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Methodenartikel

Aufbereitung von aktiviertem plättchenreichem Plasma für die Kultivierung menschlicher Stammzellen aus Fettgewebe

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DOI:

10.3791/60480

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4. Mai 2020

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1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Kansai Medical University, 2Department of Plastic Surgery, Zhejiang Provincial People's Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Bericht beschreiben wir eine Double-Spin-Methode zur Herstellung von aktiviertem plättchenreichem Plasma (PRP). Unter Verwendung von autologem Thrombin wurden humane Fettstammzellen (hASCs) kultiviert. Es wurde gezeigt, dass aktiviertes PRP die Proliferation von hASCs fördert.

Zusammenfassung

Aktiviertes plättchenreiches Plasma (PRP), das durch Zentrifugation aus Vollblut hergestellt wurde, zeigte in verschiedenen Arten von kultivierten Zellen eine proliferationsstimulierende Wirkung, was auf einen möglichen Einsatz in der regenerativen Medizin hindeutet. Hier wurde eine Double-Spin-Methode verwendet, um PRP aus Vollblut herzustellen. PRP wurde zusätzlich durch autologes Thrombin aktiviert. Im aktivierten PRP wurde die Thrombozytenzahl gemessen und die proliferationsstimulierende Wirkung in humanen Fettstammzellen (hASCs) untersucht. Die resultierende Thrombozytenzahl war bei PRP 11,5-mal höher als bei Vollblutplasma. Die Proliferation von hASCs wurde durch die Inkubation mit 1% PRP deutlich verstärkt. Das beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um PRP mit einer hohen Konzentration an Thrombozyten reproduzierbar herzustellen. PRP, das mit dieser Methode hergestellt wird, fördert die Proliferation von hASCs deutlich.

Einleitung

Aktiviertes plättchenreiches Plasma (PRP) wird durch Zentrifugation von Vollblut hergestellt und enthält nachweislich Blutplättchen weit über den Ausgangswerten1. Autologes RPP wird häufig in der chirurgischen Behandlung eingesetzt, einschließlich der Wundheilung2, der Knochenverletzung3 und der ästhetischen Chirurgie 4,5. Nach der Aktivierung von Blutplättchen in PRP setzen die in den Blutplättchen vorhandenen α-Granulate mehrere Wachstumsfaktoren frei, wie z. B. den von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs), den transformierenden Wachstumsfaktor Beta (TGF-β), den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und andere 1,6,7. Diese Wachstumsfaktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Zellproliferation8, der Migration9 und der Differenzierung9.

Bisher haben mehrere Studien über die proliferationsstimulierende Wirkung von PRP in verschiedenen Zellarten berichtet 10,11,12,13,14,15,16. Einer dieser Zelltypen sind humane Fettstammzellen (hASCs); hASCs kommen im menschlichen Fettgewebe vor und können leicht in großer Zahl entnommen werden. Die regenerative Wirkung von hASCs deutet zudem auf einen möglichen Einsatz in klinischen Anwendungenhin 8. Unsere früheren Studien berichteten, dass aktiviertes PRP im Vergleich zu nicht aktiviertem PRP eine ausgeprägte proliferative Wirkung auf hASCs und humane dermale Fibroblasten (hDFs) hatte8. Darüber hinaus berichteten wir, dass PRP die Proliferation von hDFs über einen ERK1/2-Signalweg fördert17. Kürzlich haben wir auch berichtet, dass PRP die Proliferation von hASCs über die ERK1/2-, JNK- und Akt-Signalwege fördert18. In hASCs spielt PRP eine wichtige Rolle als Nahrungsergänzungsmittel, das die Proliferation fördert. Das Wissen über die Wirkung von PRP auf hASCs wird die Entwicklung großtechnischer Kulturmethoden unterstützen und weitere Studien über den Proliferationsmechanismus in hASCs ermöglichen.

