Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen

Summary

Korallen schaffen biodiverse Ökosysteme, die sowohl für Den Menschen als auch für Meeresorganismen wichtig sind. Allerdings verstehen wir immer noch nicht das volle Potenzial und die Funktion vieler Korallenzellen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung, Kennzeichnung und Trennung von Steinkorallenzellpopulationen vor.

Abstract

Korallenriffe sind durch anthropogene Stressoren bedroht. Die biologische Reaktion der Korallen auf diese Stressoren kann auf zellulärer Ebene auftreten, aber die Mechanismen sind nicht gut verstanden. Um die Reaktion von Korallen auf Stressoren zu untersuchen, benötigen wir Werkzeuge zur Analyse zellulärer Reaktionen. Insbesondere brauchen wir Werkzeuge, die die Anwendung von funktionellen Assays erleichtern, um besser zu verstehen, wie Zellpopulationen auf Stress reagieren. In der aktuellen Studie verwenden wir fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um verschiedene Zellpopulationen in Steinkorallen zu isolieren und zu trennen. Dieses Protokoll umfasst: (1) die Trennung von Korallengeweben vom Skelett, (2) die Schaffung einer Einzelzellsuspension, (3) die Kennzeichnung der Korallenzellen mit verschiedenen Markern für die Durchflusszytometrie sowie (4) Gating- und Zellsortierstrategien. Diese Methode wird es Forschern ermöglichen, auf zellulärer Ebene an Korallen für Analysen, funktionelle Assays und Genexpressionsstudien verschiedener Zellpopulationen zu arbeiten.

Introduction

Korallenriffe sind eines der wichtigsten Ökosysteme der Erde. Sie erleichtern die biologische Vielfalt, indem sie kritische Lebensräume für Fische und wirbellose Tiere schaffen, und sind von entscheidender Bedeutung für die Erhaltung anthropogener Gemeinschaften durch die Bereitstellung von Nahrungsmitteln und wirtschaftlicher Existenzgrundlage durch Den Tourismus¹. Als wichtiger Erbauer von Korallenriffen unterstützt das Korallentier (Phylum: Cnidaria) auch Küstengemeinden, indem es große Kalziumkarbonatgerüste schafft, die Wellen- und Sturmschäden mildern².

Korallen als Erwachsene sind sessile Tiere, die eine breite Palette von endosymbiotischen Partnern beherbergen, einschließlich Viren, Archaeen, Bakterien, Protisten, Pilze, und vor allem, Mitglieder der Algendinoflagellate Familie Symbiodiniaceae³. Veränderungen in der Umwelt können zu Ungleichgewichten in dieser Gemeinschaft führen, die oft zu Krankheitsausbrüchen und Korallenbleiche führen, bei denen die symbiotischen Symbiodiniaceae aus der Korallenkolonie vertrieben werden, wodurch die Hauptnahrungsquelle für die Korallen beseitigt wird. Beide Szenarien führen oft zum Tod des Korallenwirts^4,5,6. Die Auswirkungen anthropogen-induzierter Stressoren, wie der schnelle Klimawandel, beschleunigen die Massensterben von Korallen, was zu einem globalen Rückgang der Korallenriffe führt⁷.

In jüngster Zeit wurden viele verschiedene Methoden entwickelt, um den Verlust von Korallenriffen zu mildern. Diese Methoden umfassen die Auspflanzung von Korallen auf bestehenden Riffen, genetische Kreuzung enthäute Genotypen und zelluläre Manipulation der mikrobiellen und symbiotischen Gemeinschaften, die innerhalb der^Korallen8^,9gehostet werden. Trotz dieser Bemühungen, viel bleibt unbekannt über Korallenzellvielfalt und Zellfunktion^10,11,12,13. Ein gründliches Verständnis der Vielfalt und Zellfunktion von Korallenzellen ist notwendig, um zu verstehen, wie sich der Korallenorganismus unter normativen und stressigen Bedingungen verhält. Die Bemühungen, die Wiederherstellungs- und Konservierungseffizienz zu maximieren, werden von einem verbesserten Verständnis der Kopplung von Zellvielfalt und Genfunktion profitieren.

