Laserinduzierte Fluoreszenzemission (L.I.F.E.) als neuartiges nichtinvasives Werkzeug zur In-Situ-Messung von Biomarkern in kryosphärischen Lebensräumen

Die Kryosphäre beherbergt Meereis, Gletscher, Hochgebirgsseen, Schneegebiete, Seeeis, Schmelzwasserströme und Permafrost. Diese Gebiete bedecken etwa 11% der Landmassen der Erde^1,2 und werden von der Atmosphäre als anerkannte kryosphärische Umgebung überförmig. Jüngste Studien zeigen, dass sich massive Bereiche der Kryosphäre schnell zurückziehen^3,4. Die Antarktis^5,6, die Alpen⁷, die Arktis^{8 und}andere Regionen weisen negative Eismassenbilanzen auf. Der Rückzug von Eiskappen und Gletschern führt zur Erschöpfung unseres größten Süßwasserreservoirs der Erde. In einigen Gebieten ist der Gletscherrückzug unaufhaltsam⁵.

Lange Zeit galten Eisökosysteme als sterile Umgebungen. Trotz rauer Bedingungen ist das Vorhandensein von aktivem Leben in der Kryosphäre der Erde jedoch offensichtlich^{9,10,11,12,13,14,15} . Aufgrund des Trends zu massiven Eisverlusten durch Schmelzen durchläuft die Kryosphäre eine Verschiebung der biologischen Aktivität, die sich auf benachbarte Lebensräume auswirkt. Um diese teilweise irreversiblen Veränderungen zu verstehen, benötigen wir Methoden, um biologische Aktivität im Eis unter In-situ-Bedingungen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen.

In supraglazialen Umgebungen findet man Leben in Kryokonitlöchern, Schneedecken, geschmolzenem Wasser, Bächen und auf nackten Eisflächen. Die offensichtlichsten supraglazialen Lebensräume sind jedoch Kryokonitlöcher. Sie erscheinen weltweit in vergletscherten Umgebungen und wurden erstmals vom schwedischen Entdecker Adolf Erik Nordenskjold während einer Expedition nach Grönland in den 1870er Jahren^16,17beschrieben. Der Name leitet sich von den griechischen Wörtern "kryos" (kalt) und "konia" (Staub) ab. Äolische-abgeleitete dunkle organische und anorganische Ablagerungen befestigen sich auf der Eisoberfläche und reduzieren die Albedo lokal. Die Sonneneinstrahlung fördert das Schmelzen der Trümmer in tiefere Eisschichten und bildet zylindrische Becken mit Sediment (Kryokonit) im Boden⁹. Kryokonitlöcher decken 0,1–10% der Gletscherablationszonen¹¹ab.

Kryokonit-Gemeinschaften bestehen aus Viren, Pilzen, Bakterien, Cyanobakterien, Mikroalgen und Protozoen. Je nach Region können auch metazoische Organismen wie Färsen, Nematoden, Copepoden, Tardigrade und Insektenlarven gefunden werden. Edwards und andere¹⁸ beschreiben Kryokonitenlöcher als "eiskalte Hotspots". Sie verfolgten auch funktionelle Gene in Kryokonitlöchern, die für N, Fe, S und P Radfahren verantwortlich sind. Die Mini-See-Ökosysteme atmen und photosynthetisieren mit Raten in viel wärmeren und nährstoffreicheren Lebensräumen¹¹. Diese Ergebnisse unterstreichen die wichtige Rolle der mikrobiellen Sequestrierung in supraglazialen Umgebungen. Neben lebenden Gemeinschaften in Kryokonitlöchern werden nackte Eisflächen von Eisalgen bewohnt. Ihre Physiologie ist gut untersucht¹⁹ aber ihre räumliche Verteilung wurde nicht bewertet²⁰. Ihre Anwesenheit in supraglazialen Umgebungen verringert die Albedo und fördert damit das Schmelzen, das zu einer Nährstoffaushuntung und Nährstoffeintrag in nachgelagerte Lebensräume führt⁹. Steigende Temperaturen und damit eine höhere Verfügbarkeit von flüssigem Wasser beeinflussen die Netto-Ökosystemproduktivität in diesen eisigen Ökosystemen.