In diesem Bericht stellen wir eine Methode zur Herstellung von PRP aus Vollblut mittels Zentrifugation vor und beschreiben sie. Bei dieser Methode wird die Double-Spin-Methode verwendet, um auf einfache Weise eine stabile PRP-Probe herzustellen. Um die biologische Funktion von PRP zu beurteilen, haben wir die konzentrierte Thrombozytenzahl und die Konzentration mehrerer Proliferationsfaktoren gemessen. Wir bestätigten auch die wachstumsstimulierende Wirkung, indem wir das vorbereitete PRP für die Kultivierung von hASCs verwendeten.

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Protokoll

Die Studie wurde vom Ethics Review Board der Kansai Medical University in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien der Deklaration von Helsinki von 1975 genehmigt. Alle Proben wurden mit Einverständniserklärung der Spender entnommen und verwendet.

1. Vorbereitung

  1. Nachdem Sie die Einverständniserklärung eingeholt haben, nehmen Sie Blut von gesunden erwachsenen Spendern ab. Hier wurde Blut von vier männlichen Blutspendern im Alter zwischen 28 und 38 Jahren entnommen.
    1. Empfehlen Sie den Spendern, 6 h vor der Blutentnahme 500 ml Wasser zu trinken.
      HINWEIS: Die Referenzbereiche für Hämoglobin (Hb), Anzahl der roten Blutkörperchen (RBC) und Thrombozytenkonzentration (PL) bei gesunden Erwachsenen werden von Vajpayee19 beschrieben. Um für eine Blutspende geeignet zu sein, muss die Blutanalyse des Spenders innerhalb dieser Bereiche liegen.

2. Blutentnahme

  1. Lassen Sie die Blutspender während des Eingriffs sitzen.
  2. Tragen Sie Handschuhe. Befestige ein Tourniquet am Oberarm des Spenders, während der Spender eine Faust macht.
  3. Sobald eine geeignete Vene gefunden ist, sterilisieren Sie die Haut zweimal mit 70% Alkohol und führen Sie die Nadel ein.
  4. Verwenden Sie eine 21 G Spritze, um Blut zu entnehmen. Lockern Sie das Tourniquet während der Blutabnahme nicht.
    1. Verwenden Sie ein 8,5-ml-Blutentnahmeröhrchen, um das Blut zu sammeln. Beobachten Sie den Zustand des Blutes in der Sonde und wechseln Sie zu einer neuen Sonde, sobald sich der Blutfluss verlangsamt.
    2. Sammeln Sie eine ausreichende Menge Blut, um das PRP herzustellen. Entnehmen Sie vier Röhrchen mit antikoaguliertem Blut mit einem Gesamtvolumen von 34 ml. Drehen Sie die Röhrchen 10 Mal um, um das Blut mit dem Antikoagulans zu vermischen.
    3. Verwenden Sie ein 10-ml-Serumblutentnahmeröhrchen (siehe Materialtabelle) ohne Antikoagulans, um Blut für die Herstellung des Aktivators zu entnehmen (siehe Schritt 4). Entnehmen Sie 10 ml nicht-gerinnungshemmendes Blut.

