte Pferdeserum über Nacht bei 4 °C auftauen, 1 ml Aliquots vorbereiten und bei -20 °C lagern. Thaw Aliquots bei RT direkt vor gebrauchen.
    2. B27-Ergänzung (50x) in 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern. Thaw aliquots bei RT unmittelbar vor gebrauch. Vermeiden Sie Gefrier-/Tauzyklen.
    3. Glutamin-Ergänzung (100x) bei 4 °C oder -20 °C lagern. Bei Lagerung bei -20 °C in 0,5 ml Aliquots aufteilen.
    4. Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) in 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern. Thaw aliquots bei RT unmittelbar vor gebrauch.
    5. Um das Sezieren medium zu machen, Mischen Sie 9,4 ml Hibernate E mit 200 l Pferdeserum (2%), 200 l 50x B27-Zulage (1x), 100 l 100-L mit 100-fachem Glutamin-Zusatz (1x) (z.B. GlutaMAX) und 100 l mit 10.000 U/mL Penicillin-Streptomycin (100 U/ml). Verwenden Sie dieses Medium zum Sammeln von seziertem Gewebe und zur endgültigen Suspension von dissoziierten Zellen.
    6. Fügen Sie 500 l des Dissektionsmediums zu einzelnen 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren für die Gewebesammlung am Tag vor der Neuronenisolation hinzu. Bereiten Sie ein Rohr für jeden Gewebetyp vor, der gesammelt wird (z. B. Positivkontrolle, Negativkontrolle, CN3/CN4, SMN) und lagern Sie vor der Verwendung bei 4 °C.
    7. Kombinieren Sie 49 ml Hibernate E Low Fluoreszenzmedien mit 1 ml B27-Beilage (1x) und füllen Sie eine 24-Well-Platte mit diesem Medium (2 ml/gut) am Tag vor der Neuronenisolation. Verwenden Sie diese Schale zum Sammeln von Mausembryonen. Vor der Anwendung bei 4 °C lagern.
  2. Bereiten Sie das Medium motorische Neuronenkultur vor.
    1. Bereiten Sie 250 L Aliquots von 25 mM 2-Mercaptoethanol in Leibovitz' L15 Medium vor. Bei -20 °C lagern.
    2. Generieren Sie 5 L-Aliquots von 100 g/ml-Lösungen von BDNF, CNTF und GDNF, die in sterilisiertem Wasser verdünnt werden. Bei -80 °C auftauen und bei RT unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
    3. Bereiten Sie die 10 mM Forskolin-Lösung vor, indem Sie 64 l Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 5 mg (1,0670 m) Forskolin und Wirbel gut auflösen. Dann sterilisiertes Wasser (1.003 ml) in die DMSO-Lösung geben und gut wirbeln. 12 L Aliquots von 10 mM Forskolin bei -20 °C lagern und unmittelbar vor Gebrauch bei RT auftauen.
    4. Bereiten Sie 12 L Aliquots von 100 mM Isobutylmethylxanthin (IBMX) in DMSO verdünnt. Bei -20 °C auftauen und bei RT unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
    5. Um die motorische Neuronenkultur mittelzumachen, mischen Sie 9,4 ml neurobasales Medium mit 200 l Pferdeserum (2%), 200 l 50x B27-Ergänzung (1x), 100 l 100x Glutamin-Ergänzung (1 x), 100 l mit 10.000 U/m: Penicillin-Streptomycin (100 U/ml) und 20 l 25 mM 2-Mercaptoethanol (50 'M), vorzugsweise direkt vor der Anwendung. Dieser Schritt kann bis zu 1 Tag vor der Neuronenisolation durchgeführt werden.
    6. Kurz vor der Verwendung fügen Sie dem Motorneuronen-Kulturmedium 10 0l/ml (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL) und GDNF (10 ng/mL) und 10 l mit 10 mM Forskolin (10 m) und 10 l mit 100 mM IBMX (100 mM) hinzu. Das Medium auf 37 °C vorwärmen.
  3. Bereiten Sie die Dissoziationslösungen vor.
    1. Bereiten Sie die Papainlösung (20 U/ml Papain und 0,005% DNase) und eine Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung (1 mg/ml Ovomucoid-Inhibitor, 1mg/ml Albumin und 0,005% DNase) nach den Anweisungen des Herstellers vor.
    2. Bereiten Sie 500 L Aliquots von jedem Ovomucoid-Inhibitor und Papain-Lösungen vor und lagern Sie bei -80 °C. Mindestens bei 37 °C auftauen.