In supraglazialen Umgebungen wandeln photosynthetisch aktive Organismen anorganischen Kohlenstoff und Stickstoff in organische, verfügbare Quellen für das mikrobielle Nahrungsnetz^21,22um. Bisher gibt es nur wenige Studien, die supraglaziale Kohlenstoffflüsse^11,20,23" schätzen. Die Diskrepanz bei den vorgeschlagenen Co2-Flussraten resultiert aus einer geringen räumlichen und zeitlichen Datenauflösung. Darüber hinaus wird die räumliche Verteilung supraglazialer Gemeinschaften außerhalb von Kryokonitlöchern kaum beurteilt. Cook und^{andere 20} sagten in ihren Modellen voraus, dass supraglaziale Algengemeinschaften aufgrund ihrer großen Oberflächenabdeckung bis zu 11-fach mehr Kohlenstoff fixieren als zeitgenössische Kryokonitlöcher. Der Nachweis supraglazialer Algengemeinschaften, die die Probenintegrität gewährleisten, wird aufgrund fehlender Werkzeuge zur In-situ-Erkennung und Quantifizierung immer noch behindert.

Als Reaktion auf logistische Schwierigkeiten werden Eisökosysteme seltener untersucht als Lebensräume in gemäßigten Gebieten. Die Datenauflösung hängt von der Anzahl der bewerteten Proben ab und hängt von der Zugänglichkeit der Studienstandorte ab. Standard-Probenahmeverfahren wie Sägen, Koringen und anschließendes Schmelzen beinhalten eine Manipulation der mikrobiellen Gemeinschaft. Beispielsweise ist eine Chlorophyll-a-Bewertung in Festisproben mit Standardmethoden ohne wesentliche Eingriffe nicht möglich. Daher sind schmelzinduzierte Temperaturänderungen innerhalb der untersuchten mikrobiellen Gemeinschaften unvermeidbar. Als Reaktion auf die Thermolität des Photosystems II und anderer zellulärer Strukturen bei Psychrononen²²führen Laboranalysen von geschmolzenen Eisproben immer zu einer Verfälschung von In-situ-Bedingungen.

Zerstörungsfreie In-situ-Messungen sind der einzig vernünftige Weg, um zuverlässige Daten zu erhalten. Dieses Ziel kann mit fluoreszenzbasierten Methoden erreicht werden. Aufgrund ihrer leichten Erntefunktion sind chl_a und B-Phycoerythrin (B-PE) in Organismen vorhanden, die zum Kohlenstoffkreislauf in supraglazialen Umgebungen beitragen, wie Von Anesio und anderen¹¹nachgewiesen wurde. Daher sind diese fluoreszierenden Moleküle geeignete Biomarker für die Quantifizierung mikrobiellen vermittelten Kohlenstoffflüsse in Eisökosystemen.

In dieser Studie stellen wir die Entwicklung, Kalibrierung und Anwendbarkeit eines neuartigen nicht-invasiven Werkzeugs zur In-situ-Quantifizierung von chl_a- und B-PE-Molekülen in terrestrischen und Eisökosystemen vor. Das Prototypgerät basiert auf laserinduzierter Fluoreszenzemission, auch bekannt als L.I.F.E. Das optische Instrument (Abbildung 1) erfasst fluoreszierende Biomarker-Signaturen nach laserinduzierter Fluoreszenzerregung. Das Verfahren ist zerstörungsfrei und kann am Studienort oder im Labor durchgeführt werden.