Frühere Arbeiten über Zellvielfalt und Funktion konzentrierten sich in erster Linie auf histologische Studien und Ganzgewebe-RNA-Sampling^14,15,16,17. Um mehr Details über die spezifische Zelltypfunktion in Korallen zu erhalten, muss es Methoden für die Isolierung bestimmter Populationen lebender Korallenzellen geben. Dies wurde bei nichtklassischen Modellorganismen mit Hilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortiertechnologie (FACS) erfolgreich durchgeführt¹⁸. FACS verwendet eine Kombination von Lasern, die auf unterschiedliche Wellenlängen abgestimmt sind, um verschiedene endogene zelluläre Eigenschaften auf Einzelzellebene zu messen, wie z. B. relative Zellgröße, Zellgranularität und Autofluoreszenz. Zusätzlich können die Zellen durch fluoreszierend markierte Verbindungen gekennzeichnet werden, um spezifische, gewünschte Eigenschaften^18,19zu messen.

Bisher war die Anwendung der Durchflusszytometrie auf Korallenzellen hauptsächlich für die Analyse symbiotischer Symbiodiniaceae und anderer Bakterienpopulationen unter Verwendung ihrer starken, natürlichen Autofluoreszenz^20,21,22. FACS wurde auch verwendet, um die Größe des Korallengenoms zu schätzen, indem das fluoreszierende DNA-Markersignal im Vergleich zu den Zellen des Referenzmodellorganismus^23,24verwendet wurde. Die effiziente Anwendung von FACS bietet drei verschiedene Werkzeuge, die für zellbiologische Studien nützlich sind: 1) morphologische und funktionelle Beschreibung einzelner Zellen; 2) Identifizierung, Trennung und Isolierung spezifischer Zellpopulationen für nachgelagerte Studien; und 3) die Analyse von funktionellen Assays auf Einzelzellebene.

Die Entwicklung und Anwendung verschiedener exogener Fluoreszenzmarker für die Untersuchung von Korallenzellen bleibt nahezu unerforscht. Solche Marker können markierte Proteine, markierte Substrate für Enzyme oder fluoreszierende Reaktionen auf andere Verbindungen umfassen. Diese Marker können verwendet werden, um Zelltypen zu identifizieren, die eindeutige Eigenschaften aufweisen, z. B. das Hervorheben von Zellen, die unterschiedliche Mengen eines bestimmten Zellkompartiment-Features erzeugen, z. B. Lysosomen. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von fluoreszierend gekennzeichneten Perlen zur funktionellen Identifizierung von Zellen, die für die Phagozytose zuständig sind, oder die Verschleierung eines gezielten Erregers²⁵. Populationen von Zellen, die in Immunitätsreaktionen aktiv sind, können von FACS leicht identifiziert werden, nachdem diese exogen aufgetragenen Perlen verschlungen wurden. Während traditionelle histologische Methoden konserviertes Gewebe und viele Stunden benötigen, um den Prozentsatz der Zellen, die positiv für die Perlenverschlangen sind, anzunähern, kann ein FACS-basierter funktioneller Test für die Pathogeneinschließung relativ schnell an isolierten lebenden Zellen durchgeführt werden. Neben der Untersuchung zellspezifischer Reaktionen auf Stress hat diese Technologie das Potenzial, die genspezifische Expression zu klären und die Evolutions- und Entwicklungsgeschichte von Zelltypen zu beleuchten, die für Cnidarier völlig einzigartig sind, wie Calicoblasten und Cnidozyten.

Kürzlich führten wir ein intensives Screening von über 30 zellulären Markern durch, das zur Identifizierung von 24, die Korallenzellen kennzeichnen können, führte, von denen 16 nützlich sind, um einzigartige Populationen¹⁸zu unterscheiden, was sie zu Differenzierungsclustern (CD) macht. Hier beschreiben wir den Prozess der Korallenzellisolierung in Pocillopora damicornis von der Entfernung von Zellen aus dem Calciumcarbonat-Skelett bis zur Identifizierung und Isolierung spezifischer Zellpopulationen mit FACS (Abbildung 1).