5. Ventrale Mittelhirn- und Rückenmarkszerlegung

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte mit Ausnahme der Schritte 5.1.1-5.1.3 und 5.1.5-5.1.6 unter einem Fluoreszenz-Dissektions-Stereomikroskop aus. Die Gesamtdissektionszeit pro Experiment beträgt in der Regel 3-5 h, abhängig von der Beherrschung der Seziertechnik und der Anzahl der für jedes Experiment erforderlichen motorischen Neuronen.

  1. Ventrale Mittelhirnsektion
    1. Euthanisieren Sie eine schwangere Maus etwa 11,5 Tage nach der Befruchtung durch Kohlendioxidgas und Zervixdislokation.
    2. Sprühen Sie den Bauch gründlich mit Ethanol und entfernen Sie die Gebärmutter mit steriler Mikrosesektierungsschere und Daumenverbandszange. Waschen Sie die Gebärmutter kurz in sterilem PBS, dann auf die Sezierplatte mit vorgekühlten sterilen PBS gefüllt übertragen.
    3. Entfernen Sie die IslMN:GFP-positivenEmbryonen vorsichtig aus der Gebärmutter mit sterilen Mikrosezierenscheren, Daumenverbandszangen und Dumont #5 Pinzette in eiskalten sterilen PBS unter dem hellen Licht des Mikroskops. Übertragen Sie jeden Embryo mit einem sterilen Moria Mini-Perforat-Löffel in einen separaten Brunnen einer 24-Well-Platte, gefüllt mit vorgekühltem Hibernate-E-Low-Fluoreszenzmedium, ergänzt mit 1x B27. Halten Sie die 24 Brunnenplatte auf Eis.
    4. Einen Embryo auf eine sterile Sezierplatte übertragen und vollständig mit der eiskalten sterilen Hank-Ausgewogene Salzlösung (HBSS) bedecken.
    5. Stellen Sie sicher, dass die Sezierschritte unter Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Beleuchtung des Mikroskops durchgeführt werden. Entfernen Sie mit einer Pinzette den Schwanz und das Gesicht des Embryos, ohne das Mittelhirn zu beschädigen (Abbildung 2Ba). Platzieren Sie den Embryo anfällig mit Gliedmaßen, die unter und Schwanz nach vorne zeigen, in Richtung des Dissektors (angezeigt durch ein Sternchen, Abbildung 2Bb).
    6. Mit einer Pinzette wird das Dach des vierten Ventrikels aufgeschlitzt, um eine kleine Öffnung zu erzeugen. Verwenden Sie diese Öffnung, um eine Pinzette in den Raum zwischen dem vierten Ventrikel und seinem Dach einzuhaken. Sezieren Sie entlang der dorsalen Oberfläche des Embryorostrals zum Kortex und seitlich zur Bodenplatte und Motorsäule (Abbildung 2Ca,b). Öffnen Sie das sezierte Gewebe in einer offenen Buchweise, um die GFP-positiven CN3- und CN4-Kerne zu enthüllen.
      HINWEIS: Ein kleines Stück Gewebe aus dem ventralen Mittelhirn, das Mesenchym, CN3 und CN4 enthält, wird nun freigelegt.
    7. Trennen Sie vorsichtig das ventrale Mittelhirn vom Embryo und entfernen Sie Meningealgewebe mit einer Pinzette und einem Mikrotrennmesser. Sezieren Sie die bilateralen GFP-positiven CN3- und CN4-Kerne weg von der Bodenplatte und anderen GFP-negativen Umgebensgeweben mit einer Pinzette und einem Mikrosezierendes Messer (Abbildung 2D). Maximieren Sie die Anzahl der GFP-positiven motorischen Neuronen im ausgeschnittenen Gewebe, vermeiden Sie es jedoch, sie zu berühren oder zu beschädigen.
    8. Wenn eine Sammlung von separaten CN3- und CN4-Kernen gewünscht wird, entlang der Mittellinie dieser beiden Kerne schneiden (gelbe gepunktete Linie in Abbildung 2D). Mit einer P1000 Pipette das sezierte ventrale Mittelhirngewebe mit minimalem HBSS sammeln und in ein mit Dissektionsmedium gefülltes 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr legen (siehe Schritt 4.1.5). Auf Eis bis zur Dissoziation aufbewahren.
