Methodenartikel

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen

DOI:

10.3791/60446

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31. Mai 2020

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1Department of Marine Biology and Ecology, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Science, University of Miami, 2Department of Biology, University of Miami, 3The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology, and Genetics, Faculty of Health Sciences, and Regenerative Medicine and Stem Cell Research Center, Ben Gurion University of the Negev

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Korallen schaffen biodiverse Ökosysteme, die sowohl für Den Menschen als auch für Meeresorganismen wichtig sind. Allerdings verstehen wir immer noch nicht das volle Potenzial und die Funktion vieler Korallenzellen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung, Kennzeichnung und Trennung von Steinkorallenzellpopulationen vor.

Zusammenfassung

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Korallenriffe sind durch anthropogene Stressoren bedroht. Die biologische Reaktion der Korallen auf diese Stressoren kann auf zellulärer Ebene auftreten, aber die Mechanismen sind nicht gut verstanden. Um die Reaktion von Korallen auf Stressoren zu untersuchen, benötigen wir Werkzeuge zur Analyse zellulärer Reaktionen. Insbesondere brauchen wir Werkzeuge, die die Anwendung von funktionellen Assays erleichtern, um besser zu verstehen, wie Zellpopulationen auf Stress reagieren. In der aktuellen Studie verwenden wir fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um verschiedene Zellpopulationen in Steinkorallen zu isolieren und zu trennen. Dieses Protokoll umfasst: (1) die Trennung von Korallengeweben vom Skelett, (2) die Schaffung einer Einzelzellsuspension, (3) die Kennzeichnung der Korallenzellen mit verschiedenen Markern für die Durchflusszytometrie sowie (4) Gating- und Zellsortierstrategien. Diese Methode wird es Forschern ermöglichen, auf zellulärer Ebene an Korallen für Analysen, funktionelle Assays und Genexpressionsstudien verschiedener Zellpopulationen zu arbeiten.

Einleitung

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Korallenriffe sind eines der wichtigsten Ökosysteme der Erde. Sie erleichtern die biologische Vielfalt, indem sie kritische Lebensräume für Fische und wirbellose Tiere schaffen, und sind von entscheidender Bedeutung für die Erhaltung anthropogener Gemeinschaften durch die Bereitstellung von Nahrungsmitteln und wirtschaftlicher Existenzgrundlage durch Den Tourismus1. Als wichtiger Erbauer von Korallenriffen unterstützt das Korallentier (Phylum: Cnidaria) auch Küstengemeinden, indem es große Kalziumkarbonatgerüste schafft, die Wellen- und Sturmschäden mildern2.

Korallen als Erwachsene sind sessi....

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Protokoll

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1. Trennung von Geweben vom Korallenskelett über Airbrush und Kompressor

HINWEIS: Führen Sie Schritte auf Eis aus und schützen Sie die Hände mit Handschuhen.

  1. Montieren Sie den Airbrush-Kit, indem Sie den Luftkompressor, den Schlauch und die Airbrush anschließen (Abbildung 2). Stellen Sie das Manometer zwischen 276-483 kPa ein.
    HINWEIS: Der empfohlene Kompressor und Luftschlauch, der für diese Studie verwendet wurde, wurde auf einen maximalen Druck von 393 kPa voreingestellt. Die Verwendung außerhalb dieses 276-483 kPa-Bereichs kann entweder zu einer unzureichenden Zellentfernung aus dem Skelett ode....

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Ergebnisse

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Insgesamt ist dieses Protokoll nützlich, da es die Identifizierung und Sammlung von lebenden Korallenzellpopulationen erleichtert, die für funktionelle Analysen verwendet werden können. Der Arbeitsablauf begann mit der mechanischen Trennung von Korallengeweben vom darunter liegenden Calciumcarbonatskelett (Abbildung 1). Dies ist einer der wichtigsten ersten Schritte, da unsachgemäße Technik zu einer hohen Zellsterblichkeit führt und große Mengen an Schutt ver.......

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Diskussion

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Dieses Protokoll wurde von Rosental et al.18 adaptiert und zur Identifizierung und Isolierung von P. damicornis Zellen entwickelt. Die Methodik konzentriert sich auf den Prozess der Filterung von Proben, um Trümmer, nicht lebensfähige Zellen und Symbiodiniaceae-gehostete Zellen durch die Untersuchung von zellinintrinen Faktoren, einschließlich der relativen Zellgröße, der relativen Zellgranularität, der Zellautofluoreszenz und des Vorhandenseins intakter Zellmembranen, zu entfernen. Diese.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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NTK möchte die University of Miami Research Awards in Natural Sciences and Engineering für die Finanzierung dieser Forschung würdigen. Der BR dankt Alex und Ann Lauterbach für die Finanzierung des Comparative and Evolutionary Immunology Laboratory. Die Arbeit des BR wurde von der Israel Science Foundation (ISF) Unterstützt: 1416/19 und 2841/19, und HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Wir danken Zhanna Kozhekbaeva und Mike Connelly für die technische Unterstützung. Wir möchten uns auch bei der University of Miami, der Flow Cytometry Shared Resource der Miller School of Medicine am Sylvester Comprehensive Cancer Center für den Zugang zum FACS-Zytometer und Shannon Saigh ....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Airbrush Set & KompressorTCP GlobalABD KIT-H-SETPaasche H-Serie Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit mit Master TC-20 Kompressor & Luftschlauch
BD FACSAria IIBD644832
KnochenschneiderBulk Reef Supply205357Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter
Cell StrainerCorning35234040 um; BD Falke; einzeln verpackt; keimfrei; Nylon
CellRox GreenLife TechnologiesC104442,5 mM in DMSO; Anregung/Emission: 485/520 nm
AuffangbeutelGrainger38UV35Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Wiederverschließbarer Polybeutel mit Reißverschluss, transparent; 2 mil Dicke
DAPIInvitrogenD130610mg in H2O; Anregung/Emission: 358/461 nm
Fötales KälberserumSigma-AldrichF2442-100MLHitzeinaktiviert bei 57 &de; C für 30 Minuten
HämazytometerSigma-AldrichZ359629Bright-Line Hämazytometer
HEPES PufferSigma-AldrichH0887
LysoTracker Deep RedLife TechnologiesL124921mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm
MikrozentrifugenröhrchenVWR87003-2941,7 mL
Phophat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco70011-044pH 7,4; 10X
Röhrchen mit rundem BodenVWR3520635 mL Polypropylen-Rundboden-Röhrchenspritze
BD3096281 mL BD Luer-Lok Spritze steril, Einweg-Polycarbonat

Referenzen

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  1. Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
  2. Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communicat....

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Schlagwörter

Isolierung von KorallenzellenDurchflusszytometrie AnalyseEinzelzellsuspensionGating von ZellpopulationenTrennung von Korallengewebelebende KorallenzellenFunktionsassaysGenexpressionsstudienZellsortierungsstrategien

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