Protocol

1. Trennung von Geweben vom Korallenskelett über Airbrush und Kompressor

HINWEIS: Führen Sie Schritte auf Eis aus und schützen Sie die Hände mit Handschuhen.

1. Montieren Sie den Airbrush-Kit, indem Sie den Luftkompressor, den Schlauch und die Airbrush anschließen (Abbildung 2). Stellen Sie das Manometer zwischen 276-483 kPa ein.
   HINWEIS: Der empfohlene Kompressor und Luftschlauch, der für diese Studie verwendet wurde, wurde auf einen maximalen Druck von 393 kPa voreingestellt. Die Verwendung außerhalb dieses 276-483 kPa-Bereichs kann entweder zu einer unzureichenden Zellentfernung aus dem Skelett oder zu einem Bruch der Zellmembranen führen. Dieser Bereich kann für jede Art unterschiedlich sein und kann einen Durchführbarkeitstest erfordern. Ein Durchführbarkeitstest kann mit einer Teilmenge der Zellschlämme mit einem einfachen Hämozytometer und einem 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Farbstoff-Ausschluss-Assay durchgeführt werden, der auf einem zusammengesetzten Mikroskop visualisiert wird.
2. Bereiten Sie 100 ml Zellfärbemittel in einem autoklavierten, steriler Glasbehälter durch Zugabe von 33 ml 10x phosphatgepufferter Saline (PBS; ohne Calcium und Magnesium) zu einer Endkonzentration von 3,3x, 2 ml fetalem Kalbsserum (FCS; bei 56 °C für 30 min inaktivierte Wärme) bis 2% des Gesamtvolumens und 2 ml 1 M HEPES Puffer bis zu einer Endkonzentration von 20 mM. Dann auf 100 ml mit sterilem Wasser abtopieren.
   HINWEIS: Die 3,3-fache PBS-Konzentration wurde gewählt, um den Salzgehalt von Meerwasser nachzuahmen, wie in Rosental et al.¹⁸gezeigt. Diese Konzentration muss für Arten, die in anderen Umgebungen gefunden werden, angepasst werden, um ihren Salzgehalt nachzuahmen.
3. 10 ml Zellfärbemittel in eine Airbrushflasche (in Abbildung 2mit "F" ) übertragen und den Adapterdeckel für den Airbrush-Anschluss befestigen.
   HINWEIS: Größere Fragmente und Arten mit dickeren Gewebeschichten erfordern möglicherweise mehr Medien für eine angemessene Gewebeentfernung.
4. Für die hier gezeigten verzweigten Korallenarten verwenden Sie einen Knochenschneider, um ein Korallenfragment mit einer Länge von etwa 3 x 5 cm oder einer Fläche von 4^cm2 zu beschneiden oder zu schneiden.
   HINWEIS: Das Fragment muss frei von Makroalgen und anderen mehrzelligen Organismen sein, da diese nicht aus der nachgelagerten Probe entfernt werden dürfen und die Probe während der FACS-Analyse- und Sortierprozesse kontaminieren. Ein 1 cm großes Fragment von P. damicornis ergibt nach dem Filtern, Färben und Waschen ca. 2x10 x 10⁶ Zellen.
5. Legen Sie das Korallenfragment in eine Plastiksammeltasche und sprühen Sie mit der Airbrush die Zellfärbungsmedien auf die Koralle (Abbildung 2). Setzen Sie diesen Prozess fort, bis der größte Teil des Skeletts freigelegt ist. Entfernen Sie das restliche Skelett aus der Sammeltasche.

2. Dissoziation von Zellen aus Korallengewebe

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis aus und schützen Sie die Hände mit Handschuhen.