    9. Setzen Sie die Pooling ventralen Midbrains aus zusätzlichen Embryonen in der gleichen Röhre fort, bis die Gesamtzahl die experimentelle Anforderung erfüllt (siehe Schritt 8 für ideale Zellzahlen).
      HINWEIS: Eine gepoolte Sammlung von mindestens 10 ventralen Mittelhirnen, die etwa 1 x 104 CN3/CN4 Motorneuronen ergeben, wird empfohlen, da Gewebe während der Dissoziation und Sortierung Stress ausgesetzt sind.
  2. Ventrale Rückenmarkssektion
    1. Halten Sie den Embryo anfällig mit dem Kopf nach vorne des Mikroskops, in Richtung des Dissektors. Halten Sie den Embryo mit einer Pinzette und legen Sie die Spitze des anderen Pinzettenpaares in den ungeöffneten kaudalen Teil der vierten Herzkammer ein.
    2. Öffnen Sie den Rest des Hinterhirns und des Rückenmarks dorsal über die gesamte rostrocaudale Ausdehnung des Embryos. Öffnen Sie durch Schneiden von rückendem Gewebe, beginnend mit dem vierten Ventrikel und Arbeiten in Richtung des zentralen Kanals des kaudalen Rückenmarks mit den Zangen als Schere (Abbildung 2Ca,b). Achten Sie darauf, das ventrale Rückenmark während dieses Eingriffs zu berühren oder zu beschädigen.
    3. Halten Sie den Embryo mit einer Pinzette und kneifen Sie die Klappe des Rückengewebes auf jeder Seite mit dem anderen Paar Pinzette (Abbildung 2Ea,b).
      HINWEIS: Ausgeschnittene dorsale Gewebe enthalten dorsale Haut, Mesenchym, dorsale Wurzelganglien (DRGs), dorsales Hinterhirn und Rückenmark. Entfernen Sie so viel wie möglich von diesen Geweben, ohne die SMN-Kerne zu beschädigen, da sie klebend sind und SMNs während der Filterung einfangen können oder während der FACS-Sortierung Verstopfungen verursachen können.
    4. Entfernen Sie das ventrale Rückenmark mit dem Mikrodissektionsmesser, um direkt unter dem GFP-positiven SMN zu durchdringen. Heben Sie das ventrale Rückenmark mit sägeartigen Bewegungen auf beiden Seiten an (Abbildung 2Fa,b). Schneiden Sie das schwimmende ventrale Rückenmark quer direkt über C1, wo die ersten GFP-positiven vorderen Hornprojekte (Abbildung 2G). Auch quer an der oberen Grenze der unteren Extremität schneiden (Abbildung 2G). Entfernen Sie nach diesem Eingriff den zervikalen (C1)-Lumbar (L2-L3) Teil des ventralen Rückenmarks.
    5. Legen Sie das ventrale Rückenmark dorsale Seite nach oben und halten Sie, indem Sie das GFP-negative Gewebe zwischen die GFP-positiven SMN-Säulen mit einer Pinzette drücken. Entfernen Sie das verbleibende angebrachte Mesenchym, DRGs und rückenförmiges Rückenmark, indem Sie beide Seiten der GFP-positiven SMN-Säule mit dem Mikrodissektionsmesser beschneiden (Abbildung 2H). Achten Sie darauf, GFP-positive motorische Neuronen zu maximieren, ohne sie zu beschädigen.
    6. Mit einer P1000 Pipette das sezierte ventrale Rückenmarksgewebe mit minimalem HBSS sammeln und in das SMN-markierte 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr mit Dissektionsmedium legen. Auf Eis bis zur Dissoziation aufbewahren. Pooling ventralen Rückenmark aus zusätzlichen Embryonen in der gleichen Röhre, bis die Gesamtzahl die experimentellen Anforderungen erfüllt.
      HINWEIS: Das Sammeln von mindestens drei ventralen Rückenmark mit ca. 2,1 x 104 SMN wird empfohlen, da Gewebe bei der Dissoziation und Sortierung Stress ausgesetzt sind.
    7. Sammeln Sie gesichtsmotorische Neuronen und Extremitäten der Isl MN:GFP-Mausembryonen als GFP-positive und GFP-negative Kontrollen für fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Extremitäten sind GFP-negativ, da sich die GFP-positiven Axone der SMNs in diesem embryonalen Zeitalter noch nicht in die Extremitäten ausgedehnt haben.