3. Double-Spin-Methode zur Herstellung von PRP

  1. Nehmen Sie 40 μl antikoaguliertes Vollblut für die Thrombozytenzahl. Verwenden Sie gefilterte Pipettenspitzen, um die Pipette vor Blutkontamination zu schützen.
  2. Das antikoagulierte Vollblut 7 min bei 450 x g und Raumtemperatur zentrifugieren. Dies ist der erste Spin, bei dem geschichtete Blutproben gewonnen werden. Die obere Schicht ist die Plasmafraktion, die mittlere Schicht ist das dünne Buffy-Boot und die unterste Schicht besteht aus roten Blutkörperchen.
  3. Verwende einen Markierer, um eine Linie 2 mm unter dem Buffy Coat zu ziehen.
  4. Verwenden Sie eine 20-ml-Spritze mit einer langen Kanüle, um das Plasma knapp bis zur 2-mm-Markierung unter dem Buffy Coat zu sammeln. Das gelbe Plasma mit Buffy Coat enthält Blutplättchen, Leukozyten und einige Erythrozyten. Sammle das Plasma aus zwei Röhrchen in ein Serumblutentnahmeröhrchen. Kombinieren Sie den Inhalt von 4 Röhrchen in 2 Röhrchen, um ein Gesamtvolumen von 16 ml gesammeltem Plasma zu erhalten.
  5. Zentrifugieren Sie das Plasma mit dem Buffy Coat für 5 min bei 1.600 x g und Raumtemperatur. Dies ist der zweite Spin. Der Überstand der geschichteten Blutproben ist plättchenarmes Plasma (PPP).
  6. Verwenden Sie eine 20-ml-Spritze mit einer langen Kanüle, um das PSM in ein 50-ml-Serumblutentnahmeröhrchen mit 1 ml Flüssigkeit als Maß zu übertragen. Thrombozyten, die sich im Thrombozytenpellet im verbleibenden 1 ml Plasma ansammelten, wurden als PRP verwendet. Das Gesamtvolumen des gesammelten PRP betrug 2 ml.
  7. Wirbeln Sie das PRP in jedes Röhrchen und sammeln Sie es dann in ein Röhrchen (insgesamt 2 mL).
  8. Nehmen Sie 400 μl des PRP für eine Thrombozytenzahl.
  9. Aliquotieren Sie das PRP in mehrere 1,5-ml-Röhrchen, die in jedem Röhrchen etwa 400 μl enthalten. Es gibt insgesamt vier Röhren. Empfohlen werden ca. 500 μl PRP pro Röhrchen.

4. Bereiten Sie den Aktivator vor

  1. Lassen Sie die 10 ml Blut ohne Antikoagulans in einem Serumblutentnahmeröhrchen (Schritt 2.3.3) 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
  2. Zentrifugieren Sie die Blutprobe ohne Antikoagulans für 8 min bei 2.015 x g und Raumtemperatur in einer Laborzentrifuge.
  3. Sammeln Sie den Überstand als autologes Thrombin.
  4. Mischen Sie 0,5 M CaCl2 und autologes Thrombin im Verhältnis 1:1 (v/v) als Aktivator. Zum Beispiel wurden 500 μl CaCl2 mit 500 μl autologem Thrombin gemischt. Nehmen Sie ein Gesamtvolumen von 1 ml des Aktivators auf.

5. PRP-Aktivierung

  1. Mischen Sie PRP und den Aktivator in einem Verhältnis von 10:1 (v/v). Mischen Sie 400 μl PRP mit 40 μl des Aktivators in jedem 1,5-ml-Röhrchen und inkubieren Sie dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Dabei handelt es sich um aktiviertes PRP in koagulierter Form.

6. Lagerung von PRP

  1. Zentrifugieren Sie aktiviertes PRP bei 9.000 x g für 10 min in einer 4 °C Laborzentrifuge.
  2. Sammeln Sie den Überstand mit einer Pipette in eine geeignete Volumenspritze.
  3. Filtrieren Sie den Überstand durch eine 0,22 μm Membran.
  4. Lagern Sie das endgültige PRP bis zur Verwendung bei -80 °C.

7. Messung der Thrombozytenkonzentrationen und der Wachstumsfaktorspiegel

  1. Zählen Sie die Thrombozytenzahl im Vollplasma und PRP mit einem automatisierten Hämatologiesystem (siehe Materialtabelle).
  2. Analysieren Sie die Konzentrationen von PDGF-BB-, IGF- und EGF-Spiegeln im Vollplasma und aktiviertem PRP mit kommerziell erhältlichen ELISA-Kits (siehe Materialtabelle).

8. Zellproliferations-Assay

  1. Isolierung von hASCs mit einer zuvor beschriebenen Methode18.
    1. hASCs mit einer Dichte von 1,0 x 104 Zellen/Well in 24-Well-Kulturplatten säen und über Nacht bei 37 °C in DMEM mit 10 % FBS und Antibiotika inkubieren. Verwenden Sie hASCs aus den Passagen 7-9 in Experimenten.
  2. Ersetzen Sie Zellmedien durch serumfreies DMEM. Nach 6 h wird PRP in den angegebenen Konzentrationen zugegeben und 48 h bei 37 °C weiter inkubiert.
  3. Mit WST-8-Lösung (siehe Materialtabelle) 1 h bei 37 °C inkubieren. Leseabsorption bei 450 nm mit einem Multiwell-Plattenreader.
  4. Erstellen Sie eine Standardkurve: Seed-hASCs mit Dichten von 0, 6.250, 12.500, 25.000, 50.000 und 100.000 Zellen/Well in 24-Well-Platten in DMEM mit 10 % FBS für 3 h. Ablesen der Extinktion bei 450 nm nach Inkubation mit WST-8-Lösung für 1 h bei 37 °C
    1. Zeichnen Sie die Standardkurve, indem Sie die Anzahl der Zellen im Vergleich zu A450 nm darstellen.
  5. Schätzen Sie die Anzahl der hASCs aus der Absorption auf der Grundlage der Standardkurve.