1. Filtern Sie die Zellschlämme durch ein 40 m langes Nylonzellsieb in ein 50 ml Zentrifugenrohr, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
   HINWEIS: Verschiedene Zellsieb-Netzgrößen können für verschiedene Arten besser geeignet sein. Größere Größen können jedoch aufgrund von Schmutz und Zellklumpen zu einer unzureichenden Gewebedissoziation führen.
   1. Für Proben mit dickeren Schleimschichten verwenden Sie den sterilisierten Kolben einer 1 ml Kunststoffspritze und schleifen Sie ihn vorsichtig gegen den Filter, um Klumpen aufzubrechen und den Zellen zu helfen, das Sieb zu passieren. Spülen Sie bäuern und kolben mit Zellfärbemedien in das Zentrifugenrohr.
2. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 4 °C bei 450 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml Zellfärbungsmedien wieder auf.

3. Zellfärbung

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis aus und schützen Sie die Hände mit Handschuhen. Flecken, die in diesem Protokoll enthalten sind, dienen der Darstellung. Alternative Flecken erfordern unterschiedliche Konzentrationen und Inkubationszeiten.

1. Übertragen Sie 500 l resuspendierte Zellen in ein 5 ml Rundbodenrohr und legen Sie sie als Kontrollprobe beiseite. Fügen Sie diesem Aliquot keinen Fleck hinzu.
2. Zur verbleibenden Zellsuspension 0,42 l 12 mM DAPI-Lebensfähigkeitsfarbstoff (Materialtabelle), 1 L mit 5 M reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)(Materialtabelle)und 0,1 l mit 0,2 m Lysosom-Färbung(Materialtabelle)hinzufügen. Pipette gut zu mischen und inkubieren auf Eis für 30 min im Dunkeln, um Photobleichmittel zu verhindern.
   HINWEIS: DAPI wird in diesem Beispiel verwendet, um als DNA-Färbung und Lebensfähigkeitsfarbstoff für das Differentialgating abgestorbener Zellen auf der FACS-Maschine zu arbeiten. Dies setzt voraus, dass DAPI sterbende Zellen aufgrund der Membranintegrität durchdringt. Der ROS-Fleck strahlt Licht im Bereich von 520 nm (grün) aus, während der lysosomale Marker Licht bei ca. 668 nm (rot) aussendet.
3. Pellet 500 l der gefärbten Zellen durch Zentrifugation bei 4 °C bei 450 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 500 l Zellfärbungsmedien wieder auf. Auf ein neues 5 ml Rundbodenrohr übertragen und auf Eis lagern.

4. FACS-Start

HINWEIS: Die Schritte können je nach Herstellung und Modell des Zytometers aufgrund von Unterschieden in den Lasern und Kanälen variieren. Für dieses Protokoll wurde ein Zytometer mit 405, 488, 535 und 640 nm Wellenlängenlasern verwendet. Filter, die in diesem Protokoll enthalten sind, dienen der Darstellung. Alternative Zellflecken können einen anderen Satz von Filtern und Lasern erfordern.

1. Beginnen Sie mit dem Erstellen einer neuen Projektvorlage für die Sortiersoftware, und wählen Sie das Laserpanel aus. Wählen Sie für die dargestellte Kombination von Flecken und natürlicher Fluoreszenz alle vier Laser (405, 488, 535 und 640 nm) aus.
2. Wählen Sie die entsprechenden Filter für jede erwartete Farbe aus, die im Experiment dargestellt wird.
   1. Um die DAPI-Emission zu erkennen und bei der Trennung von lebenden und abgestorbenen Zellen zu helfen, verwenden Sie einen Filter mit einem Bandpass (BP) von 450/50 (425-475 nm Bereich) wie z. B. einen DAPI-, Hoeschst- oder Pacific Blue-Filter.
   2. Verwenden Sie für die Detektion von Licht, das durch das grüne ROS-Signal emittiert wird, einen Filter mit einem BP von 530/30 (Wellenlängenbereich von 515-545 nm) wie z. B. einen Fluoresceinisothiocyanat(FITC) oder einen grünen Fluoreszenzproteinfilter (GFP). Dieser Filter misst die Konzentration von ROS in jeder Zelle.
   3. Fügen Sie einen zusätzlichen Filter mit einem BP von 670/30 (655-685 nm Bereich) wie einem Allophycocyanin (APC) Filter zur Detektion der lysosomalen Fleckenemission hinzu.
      HINWEIS: Der APC-Kanal ermöglicht die Messung der phagozytischen Aktivität. Dieser Kanal wird auch die Autofluoreszenz erkennen, die von den Korallensymbiotischen Algen aus der Familie Symbiodiniaceae erzeugt wird. Dieses Signal kann jedoch über einen zusätzlichen Kanal getrennt werden, der eine längere Wellenlänge als der APC-Filter hat.
   4. Schließen Sie einen Filter mit einem BP von 780/60 (750-810 nm Bereich) ein, wie z. B. den am häufigsten verwendeten Phycoerythrin, Cyaninfilter (APC-Cy7), der die Emission von weit-roter Autofluoreszenz von Symbiodiniaceae erkennt und bei der Isolierung von aposymbiotischen Zellen hilft.