6. Gewebedissoziation

HINWEIS: Die Gesamtdissoziationszeit beträgt in der Regel 1,5 h pro Experiment.

  1. Warmes Papain und Albumin-Ovomucoid-Inhibitor-Lösung aliquotiert bis 37 °C 30 min vor der Dissoziation.
  2. Drehen Sie mikrosezierte gewebe mit geringer Geschwindigkeit kurz herunter.
  3. Mit einer P100 Pipette, vorsichtig entfernen Sie so viel Hibernate E wie möglich, ohne Gewebe zu aspitrieren.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, alle restliche Hibernate E nach diesem Schritt zu entfernen, um zu vermeiden, die Wirksamkeit der Papain-Dissoziation im nächsten Schritt zu reduzieren.
  4. Fügen Sie jedem der 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren, die die mikrosezierten Gewebeproben enthalten, das entsprechende Volumen der Papainlösung (Tabelle 1) hinzu.
    HINWEIS: Das geeignete Volumen von Papain für die Dissoziation wurde bestimmt, um die effektive Dissoziation zu maximieren und gleichzeitig die Belastung der Zellen zu minimieren.
  5. 8x mit einer P200 Pipette sanft trituieren. Führen Sie alle Triturationsschritte schonend durch, um die Motorneuronenlebensfähigkeit zu erhalten.
  6. Inkubieren Sie die Rohre, die die Gewebe für 30 min bei 37 °C enthalten, rühren durch Fingerstreich10x alle 10 min. Jede Suspension 8x mit einer P200 Pipette nach der Inkubation sanft trituieren. Drehen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min.
  7. Um die Wirksamkeit der Ovomucoid-Hemmung im nächsten Schritt zu gewährleisten, verwenden Sie eine P1000 Pipette, um so viel Überstand wie möglich zu entfernen und zu entsorgen, ohne das Gewebe zu aspirating.
  8. Pellets in der entsprechenden Menge der Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung (Tabelle 1) durch sanftetrituierende 8x mit einer P200 Pipette resuspendieren.
  9. Warten Sie 2 min, damit sich die verbleibenden Teile des nicht soziierten Gewebes an der Unterseite des Rohres absetzen können.
  10. Sammeln Sie so viel Überstand wie möglich, ohne unsoziale Gewebe mit einer P200 Pipette zu aspitrieren. Übertragen Sie den Überstand auf frische 1,7 ml Mikrozentrifugenrohre.
  11. Wenn einige Gewebestücke nach Schritt 6.10 unverbunden bleiben, wiederholen Sie die Schritte 6.8-6.10 für die nicht soziierten Gewebe, die in den ursprünglichen 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren verbleiben, um die Endausbeute dissoziierter Zellen zu maximieren und gleichzeitig die Belastung der Zellen zu minimieren und gleichzeitig die Belastung der Zellen zu minimieren. zuvor dissoziiert, enthalten im Überstand von Schritt 6.10.
  12. Drehen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P1000 Pipette.
  13. Setzen Sie das Pellet im entsprechenden Volumen des Seziermediums (Tabelle 1) durch Pipettieren von 8x mit einer P1000 Pipette aus. Das entsprechende Volumen der Endsuspension wurde so bestimmt, dass die Zelldichte 107 Zellen/ml nicht überschreitet, was den Strom der Durchflusszytometriemaschine blockieren kann, aber auch, dass die Zellen nicht übermäßig verdünnt werden, was zu einer verlangsamten Sortiergeschwindigkeit führt.
  14. Filtern Sie die Suspensionen durch 70 m Zellsiebe, um große Klumpen oder unverdautes Gewebe zu eliminieren. Die Suspensionen in 5 ml runde Polystyrol-Reagenzgläser übertragen und auf Eis lagern, bis es erforderlich ist.

7. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit einem FACS-Sortierer optimiert, der mit einem 15 mw 405 nm violetten Laser, einem 100 mw 488 nm blauen Laser, einem 75 mw 594 nm orangen Laser und einem 40 mw 640 nm roten Laser ausgestattet ist. Die Zellen wurden als Mantelflüssigkeit in sterilem PBS unter aseptischen Bedingungen durch eine 100-m-Düse sortiert. Um die Zellspannung zu minimieren, wurde die Durchflussrate auf einen Probendruck von 1 bis 3 eingestellt, so dass maximal 1.000 bis 4.000 Ereignisse pro Sekunde erfasst wurden. Die Gesamt-FACS-Zeit beträgt in der Regel 1 x 2 H pro Experiment.

  1. Richten Sie Spannungen für vorwärts- und seitenstreuende Spannungen ein, damit die Zellpopulation richtig visualisiert werden kann. Das Einrichten geeigneter Spannungen für die Zellsortierung ist komplex und erfordert einen erfahrenen FACS-Betreiber.
  2. Um verschiedene Zellpopulationen zu unterscheiden, zeichnen Zellen basierend auf der Größe, die durch den Vorwärtsstreubereich (FSC-A) bestimmt wird, im Vergleich zur internen Komplexität, die durch den Side Scatter Area (SSC-A) bestimmt wird. Zeichnen Sie ein Tor um die lebenden Zellen, wie in Abbildung 3Aa und Abbildung Ba angegeben, um Trümmer und abgestorbene Zellen auszuschließen. Gruppieren Sie die Zellen innerhalb des gated-Bereichs als Grundgesamtheit 1 (P1).
  3. Um Zellklumpen und Doublets auszuschließen, zeichnen Sie Als nächstes P1-Zellen basierend auf der Side Scatter Width (SSC-W) im Vergleich zum SSC-A. Gate die Population der einzelnen Zellen als Population 2 (P2) (Abbildung 3Ab und Abbildung Bb).
  4. Plot P2-Zellen basierend auf der Vorwärtsstreubreite (FSC-W) im Vergleich zu FSC-A und Gate der Grundgesamtheit einzelner Zellen als Grundgesamtheit 3 (P3) (Abbildung 3Ac und Abbildung Bc).
    HINWEIS: Die Verwendung von zwei aufeinanderfolgenden Toren in 7.3 und 7.4 schließt Zellklumpen und Doublets (hohe FSC-W und hohe FSC-A) aus.
  5. Gate P3-Zellen basierend auf GFP versus Allophycocyanin (APC). Der APC-Kanal erkennt die Autofluoreszenz. Durch das Gating auf diesem Kanal wird die Erfassung autofluoreszierender Zellen vermieden. Verwenden Sie GFP-negative Zellen, um die Spannung für FITC/GFP-Leuchtstoffkanäle anzupassen. Idealerweise positionieren Sie Tore für diese Zellpopulationen um 102. Wählen Sie die Gate-Schwellenwerte für die GFP-positive Population 4 (P4) einzeln für jeden Motorneurontyp aus (Abbildung 3Anzeige und Abbildung Bd).
    HINWEIS: Stellen Sie das GFP-Gate für SMNs viel höher ein als für CN3s/CN4s, um eine reine Kultur zu erhalten (Abbildung 3Anzeige und Abbildung Bd). Ein niedrigeres GFP-Tor für SMN-Kulturen führt zur Kontamination der Kulturen durch Glia und nicht-motorische Neuronen. Dies ist wahrscheinlich, weil es Low-Level-GFP-Expression in einigen Glia und nicht-motorischen Neuronen aufgrund eines undichten Promoter. Der Prozentsatz der GFP-positiven Zellen im Vergleich zu Gesamtzellen beträgt in der Regel 0,5 bis 1,5 % für CN3s/CN4s und 1,5 %2,5 % für SMNs. Wenn die Sezierung erfolgreich war, können diese Zahlen als Benchmark verwendet werden, um die geeignete Position für das GFP-positive Gate zu bestimmen (Abbildung 3Ae und Abbildung Be).