Abbildung 1: Der L.I.F.E.-Prototyp. Links: Foto des Instruments ohne Schutzdeckel. Rechts: Schematische Darstellung des Instruments. Gesamtmasse = 5,4 kg (Laser und Optik = 4,025 kg, Laptop = 1,37 kg). Aluminiumrahmen = 32,5 cm x 20,3 cm x 6,5 cm. Optisches Rohr: 18,4 cm x 4 cm (Durchmesser). CCD: bluefox mv220g Sensor; F: servogesteuerte Langpassfilter (450 nm und 550 nm); L: optische Linsen; M1: Spiegel; M2: dichroitischer Spiegel; MC: Mikrocontroller; P: Prisma; PBS: polarisierender Strahlteiler; S: Schlitzöffnung aus verstellbaren Rasierklingen. Maßstabsleiste = 70 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das tragbare Dual-Wellenlängen-Kit wiegt 4,5 kg und wird auf einem Stativ in Kombination mit einem externen Computer verwendet. Die Feldeinrichtung ist schnell und einfach. Das Gerät ist am Stativ befestigt, und das Linsenrohr wird zusammen mit einem USB-Kabel und dem Kamerakabel am Gerät befestigt. Der externe Computer ist über ein USB-Kabel mit dem Gerät verbunden. Die Stativbeine sind so eingestellt, dass das Linsenrohr auf die Probe gerichtet ist und die Probe bedeckt. Dann trifft ein 5 mW grüner Laser die Probe, nachdem er einen polarisierenden Strahlsplitter passiert hat, der polarisiertes Licht in Richtung der optischen Achse des Spektrometers umleitet. Die Probe zeigt ein fluoreszierendes Licht, rot in Abbildung 1dargestellt. Die Hälfte des kollimierten Lichts passiert den polarisierenden Strahlteiler und wird durch einen servogesteuerten Langpassfilter fokussiert, der die Lasersignale entfernt. Als nächstes trifft das Signal auf einen Blendenschlitz, der aus zwei verstellbaren Rasierklingen besteht. Ein Prisma trennt die feine Linie des orthogonalen Lichts spektral von der Schlitzöffnung, bevor das Signal vom Sensor erfasst wird. Das Verfahren wird mit einem blauen Laser wiederholt. Die Rohdaten werden automatisch an einen tragbaren Computer übertragen, der auch für den Softwarebetrieb verwendet wird.

Das Gerät wird von einem externen Computer über eine LabVIEW-Umgebung gesteuert, die die Bildaufnahme mit der CCD-Kamera synchronisiert, Laser ein-/ausschalten und das Langpass-Filterrad drehen. Die grafische Benutzeroberfläche (GUI) ist in drei Hauptabschnitte unterteilt. Die Belichtungseinstellung erfolgt manuell. Obwohl die Korrektur zwischen Belichtungszeit und Signalintensität linear ist (Abbildung 2B), ist die maximale Belichtungszeit auf 10 s begrenzt, da längere Integrationszeiten zu einer signifikanten Verringerung des Signal-Rausch-Verhältnisses führen. Das Kommentarfeld wird für die Beschreibung der Stichprobe verwendet (Abbildung 2A). Im rechten Bereich werden Rohbilder angezeigt, sobald die Messungen abgeschlossen sind. Diese Funktion ist für die sofortige Datenauswertung vor Ort von entscheidender Bedeutung (Abbildung 2C–E). Rote Bereiche zeigen überbelichtete Pixel an, die durch Eine Verkürzung der Belichtungszeit vermieden werden können.

Der nachfolgende Rohdatenreduktionsprozess ist vom Bildaufnahmeverfahren entkoppelt und kann jederzeit nach der Bildaufnahme durchgeführt werden.

Abbildung 2: Grafische Benutzeroberfläche von L.I.F.E. für die Datenerfassung und Rohdatenauswertung. (A) Die Software ermöglicht manuelle Texteingabe für Beispielbeschreibungen. (B) Die Belichtungszeit kann vor der Messung eingestellt werden. (C-E) Die Rohbilder werden auf der rechten Seite der Benutzeroberfläche angezeigt. (E) Rote Farben zeigen eine Sättigung des Sensors an. (F) Die Aktivierung der Schaltfläche RUN MEASUREMENT löst den Datenerfassungsprozess aus. Im Array (G) werden alle Befehle angezeigt, die während der Datenerfassung automatisch ausgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Beispiel für ein Rohbild. Links: Rohdaten von chl_ein Standard in Aceton-Lösung, aufgezeichnet mit dem L.I.F.E Instrument. Aufgrund der optischen Eigenschaften des Geräts wird das Signal als verzogene Linie angezeigt. Rechts: Interpretation des Rohbildes pro Pixel (px). Die Spektralachse (5 nm/px Auflösung) wird gegen die räumliche Achse (30 m/px-Auflösung) geplottet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die 12-Bit-Rohbilder im Graumaßstab zeigen eine räumliche Komponente aufgrund des eindimensionalen Blendenschlitzes und eine Spektralkomponente aufgrund des Prismas vor der CCD (Abbildung 3). Als Reaktion auf optische Einschränkungen werden die Rohbilder verzerrt. Daher müssen sie beschnitten und entzerrt werden, indem ein Code angewendet wird, der den Grad der Verzerrung erkennt. Dies geschieht mit einem Software-Assistenten(Abbildung 4). Als nächstes erfolgt die Wellenlängenkalibrierung mit dem 532 nm Laser. Das grüne Licht wird durch Frequenzverdoppelung eines 1.064 nm Infrarotlasers erzeugt. Beide Wellenlängen können von der CCD erfasst werden und daher kann die Spektralposition jedes Pixels in entzerrten Bildern automatisch berechnet werden (Abbildung 4).