5. FACS-Gating-Setup

HINWEIS: Die Schritte können je nach Herstellung und Modell des Zytometers und des Erfassungsprogramms in Verbindung mit dem Zytometer variieren.

1. Erstellen Sie auf dem Projekt-Experimentalbildschirm der Zytometrie-Software ein Streudiagramm und wählen Sie Vorwärtsstreuung (FORWARD Scatter, FCS) als Metrik für die X-Achse und die Seitenstreuung (SSC) für die Y-Achse aus.
   HINWEIS: FCS korreliert mit der Größe der Zelle und SSC korreliert mit Granularität. Dies ermöglicht die Entfernung der meisten Trümmer, da die meisten kleiner sein werden als intakte Zellen.
2. Legen Sie die Achsen auf logarithmische oder biexponentielle Skalen fest, da Die Zellgröße und Die Granularität um mehrere Größenordnungen variieren können(Abbildung 3A), insbesondere bei Korallen.

6. FACS-Analyse und Zellisolierung

HINWEIS: Die Schritte können je nach Herstellung und Modell des Zytometers und dem gekoppelten Erfassungsprogramm variieren.

1. Legen Sie die Steuerung (d. h. die unbefleckte Zelluntermenge) in die Probenkammer des Zytometers und starten Sie den Lesevorgang. Wenn der Computer beginnt, Daten von jeder Zelle oder jedem Ereignis zu empfangen, werden Punkte im Streudiagramm angezeigt. Um die in den Zytometerkammern von früheren Experimenten zurückgelassenen Trümmer zu beseitigen, lassen Sie etwa 30 s passieren, bevor Sie mit der Analyse beginnen.
2. Passen Sie im Streudiagramm die Photomultiplier-Rohrspannung (PMT) an, um die Punkte zu zentrieren.
   HINWEIS: Die PMT-Spannung wird verwendet, um die Signalstärke der gemessenen Photonen zu verstärken; Wenn die PMT-Spannung zu schwach ist, werden weniger Zellen gelesen, und wenn die PMT-Spannung zu stark ist, werden Zellen in der Nähe des Maximalwerts gemessen und verschiedene Zelltypen sind nicht voneinander zu unterscheiden. Eine ausreichende PMT-Spannung stellt sicher, dass unabhängig voneinander unterscheidbare Ereignisse das Streudiagramm auffüllen. Die Ereignistrennung ist durch das Projizieren logarithmischer oder biexponentiver Skalen auf FSC- und SSC-Streudiagramme einfacher zu visualisieren.
3. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Ereignisse. Um das Beispiel zu erhalten, halten Sie die Datenerfassung an, nachdem etwa 15.000 Ereignisse gelesen wurden. In den meisten Fällen ist dies ausreichend, um die gesamten Zellpopulationsmuster zu visualisieren. Zeichnen Sie weitere Ereignisse auf, wenn kleine, spezialisierte Zellpopulationen analysiert und isoliert werden.