  6. Führen Sie FACS gemäß dem Herstellerprotokoll aus. Sammeln Sie P4-Zellen in frische 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren, die mit 500 l motorischem Neuronenkulturmedium gefüllt sind. Auf Eis bis zum Plattieren aufbewahren.
    HINWEIS: Obwohl die Zellen direkt in die Brunnen sortiert werden können, führt dies zu einer ungleichmäßigen Anzahl von Zellen pro Brunnen. Sortieren Sie die Zellen in 1,75 ml Mikrozentrifugenrohre und verschichten Sie dann manuell, um eine gleichmäßigere Beschichtungsverteilung zu erreichen.

8. Kultur der gereinigten primären Motorneuronen

  1. Verdünnt FACS-isolierte CN3/CN4- und SMN-Suspensionen mit motorischem Neuronenkulturmedium auf 37 °C auf Dichten von 5 x 103 bzw. 1 x 104 Zellen/ml vorgewärmt.
    HINWEIS: Ein E11.5 Embryo liefert etwa 1 x 103 CN3/CN4 und 7 x 103 SMN. Diese Erträge hängen jedoch stark von der Reinheit von sezierten Geweben, der Gründlichkeit der Zelldissoziation und der entsprechenden Schwellenvon GFP-Gattern während der FACS ab.
  2. Übertragen Sie 96 mit PDL und Laminin vorbeschichtete Wellplatten aus dem 37 °C Gewebekultur-Inkubator auf die laminare Strömungshaube und Aspiratlaminin aus jedem Brunnen. Verwenden Sie Teller und Decklippen sofort ohne waschen.
  3. Fügen Sie 200 L verdünnte CN3/CN4- und SMN-Aufhängungen in die einzelnen Bohrungen von PDL/Laminin-beschichteten 96-Wellplatten ein. Die endgültige Zelldichte sollte 1 x 103 und 2 x 103 Zellen/Well für CN3/CN4 bzw. SMN betragen.
    HINWEIS: Die anfängliche Beschichtungsdichte von SMNs in 96 Bohrplatten (2 x 103 Zellen/Well) ist doppelt so hoch wie die von CN3s/CN4s (1 x 103 Zellen/Well), um ähnliche endgültige motorische Neuronenzahlen und Dichten bei 2 und 9 Tagen in vitro (DIV) (4x6 x 102 bzw. 2x4 x 102 Zellen pro Brunnen) zu erhalten.
  4. Kulturneuronen in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
  5. Füttern Sie Neuronen alle 5 Tage, indem Sie die Hälfte der alten Medien (100 l) entfernen und durch das gleiche Volumen des frischen motorischen Neuronenkulturmediums ersetzen. Stellen Sie sicher, dass neuronale Prozesse auf 1 DIV sichtbar werden und um 14 DIV dicker und länger werden (Abbildung 4). Neuronale Zellkörper werden vergrößert und neigen dazu, sich in Langzeitkulturen zu aggregieren, insbesondere bei SMNs (Abbildung 4).
    HINWEIS: Führen Sie alle Medien- und Lösungsänderungen durch, indem Sie die Hälfte des ursprünglichen mittleren Volumens belassen, um das Lösen kultivierter Zellen zu vermeiden. Dazu gehören Fixierungs- und Immunzytochemie (ICC) Schritte. Wenn alle Medien entfernt werden, unabhängig davon, wie sanft, werden die meisten Zellen ablösen und weggewaschen werden.