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Ergebnisse

Angereicherte Konzentrationen von Thrombozyten und PDGF-BB in PRP
Die Konzentrationen von Blutplättchen und PDGF-BB in PRP stiegen um das 11,5-fache bzw. 25,9-fache an und damit um das 25,9-fache höher als im gesamten Plasma. Die Konzentrationen von EGF in PRP wurden jedoch nicht verändert, und der IGF-Gehalt betrug nur 70 % des Konzentrationsgehalts von Vollplasma (Tabelle 1). Die Experimente wurden viermal mit der Double-Spin-Methode repliziert.

V...

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Diskussion

Nach der PRP-Aktivierung "aktivieren" mehrere Wachstumsfaktoren wie PDGF, EGF, IGF, TGF-β und VEGF 1,6,7 Zellen und Gewebe von Wunden und fördern so die Wundheilung20,21. Bei der kosmetischen Rekonstruktionschirurgie hat sich gezeigt, dass aktivierte Zellen die Heilung induzieren und die Ästhetik verbessern22,23

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Nicht zutreffend.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
20 mL Spritze, Terumo Spritzenverschluss TypTerumo, Tokio, Japan.SS-20LZP
50 mL Röhrchen, konisches Polypropylen-RöhrchenCorning, NY, USA.352070
Automatisiertes Hämatologie-SystemSysmex Corp., Tokio, JapanXE-2100
Blutentnahmenadel, SafeTouch PSV-Set mit Luer-Adapter, 21 G x 3/4"Nipro, Osaka, Japan.32-384
Blutentnahmeröhrchen, ACD-Lösung Ein Blutentnahmeröhrchen, 8,5 mLBD Vacutainer, NJ, USA.
Blutentnahmeröhrchen, Serumblutentnahmeröhrchen/Monovette, 10 mLBD Vacutainer, NJ, USA.366430
Calciumchlorid, 1 mEq/ml,Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japan.3215400A1061
Kanüle, BS-Nadel ohne Abschrägung, 18 G (1,2 mm) x 75 mmBS Medical, Tokio, Japan.BS-81007Nicht zum Verkauf
Zellzähl-Kit-8Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, JapanCK04
ZentrifugeKokusan, Tokio, Japan.H-19F
ZentrifugeEppendorf, Hamburg, Deutschland.5415R
EnSpire 2300 Multilabel-LesegerätPerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA
FiltereinheitMerck Millipore, Co. Cork, Irland.
EGF Quantikine ELISA Kit für MenschenR& D Systems, Minneapolis, MN, USADEG00
Humanes IGF-I Quantikine ELISA KitR& D Systems, Minneapolis, MN, USADG100
Humanes PDGF-BB Quantikine ELISA KitR& D Systems, Minneapolis, MN, USADBB00
Pipettenspitze, ART 1000 Reach BarrierespitzeThermo Scientific, MA, USA.2079-05-HR
Pipette, Nichipet EXII 100-1000 μ LNichiryo, Saitama, Japan.00-NPX2-1000
Sterling Nitril Power-Free UntersuchungshandschuheKimberly-Clark50707
Yamazen Alkohol zur DesinfektionYamazen Pharmaceutical, Osaka, Japan.Nr. A7L07
364606SLGP033RS

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Double Spin Methodeautologe ThrombinaktivierungThrombozytenzahlmessungProliferationsassayZentrifugationsprotokollZellkulturtechnikAnwendung in der regenerativen MedizinStammzellproliferation
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