4. Erstellen Sie im ersten Diagramm von FSC und SSC eine Auswahl oder ein Tor der Zellen um die 10^2-Markierung und höher auf der FSC-X-Achse. Alles, was unter dieser Schwelle liegt, ist wahrscheinlich zellulärer Schutt. Zeichnen Sie rechteckige Tore, was eine regelmäßige Option auf Durchflusszytometrie-Softwareprogramme und gut für klare, unterschiedliche Zellpopulationen ist. Verwenden Sie für Zellpopulationen, die eine unregelmäßigere Form in den Streudiagrammen annehmen, eine polygonale Gating-Option.
   HINWEIS: Eine minimale Abschaltung von 10² auf der vorderen Streuung sollte für die kleinsten Korallenzellen ausgewählt werden, kann aber eine Kontamination von Schmutz ermöglichen. Um dies zu ändern, erhöhen Sie die untere Grenze der Gating, um konservativer zu sein.
5. Erstellen Sie ein neues Streudiagramm, das den DAPI-Filter auf der X-Achse und den APC-Cy7-Filter auf der Y-Achse ausdrückt. Wählen Sie dazu das Tor für intakte Zellen aus, die in Schritt 6.4 erstellt wurden, mit der rechten Maustaste, und wählen Sie die Option zum Erstellen eines neuen Streudiagramms aus. Passen Sie die Achsen entweder an logarithmische oder biexponentielle Skalen an.
   HINWEIS: Die Schritte, die zum Erstellen eines neuen Plots erforderlich sind, können je nach Softwareprogramm variieren.
6. Entfernen Sie nun die Kontrollprobe aus der Zytometerkammer und ersetzen Sie sie durch die gebeizten Zellen. Lassen Sie 30 s passieren, bevor Sie mit der Analyse beginnen und die Daten aufzeichnen. Zeichnen Sie etwa 15.000 Zellen auf, bevor Sie anhalten.
   HINWEIS: Die unterschiedlichen Populationen am oberen Ende der APC-Cy7-Skala sind solche mit hoher roter Autofluoreszenz von Symbiodiniaceae. Es ist kein Fleck erforderlich, um diese Bevölkerungsbrüche zu visualisieren, und sie können auch auf der Kontrollstichprobenaufzeichnung angezeigt werden (Abbildung 3C). Wählen Sie für die Korallenpopulationen, die niedriger auf der Y-Achse, für eine weitere Differenzierung.
7. Erstellen Sie ein neues Streudiagramm der aposymbiotischen Zellen, um die ROS-Konzentrationen (FITC-Filter) und die Zellen positiv auf Lysosomen (APC-Filter) zu visualisieren, wobei wiederum logarithmische oder biexponentielle Skalen verwendet werden.
   ANMERKUNG: Wenn es mehrere verschiedene Zellpopulationen gibt, die aposymbiotisch sind, kann jede in ihrem eigenen Streudiagramm weiter unterschieden werden (Abbildung 3C,D).
8. Vergleichen Sie die gebeizte Stichprobengruppe mit der steuerelemente, nicht befleckte Teilmenge, indem Sie entweder die erste Aufzeichnung der Kontrollprobe verwenden oder die Kontrollgruppe erneut einfügen und erneut ausführen. Gate die Ereignisse, die für die befleckte Probengruppe einzigartig sind.

7. FACS Sortierung und Sammlung

HINWEIS: Die Schritte können je nach Herstellung und Modell des Zytometers und des Erfassungsprogramms in Verbindung mit dem Zytometer variieren.