Das Bild wird dann auf einen bestimmten Wellenlängenbereich heruntergeschnitten (550–1.000 nm für grüne Lasermessungen und 400–1.000 für blaue Lasermessungen). Graue Werte aus jedem Pixel in einer ausgewählten Pixellinie werden gezählt und summiert. Ein Grauwert kann zwischen 0 und 255 liegen. Danach ist jede Pixellinie für eine Zahl. Weitere Softwareanweisungen auf dem Bildschirm führen zur Generierung eines Diagramms, das die Grauwertzahlen jeder Pixellinie zeigt, die gegen die räumlichen Koordinaten gezeichnet wird. Dies ermöglicht eine quantitative räumliche Diskriminierung von chl_a und B-PE gleichzeitig in der Stichprobe. Darüber hinaus können die spektralen Eigenschaften eines Samples automatisch aus ausgewählten Pixellinien gezeichnet werden.

Abbildung 4: Dewarping von Rohbildern. Links: Rohbild, das mit einem grünen Laser aufgenommen wurde. Es wurde kein Filter verwendet. Die Signale werden bei 532 nm und 1.064 nm angezeigt. Belichtungszeit = 0,015 s. Mitte: Das zugeschnittene 532 nm Signal wird als Referenzlinie verwendet, um einen Satz von Bildern zu entwirn. Rechts: Das verzerrte Bild aus der Rohbildquelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Kalibrierung und Validierung

HINWEIS: Bereiten Sie für die Pigmentkalibrierung Verdünnungsreihen aus Lagerlösungen von chl_a und B-PE vor. Die chl_eine Lagerlösung wird mit Aceton verdünnt und B-PE mit destilliertem sterilem Wasser verdünnt. Später werden 15 ml jedes Verdünnungsschritts benötigt. Schützen Sie die Pigmente vor Licht, indem Sie sie mit Aluminiumfolie umwickeln. Bewahren Sie die Chl_a in einem Gefrierschrank und die B-PE bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank auf. Ein detailliertes Protokoll für die Verdünnungszeile folgt in den Abschnitten 1.1 für chl_a und 1.2 für B-PE. Sowohl die chl_a als auch die B-PE-Laborkalibrierung zur Pigmentdetektion und -quantifizierung mit dem L.I.F.E.-Instrument werden nachfolgend beschrieben. Eine vorherige Kalibrierung²⁴ wurde mit den gleichen Pigmenten wie in dieser Studie gemacht.