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Ergebnisse

Ziel dieses Protokolls war es, sowohl primäre CN3s/CN4s als auch SMNs langfristig hoch zu reinigen und zu kultivieren, um vergleichende Analysen der Mechanismen zu ermöglichen, die motorischen Neuronenstörungen zugrunde liegen (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 zur Übersicht).

Sobald Neuronen erfolgreich isoliert und in der Kultur angebaut wurden, wurden fast reine prim...

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Diskussion

Historisch gesehen haben sich In-vitro-Studien von CN3- und/oder CN4-Motorneuronen auf heterogene Kulturen wie dissoziierte17,18,19,20,21, Explant17,22,23,24,25,26...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) für den Unterricht in SMN-Sektionstechniken; die Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, die Immunology Division Flow Cytometry Facility der Harvard Medical School, The Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women es Hospital Flow Cytometry Core und Boston Children es Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neurons; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, weitere Engle-Labormitglieder und Mitglieder des Project ALS-Konsortiums für technische Hilfe und nachdenkliche Diskussion. Diese Studie wurde vom Projekt ALS unterstützt. Darüber hinaus wurde R.F. von der Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad und dem NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748 finanziert; J.J. wurde durch das NIH/NEI-Schulungsprogramm in den Molekularen Basen von Augenkrankheiten (5T32EY007145-16) durch das Schepens Eye Research Institute und durch das Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) durch das Boston Children es Hospital unterstützt; M.C.W wurde von NEI (5K08EY027850) und der Children es Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award) unterstützt. und E.C.E. ist ein Howard Hughes Medical Institute Investigator.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alexa Fluor 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110011:400
Alexa Fluor 594-konjugiertes F(ab')2-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110721:400
B27 Supplement (50x), serumfreiThermo Fisher Scientific17504-044
BD FACSAria llu SORP DurchflusszytometerBD Bioscience- Dies verfügt über 4 Lasersysteme, die mit 405-, 488-, 594- und 640-nm-Lasern ausgestattet sind.
BD Falcon 70μ m Nylon ZellsiebeCORNING352350Zum Filtern der dissoziierenden Zellen vor dem FACS.
BD Falcon Reagenzgläser mit rundem Boden und SchnappverschlussCORNING352054
BDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-207
Zellkultur-Mikroplatte, 96 Well, PS, F-Boden (Chimney Well)Greiner Bio-One International655090Wir haben mehrere 96-Well-Schalen ausprobiert und dies war die beste für Kultur und Analysen nach ICC
Circular Cover Glasses für die MikroskopieKarl Hecht & Assistent1001/14Wir haben dieses Deckglas verwendet, da die Fläche groß war (Durchmesser: 14 mm).
CNTF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-272
Cyclopiazonsäure aus Penicillium cyclopiumSigma-AldrichC1530CPA. Einer der Stressoren in der Notaufnahme.
4′,6-Diamidino-2-phenylinodol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
