Methodenartikel

Genetische Modifikation von Cyanobakterien durch Konjugation mit dem CyanoGate Modular Cloning Toolkit

DOI:

10.3791/60451

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31. Oktober 2019

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1Institute of Molecular Plant Sciences, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh, 3Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie i) einen sich selbst replizierenden Vektor mithilfe des modularen Klon-Toolkits CyanoGate zusammenstellen kann, ii) den Vektor durch Konjugation in einen cyanobakteriellen Wirt einführt und iii) transgene Cyanobakterienstämme mit einem Plattenleser oder Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

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Cyanobakterien sind eine vielfältige Gruppe von prokaryotischen photosynthetischen Organismen, die für die nachwachsende Produktion nützlicher Industrieller verwendet werden können. Jüngste Fortschritte in der synthetischen Biologie haben zur Entwicklung mehrerer Klon-Toolkits wie CyanoGate geführt, einem standardisierten modularen Klonsystem zum Aufbau von Plasmidvektoren für die nachfolgende Transformation oder die eheliche Übertragung in Cyanobakterien. Hier skizzieren wir eine detaillierte Methode zur Zusammenstellung eines sich selbst replizierenden Vektors (z.B. mit einer fluoreszierenden Markerexpressionskassette) und der wechselförmigen Übertragung des Vektors in die cyanobakteriellen Stämme Synechocystis sp. PCC 6803 oder Synechococcus Elongatus UTEX 2973. Darüber hinaus beschreiben wir, wie die Leistung eines genetischen Teils (z. B. eines Promotors) mit einem Plattenleser oder einer Durchflusszytometrie charakterisiert werden kann.

Einleitung

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Cyanobakterien sind autotrophe Bakterien, die für die Biosynthese einer Vielzahl von natürlichen und heterologen hochwertigenStoffwechselprodukten1,2,3,4,5, 6. Es müssen noch einige Hürden überwunden werden, um ihre wirtschaftliche Lebensfähigkeit zu erhöhen, vor allem die relativ geringen Erträge im Vergleich zu heterotrophen Bioplattformen (z. B. Escherichia coli und Hefe)7. Die jüngste Erweiterung der verfügbaren gentechnischen Werkzeug....

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Protokoll

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1. Vektormontage mit den Toolkits Plant MoClo und CyanoGate

HINWEIS: Bevor Sie mit der Vektorbaugruppe fortfahren, wird dringend empfohlen, dass benutzer sich mit den Vektorebenenstrukturen der Plant- und CyanoGate MoClo-Systeme12,15 vertrautmachen.

  1. Konstruktion von Teilen der Stufe 0
    HINWEIS: Teile der Ebene 0 können als vollständige Vektoren oder als lineare Sequenzen für die Baugruppe mit Level 0-Akzeptoren (z. B. Blöcke, IDT) synthetisiert werden. Alternativ können Sequenzen aus einer Quellschablone (z.B. einem Vektor oder gereinigter genomischer DNA) verstärkt werd....

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Ergebnisse

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Um den Golden Gate-Montage-Workflow zu demonstrieren, wurde eine Ausdruckskassette im Level 1 Position 1 (Forward) Akzeptorvektor (pICH47732) mit den folgenden Level 0-Teilen montiert: dem Promotor des C-Phycocyanin-Operons Pcpc560 (pC0.005), die Codierungssequenz für eYFP (pC0.008) und den Doppelabschlusszeichen TrrnB (pC0.082)12. Nach der Transformation der Montagereaktion wurden erfolgreiche Baugruppen mit dem Standard-Bla.......