1. Chlorophyll_eine Verdünnungsreihe
   1. 1 mg chl_a (gereinigt aus A. nidulanen Algen) mit Aceton in einem 50 ml Probenröhrchen auflösen und_eine Stammlösung mit Aceton auf folgende Endkonzentrationen verdünnen: 1.000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 1; und 0,5 ng/ml.
   2. 15 ml jeder Verdünnung in 50 ml Probenrohre übertragen und aufgrund der Lichtempfindlichkeit mit Aluminiumfolie bedecken. Bewahren Sie die Rohre in einem -20 °C-Gefrierschrank auf, bis die Kalibrierungsmessungen durchgeführt werden.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier unterbrochen werden.
   3. Messen Sie die chl_a Absorptionsmerkmale aus jeder Verdünnung in einem Doppelstrahlspektrophotometer als Dreiklänglich und berechnen Sie den chl_einen Inhalt, wie von Lorenzen²⁵beschrieben, der in Abschnitt 2.2.2 ausführlich beschrieben wird.
2. PE-Verdünnungsreihe
   1. Eine 4 mg/ml B-PE-Stammlösung mit sterilem gefiltertem Wasser (pH = 7) auf folgende Endkonzentrationen verdünnen: 1.000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; und 5 ng/mL B-PE. 15 ml jeder Verdünnung in ein 50 ml Probenrohr geben und mit Aluminiumfolie bedecken. Bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung lagern.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier unterbrochen werden.
3. Setup für die Kalibrierung
   1. Erstellen Sie ein Rack, wie in Abbildung 5 dargestellt, um drei Messplattformen einzurichten, die jeweils 1,5 cm höher als die nächste sind.
      ANMERKUNG: Die Rack- und Säulenhöhe spielen eine wichtige Rolle für die Messungen, da die Oberfläche der Flüssigkeiten im Brennpunkt des L.I.F.E.-Instruments bleiben sollte, wie in Abbildung 5angegeben.
   2. Fügen Sie 5 ml der höchsten konzentrierten Verdünnung in eine Polyscintillation Kunststoff-Durchstechflasche und legen Sie es auf den höchsten Punkt des Racks. Messen Sie die Fluoreszenzintensität.
   3. Legen Sie die Durchstechflasche in die mittlere Position des Racks und fügen Sie weitere 5 ml (10 ml Gesamtvolumen) hinzu. Messen Sie die Fluoreszenzintensität. Wiederholen Sie den Vorgang an der niedrigsten Position auf dem Rack mit weiteren 5 ml (15 ml Gesamtvolumen; insgesamt 45 mm in Säulenhöhe).
      HINWEIS: Passen Sie die Belichtungszeit für jeden Verdünnungsschritt an, um eine Sättigung des Detektors (Grauwerte über 255 in 12-Bit-Bildern) und ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis der schwachen Fluoreszenzsignale zu verhindern.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2 und 1.3.3 mit allen Verdünnungen (Schritte 1.1.1 und 1.2.1) von chl_a und B-PE.
   5. Laden Sie die generierten Datendateien in den Datenreduktions-Assistenten, um die Grauwerte jeder Pixellinie entlang der Y-Achse (räumliche Verteilung) automatisch zu zählen und zusammenzufassen.
      HINWEIS: Unterschiedliche Belichtungszeiten werden automatisch kompensiert, indem die Fluoreszenzintensität auf eine Integrationszeit von 1 s normalisiert wird.
   6. Berechnen Sie die Pigmentflächendichte mit einer Poisson-Regressionsanalyse unter Verwendung der bekannten Konzentrationen aus der Verdünnungsreihe und der berechneten normalisierten Fluoreszenzintensitäten. Normalisieren Sie dann die Fluoreszenzzählungen von den drei verschiedenen Säulenhöhen auf 1,5 cm (5 ml), indem die Zählungen aus jeder Spaltenhöhe mit einem Faktor multipliziert werden (Faktoren 1, 0,5 und 0,33 für die Konzentrationslösungen 5 ml, 10 ml bzw. 15 ml).

Abbildung 5: Einrichtung für die L.I.F.E.-Kalibrierung mit chl_a und B-PE unter Laborbedingungen.
(A) Linsenrohr des Instruments. (B) Grüner Laser für B-PE Anregung. (C) Blauer Laser für chl_eine Anregung. (D) Scintillationsdurchstechflasche. (E) Schwerpunkt des L.I.F.E.-Instruments. (F) B-PE/wasser oder chl_eine/acetonLösung mit 5 ml, 10 ml und 15 ml. (G) Abstandshalter, die die Oberfläche jeder Lösung drei verschiedene Volumina auf der Brennebene halten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Probenahme und Probenverarbeitung