DimethylsulfoxidSigma-AldrichD2650DMSO
Dumont #5 Pinzette Inox Spitzengröße 0,05 mm x 0,01 mm Biologie SpitzenRoboz Chirurgisches InstrumentRS-5015
ForskolinThermo Fisher ScientificBP25205
GDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-305
GlutaMAX NahrungsergänzungsmittelThermo Fisher Scientific35050-061
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175-095
Hibernate EBrainBitsHE
Hibernate E niedrige FluoreszenzBrainBitsHELFDie Fluoreszenz, die die Beobachtung der GFP-Expression des Embryos behindert, sollte niedrig sein.
Pferdeserum, hitzeinaktiviert, neuseeländischen UrsprungsThermo Fisher Scientific26050-070
IBMXTocris Cookson2845Isobutylmethylxanthin
LamininThermo Fisher Scientific23017-015
Leibovitz s L15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Mikro-PräparierschereRoboz Chirurgisches InstrumentRS-5913
Mikromesser 4,75" 1,7 mm x 27 mm KlingeRoboz Chirurgisches InstrumentRS-6272
Moria Mini Perforierter LöffelFeinwissenschaftliche Werkzeuge10370-19
Monoklonaler Maus-Antikörper gegen neuronales Klasse-III&beta-Tubulin (TUBB3)BioLegend8012021:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti Lebendzell-Fluoreszenzmikroskop und Elements-SoftwareNikon-DifferentielleInterferenzkontrastbilder und immunzytochemische Bilder der Zellkulturen wurden mit diesen Geräten aufgenommen
Salpetersäure 90%, Rauchend (ACS-zertifiziert)Fisher ScientificA202-212Zum Spülen von Deckgläsern
Olympus 1,7 mL Mikroröhrchen, klarGenesee Scientific22-281Dies sind die Röhrchen, die wir in diesem Zusammenhang als "1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen" bezeichnet haben.
Papain-DissoziationssystemWorthington Biochemical CorpLK003150Papain-Lösung und Alubumin-Ovomucoid-Inhibitor-Lösung werden aus diesem Kit hergestellt.
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-023
Poly-D-Lysin (PDL)MilliporeSigmaA-003-E
Monoklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Islet1Abcamab109517:200
SMZ18 und SMZ1500 Zoom-Stereomikroskope mit DS-Ri1 Eswurde eine Nikon-Dissektion durchgeführt und Bilder von präparierten Embryonen und Geweben werden unter diesen Fluoreszenzmikroskopen aufgenommen.
Sylgard 170 Schwarz Silikonverkapselung - A+B 0,9 kg KitDow Corning1696157Mit diesem Kit stellen wir Sezierschalen her.
TC-behandelte Schalen, 100 mm x 20 mmGenesee Scientific25-202Wir stellen Präparierschalen mit dieser Schale her.
Thum Verbandzange 4,5" gezahnt 2,2 mm SpitzenbreiteRoboz Chirurgisches InstrumentRS-8100
Schallkopf für LOGOQ e VETGE HealthcareL8-18i-RSFür Ultraschall an weiblichen
Mäusen Veterinär-UltraschallgerätGE HealthcareLOGOQ e VETFür Ultraschall an weiblichen Mäusen
Zeiss LSM 700 Serie Laser-Scanning-Konfokalmikroskop und Zen-SoftwareCarl Zeiss-Das konfokale Bild des Embryos wurde mit diesen Geräten aufgenommen
Verifizierter Lieferant - 1

Referenzen

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Okulomotorische NeuronenTrochlearneuronenIsl1 GFP M useFACS ZellisolationGewebedissektionprim re NeuronkulturAufreinigung von MotoneuronenEmbryonalstag 115GFP positive Zellen
Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Islmn:GFP Transgene Mäuse
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