1. Mit einer Auswahl von Zellen, die zum Sammeln ausgewählt wurden, legen Sie Mikrozentrifugenröhren (mit 250 bis 500 L Zellkulturmedien oder Lysepuffer basierend auf der Anzahl der gesammelten Zellen und der Methode der Lagerung) in die Zytometer-Sammlungskammer.
   HINWEIS: Das dargestellte Durchflusszytometer ist in der Lage, vier verschiedene Populationen gleichzeitig zu sortieren, und die Maschine kann so konfiguriert werden, dass sie eine Vielzahl von Sammelgeräten, einschließlich verschiedener Zentrifugenrohre und 96 Brunnenplatten, aufnehmen kann.
2. Sobald das Zytometer beginnt, die Probe zu lesen und eine angemessene Zeit verstrichen ist, um Schutt auszuspülen, beginnen Sie mit der Sortierung der gewünschten Populationen und sammeln sie überall von 20.000 Zellen bis zu mehreren Millionen.
   1. Passen Sie bei mehr als 500.000 Zellen die Lautstärke der Zellkulturmedien oder des Lysepuffers und die Lautstärke des Sammelgeräts an.
   2. Für In-vitro-Studien speichern Sie Zellen auf Eis, bis sie in einem Inkubator oder einer sterilisierten Umgebung platziert werden.
   3. Für molekulare Studien beginnen Sie entweder sofort den DNA/RNA/Protein-Isolationsprozess oder blitzen sie ein und lagern bei -80 °C bis zur Extraktion.
3. Jedes Mal, wenn ein neuer Fleck, eine neue Art oder ein Sortierer verwendet wird, führen Sie eine Reinheitsprüfung der Interessenpopulation durch, indem sie mindestens 20.000 von Interesse bewarbige Zellen in 500 l Färbemedien sortieren, dann die sortierten Zellen erneut analysieren und bestätigen, dass die Zellen innerhalb des Tores gelesen werden, das zum ersten Sortieren verwendet wurde (Abbildung 4).

Results

Insgesamt ist dieses Protokoll nützlich, da es die Identifizierung und Sammlung von lebenden Korallenzellpopulationen erleichtert, die für funktionelle Analysen verwendet werden können. Der Arbeitsablauf begann mit der mechanischen Trennung von Korallengeweben vom darunter liegenden Calciumcarbonatskelett (Abbildung 1). Dies ist einer der wichtigsten ersten Schritte, da unsachgemäße Technik zu einer hohen Zellsterblichkeit führt und große Mengen an Schutt ver...

Discussion

Dieses Protokoll wurde von Rosental et al.¹⁸ adaptiert und zur Identifizierung und Isolierung von P. damicornis Zellen entwickelt. Die Methodik konzentriert sich auf den Prozess der Filterung von Proben, um Trümmer, nicht lebensfähige Zellen und Symbiodiniaceae-gehostete Zellen durch die Untersuchung von zellinintrinen Faktoren, einschließlich der relativen Zellgröße, der relativen Zellgranularität, der Zellautofluoreszenz und des Vorhandenseins intakter Zellmembranen, zu entfernen. Diese...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Airbrush Set & Kompressor	TCP Global	ABD KIT-H-SET	Paasche H-Serie Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit mit Master TC-20 Kompressor & Luftschlauch
BD FACSAria II	BD	644832
Knochenschneider	Bulk Reef Supply	205357	Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter
Cell Strainer	Corning	352340	40 um; BD Falke; einzeln verpackt; keimfrei; Nylon
CellRox Green	Life Technologies	C10444	2,5 mM in DMSO; Anregung/Emission: 485/520 nm
Auffangbeutel	Grainger	38UV35	Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Wiederverschließbarer Polybeutel mit Reißverschluss, transparent; 2 mil Dicke
DAPI	Invitrogen	D1306	10mg in H2O; Anregung/Emission: 358/461 nm
Fötales Kälberserum	Sigma-Aldrich	F2442-100ML	Hitzeinaktiviert bei 57 &de; C für 30 Minuten
Hämazytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hämazytometer
HEPES Puffer	Sigma-Aldrich	H0887
LysoTracker Deep Red	Life Technologies	L12492	1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm
Mikrozentrifugenröhrchen	VWR	87003-294	1,7 mL
Phophat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	70011-044	pH 7,4; 10X
Röhrchen mit rundem Boden	VWR	352063	5 mL Polypropylen-Rundboden-Röhrchenspritze
	BD	309628	1 mL BD Luer-Lok Spritze steril, Einweg-Polycarbonat