1. Sammlung von Schnee und Eis
   1. Schnee und supraglaziale Eis von einem Gletscher in sterile Polyethylenbeutel sammeln und bis zur Weiterverarbeitung gefroren aufbewahren.
      HINWEIS: Für diese Studie wurden die Proben in Midtre Lovenbreen (MLB) gesammelt, einem polythermischen Gletscher in der Nähe des Forschungsdorfes Ny-Elesund im hocharktischen Archipel Spitzbergen (78°53' N, 12°03' E).
   2. Proben Sie Bakterienmatten aus dem Gletschervorfeld in sterile Polyethylenbeutel und transportieren Sie alle Proben zur Weiterverarbeitung in ein Labor.
   3. Gefrorenes Material bei 4 °C langsam im Dunkeln schmelzen. Filtern Sie Flüssigkeitsproben auf GF/F-Filter (47 mm Durchmesser) und notieren Sie das gefilterte Volumen. Halten Sie die Filter bis zur weiteren Verarbeitung eingefroren.
2. Chlorophyll_a Messungen
   1. Messen Sie den Filter mit dem L.I.F.E.-Instrument in vier zufälligen Bereichen, jeweils in Dreisprachigen mit dem grünen und blauen Laser. Berechnen Sie die Gesamtpigmentkonzentration, indem Sie die Flächendichte mit der gefilterten Fläche und dem gefilterten Volumen multiplizieren. Normalisieren Sie die Pigmentkonzentration (g/L) auf ein Volumen von 1 L.
   2. Bewerten Sie den_chl-Inhalt der GF/F-Filter mit einem Laborstandard nach dem Protokoll von Lorenzen²⁵. Dazu jeden filtern in eine Durchstechflasche mit 13 ml Aceton geben und über Nacht bei 4 °C im Dunkeln lagern. Als nächstes nehmen Sie eine Durchstechflasche und legen Sie sie auf Eis vor der Beschallung für 2 min bei 50% Leistung im kontinuierlichen Modus. Drücken und entfernen Sie den Filter aus der Durchstechflasche.
   3. Tygonschläuche an einer Spritze befestigen und_eine Extraktions-Aceton-Mischung aus der Durchstechflasche entfernen. Ersetzen Sie den Tygonschlauch durch einen GF-5 Filterhalter. Übertragen Sie die Lösung in eine Quarzküvette.
   4. Nach der Kalibrierung des Absorptionsspektrometers für Aceton legen Sie die Probe in die Küvette in das Spektrometer und messen Sie die Absorptionsmerkmale zwischen 400–750 nm. Als nächstes entfernen Sie die Küvette aus dem Spektrometer und fügen Sie der Probe 200 L von 2 M HCl hinzu. Wiederholen Sie dann die Absorptionsmessung, um den Phaeophytingehalt in der Probe zu messen.
3. Messung der mikrobiellen Aktivität durch radioaktiv markierte Marker und Auswirkungen der Laserintensität und Der Expositionszeit auf die Produktivitätsraten
   VORSICHT: Vorsicht vor der Markerradioaktivität (Strahlung). Verwenden Sie einen Labormantel, Handschuhe und Eine Brille und arbeiten Sie unter einer Dunstabzugshaube in einem lizenzierten Isotopenlabor.
   1. Für die bakterielle Produktion transferieren Sie fünf Aliquots von Bakterienmatten in sterile Polyethylenbeutel. Inaktivieren Sie die Kontrollen mit Formaldehyd auf eine Endkonzentration von 4%.
      HINWEIS: Für die ³H-gekennzeichnete Leucinaufnahme werden drei Aliquots und als Kontrollen zwei Aliquots verwendet.
   2. Setzen Sie die Matten mit einem blauen Laser (405 nm, 5 mW) und mit einem grünen Laser (532 nm, 5 mW) für je 10 s und 30 s aus. Wiederholen Sie den Vorgang mit 50 mW Lasern. Dann inaktivieren Sie die Proben, die nicht mit Formaldehyd behandelt wurden.
      HINWEIS: Eine Matte wird nur für eine Laserbelichtung verwendet. Verwenden Sie nicht exponierte mikrobielle Matten als Kontrollen.
   3. Schätzen Sie nach der Laserbehandlung die bakterielle und primäre Produktion unter Einbeziehung von ³H-Leucin bzw. NaH¹⁴_CO3. Verwenden Sie für bakterielle Produktionsmessungen fünf Aliquots pro Probe (20 ml) und fügen Sie zwei der Parallelen Formalin (4 % Endkonzentration) hinzu, die als Steuerung für die abiotische Einbeziehung des Markers dienen. Fügen Sie ³H-Leucin (40 nM) zu allen Proben der verschiedenen Behandlungen hinzu und inkubieren Sie sie für 4 h unter In-situ-Bedingungen (0,1 °C). Beenden Sie die Reaktion, indem Sie den verbleibenden lebenden Proben Formalin hinzufügen.
   4. Für die bakterielle Produktion von Bakterienmatten, übertragen Sie markierte Proben in Kryovials. Extraktzellen mit 5% Trichloressigsäure und Zentrifuge bei 10.000 x g für 5 min nach den Protokollen von Kirchman²⁶ und Bell²⁷. Scintillationsflüssigkeit hinzufügen und das Kryovial in eine Polyscintillationsdurchstechflasche geben. Analysieren Sie die Proben mit einem flüssigen Szintillationszähler und berechnen Sie die Aufnahmeraten.
      HINWEIS: Für die ³H-markierte Leucinaufnahme werden drei Aliquots verwendet, zwei Aliquots werden als Kontrollen verwendet.
   5. Für die Primärproduktion fünf Repliken verschiedener Behandlungen (100 ml) vorbereiten, zwei davon in Aluminiumfolie wickeln, um die dunklen Proben nachzuahmen, und NaH¹⁴CO₃ (1 CIs) zu allen hinzufügen. Inkubieren Sie für 4 h im Umgebungslicht und in situ Temperatur (0.1 °C). Beenden Sie die Reaktion, indem Sie die restlichen drei Replikationen verdunkeln und filtern Sie die Probe auf GF/F-Filter (25 mm Durchmesser).
   6. Fügen Sie den Filtern 100 L von 2 N HCl hinzu, um alle überschüssigen Kohlenstoffe zu entfernen und sie unter der Dunstabzugshaube auslüften zu lassen. Trocknen Sie die Proben auf einer Heizplatte bei 80 °C und legen Sie die Proben in Polysintillationsfläschchen.
   7. Um radioaktive Disintegrationen pro Minute (dpm) aller Behandlungen der primär- und bakteriellen Produktion zu messen, legen Sie die Kryovials in Polysintillationsfläschchen und fügen Sie 5 ml Szintillationscocktail hinzu. Messen Sie dpm mit einem flüssigen Szintillationszähler und berechnen Sie die Aufnahmeraten.