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Diskussion

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Golden Gate Montage hat mehrere Vorteile im Vergleich zu anderen Vektor-Montage-Methoden, vor allem in Bezug auf Skalierbarkeit20,21. Dennoch erfordert die Einrichtung des Golden Gate-Systems in einem Labor Zeit, um eine Vertrautheit mit den verschiedenen Teilen und Akzeptor-Vektorbibliotheken und gesamten Montageprozessen zu entwickeln. Für komplexere Baugruppen oder bei der parallelen Ausführung einer großen Anzahl komplexer Baugruppen (z. B. beim Erstellen ein.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Die Autoren danken dem PHYCONET Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) Network in Industrial Biotechnology and Bioenergy (NIBB) und dem Industrial Biotechnology Innovation Centre (IBioIC) für die finanzielle Unterstützung. GARG, AASO und AP würdigen die finanzielle Unterstützung aus dem BBSRC EASTBIO CASE PhD-Programm (Grant-Nummer BB/M010996/1), dem Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) PhD-Programm und dem IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP) PhD-Programm, in dieser reihenfolge. Wir danken Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London) und Poul Eric Jensen und Julie Annemarie Zita Zedler (Universität Kopenhag....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal)Thermo Fisher ScientificR0404Verwendet in 2.1.3.
Adenosin-5′-triphosphat (ATP)-DinatriumsalzSigma-AldrichA2383Verwendet in Tabelle 2.
Agar (mikrobiologisch getestet)Sigma-AldrichA1296-500gVerwendet in 8.3.
AgaroseBiolineBIO-41026Verwendet in 6.
Attune NxT DurchflusszytometerThermo Fisher Wissenschaftlichverwendet in 4.3.1.
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA2153verwendet in Tabelle 2.
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011verwendet in Tabelle 2.
BsaI (Eco31I)Thermo Fisher ScientificER0291wird in Tabelle 2 verwendet.
Carbenicillin-DinatriumVWR InternationalA1491.0005Verwendet in 2.1.3.
Corning Costar TC-behandelte 24-Well-Platten mit flachem BodenSigma-AldrichCLS3527Verwendet in 4.1.3.
Dimethylsulfoxid (DMSO)Thermo Fisher ScientificBP231-100wird in 3.6.2 verwendet.
DNeasy Plant Mini KitQiagen69104DNA-Extraktionskit. Verwendet in 5.
FLUOstar Omega Mikroplatten-ReaderBMG Labtech-Verwendet in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK0503Plasmid-Aufreinigungskit. Wird in Schritt 2.3.2 verwendet.
Glasperlen (0,5 mm Durchmesser)BioSpec Produkte11079105Verwendet in 5.2.
GlycerolThermo Fisher Scientific10021083verwendet in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Thermo Fisher Scientific10356553in Abschnitt 2.1.3 verwendet.
Kanamycinsulfat (Gibco)Thermo Fisher Scientific11815-024verwendet in 2.1.3.
Membranfilter (0,45 μ m)MF-MilliporeHAWP02500Wird in 3.3.7
Mikrotiterplatten, 96-Well, Flachboden (Chimney Well) und Mikroplatten verwendet; CLEARGreiner Bio-One655096in 4.2.1 verwendet.
Monarch DNA Gel ExtraktionskitNew England BiolabsT1020Sverwendet in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA-AufreinigungskitNew England BiolabsT1030DNA-Aufreinigungskit. Wird in Version 1.1.2.3 verwendet.
Multitron Pro Inkubator mit LEDsInfors HT-Schüttel-Inkubatormit weißen LED-Leuchten. Verwendet in 4.1.4.
MyTaq DNA-PolymeraseBiolineBIO-21108verwendet in 7.1.
NanoDrop OneThermo FisherScientific ND-ONE-WVerwendet in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemisch kompetente E. coliThermo Fisher ScientificC404010Verwendet in 2.1.1.
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) (10X Konzentrat)VWR InternationalK813Wird in 4.3.2 verwendet.
Q5High-Fidelity-DNA-PolymeraseNew England BiolabsM0491S,verwendet in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA-LeiterNew England BiolabsN0468S,verwendet in Abbildung 4.
Röhrchen mit Schraubverschluss (1,5 ml)Starstedt72.692.210Verwendet in 3.6.3
Spectinomycin-Dihydrochlorid-PentahydratVWR InternationalJ61820.06Verwendet in 2.1.3.
Sterilin Clear Mikrotiter mit rundem Boden 96-Well-PlattenThermo Fisher Scientific612U96Verwendet in 4.3.1.
T4-DNA-LigaseThermo Fisher ScientificEL0011verwendet in Tabelle 2.
TissueLyser IIQiagen85300Kugelmühle. Wird in 5.2 verwendet.
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Referenzen

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  1. Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
  2. Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering m....

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Schlagwörter

Konjugation von CyanobakterienCyanoGate ToolkitAssemblierung von PlasmidvektorenSynechocystis PCC 6803Synechococcus elongatusdurchflusszytometrische AnalysePlate Reader AssayTriparentale PaarungGolden Gate Assemblierung

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