Laborkalibrierung für B-PE
Die Ansprechsignale der B-PE-Verdünnungsreihe wurden mit dem L.I.F.E.-Instrument in einem dunklen Raum bei 20 °C gemessen (Abbildung 6). Die Zählrate hing sowohl von der Konzentration als auch von der Spaltenhöhe der gemessenen Probe ab. Niedrige Konzentration und niedrige Säulenhöhe B-PE-Proben fluoreszenzierten stärker im Vergleich zu Proben der gleichen Konzentration und höheren Säulenhöhe.

Abbildung 6: B-PE-Laborkalibrierung. B-PE-Inhalts- und Spaltendichtekalibrierung wird angezeigt. Normalisierte Zählraten wurden für eine Spaltenhöhe von 1,5 cm berechnet. Nachdruck mit Erlaubnis28. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Für die endgültige Anpassung der Kalibrierlinie wurde eine Poisson-Regression verwendet. Es gab eine lineare Korrelation zwischen der Flächendichte und der Anzahl der Pixelgrauwerte. Die Funktion der Kurve war y = 81.04x (Abbildung 7), was bedeutet, dass eine Grauwertzahl von 8.104 in einer 1 s exponierten Probe einer Flächendichte von 100 ng/cm2 B-PE entsprach. Die chleine Kalibrierung wird analog eingerichtet. Die Funktion war y = 8.94x.

Abbildung 7: Endgültige Kalibrierkurve für B-PE. Die Grauwertzählungen wurden auf eine Belichtungszeit von 1 s normalisiert und gegen die Flächendichte dargestellt. Nachdruck mit Berechtigung28. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Anwendung auf Kryokonitproben aus Spitzbergen und Laborvalidierung von Daten
Die Mittelwerte der L.I.F.E.-Messungen und die Einzelmessungen der gleichen Proben, die aus der konventionellen Extraktion mit Aceton und anschließender Analyse mit einem Spektralphotometer abgeleitet wurden, sind in Abbildung 8dargestellt.

Abbildung 8: Datenvalidierung mit natürlichen Proben. Die Proben (MLB) werden nach chla Gehalt geordnet, basierend auf den Ergebnissen eines Laborspektrophotometers (Einzelwerte) und im Vergleich mit dem chleine Fluoreszenzdaten gemessen an vier zufälligen Bereichen pro Filter. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der L.I.F.E.-Messungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Chlein Inhalt von 48 g/L–L–67 g/L wurden unterschätzt, und niedrigereChl-Inhalte von 0,7 g/L–7 g/l wurden vom L.I.F.E.-Prototyp überschätzt. Die Standardabweichungen von den L.I.F.E.-Messungen waren gering.

Vergleich von Spektraldaten aus In-situ-Messungen mit Laborstandards
Chla spectra waren vergleichbar zwischen Kryokonitproben und solchen von a. nidulans Algen. Die Fluoreszenzspitzen in allen Proben lagen bei 700 nm–710 nm. Spektren, die aus Kryokonitproben abgeleitet wurden, zeigten jedoch höhere Rauschsignale zwischen 400 nm–650 nm und von 800 nm–1.000 nm im Vergleich zu Spektren deschl-Pigmentstandards (Abbildung 9).

Abbildung 9: Interpretation von Spektraldaten. Messungen von vier Kryokonitgranulaten (blau) und einem chleiner Standardpigmentlösung (rot) nach Anregung mit 405 nm Lasern. Die Spektren wurden 1 Jahr nach der Probenentnahme aufgezeichnet. Die Proben wurden eingefroren und vor der Messung nicht dem Licht ausgesetzt. Als Reaktion auf Probleme bei der Wellenlängenkalibrierung befindet sich der Fluoreszenz-Peak bei 700 nm–710 nm statt 680 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Automatisierte Kryokonitkornanalyse
In einem Beispiel für eine automatisierte Analyse eines Kryokonitlochs (Abbildung 10) wurden die höchsten Pigmentbereichsdichten an der Pixellinie 50 beobachtet. Das Probenspektrum nach Anregung mit einem 532 nm Laser zeigte eine Spitze mit einem Abgeschnittenen bei einem Grauwert von 255 als Reaktion auf eine Übersättigung des Sensors. Dieser Peak stammt vom grünen Laser und nicht vom Fluoreszenzsignal.

Abbildung 10: Automatisierte Datenanalyse eines einzelnen Kryokonitengranulats mit einem Durchmesser von 1 mm. Die Probe wurde in Vestre Br'ggerbreen (VBB) entnommen und innerhalb von 4 stunden nach einer Probenahme in einem dunklen Laborraum in der Arctic Station (GB) in Ny-Ilesund gemessen. Die linke Spalte zeigt B-PE-Messungen und die rechte Spalte stellt chla Daten dar. Die Rohbilder werden oben angezeigt. Laserinduzierte Fluoreszenzreaktionen werden in Grau angezeigt. Rote Bereiche zeigen die Reaktion von Standardpigmenten an. Der Mittelteil veranschaulicht die räumliche Verteilung der Zielpigmente. Die spektralen Eigenschaften des Fluoreszenzsignals werden in den unteren Bildern angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Auswirkungen der Lasererregung auf die Produktivität in Bakterienmatten
Weder die primäre noch die bakterielle Produktivität wurden bei der Erhöhung der Leistung des Lasers und/oder der Belichtungszeit beeinträchtigt (Abbildung 11). Bei Laserbehandlungen mit erhöhter Leistung wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt.

Abbildung 11: Produktivitätsmessungen von Proben aus Spitzbergen. Bakterielle Matten wurden mit grünen und blauen Lasern mit unterschiedlichen Laserintensitäten und Belichtungszeiten belichtet. Die Daten werden entsprechend der Laserwellenlängenquelle (grün und blau) eingefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.