Method Article

Steuerung der Durchflussgeschwindigkeiten von Mikrotubuli-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten mithilfe der Temperatur

DOI:

10.3791/60484

⸱

November 26th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Temperatur zu verwenden, um die Fließgeschwindigkeiten dreidimensionaler aktiver Flüssigkeiten zu steuern. Der Vorteil dieser Methode ermöglicht nicht nur die Regelung der Durchflussgeschwindigkeiten vor Ort, sondern auch eine dynamische Steuerung, wie z. B. die regelmäßige Abstimmung der Durchflussgeschwindigkeiten nach oben und unten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir stellen eine Methode zur Temperaturoptimierung der Fließgeschwindigkeiten von kinesingetriebenen, mikrotubulienbasierten dreidimensionalen (3D) aktiven Flüssigkeiten vor. Diese Methode ermöglicht es, die Geschwindigkeiten vor Ort zu optimieren, ohne dass neue Proben hergestellt werden müssen, um unterschiedliche gewünschte Geschwindigkeiten zu erreichen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die dynamische Steuerung der Geschwindigkeit. Durch das Radfahren der Temperatur fließen die Flüssigkeiten in regelmäßigen Abständen schnell und langsam. Diese Steuerbarkeit basiert auf der Arrhenius-Eigenschaft der Kinesin-Mikrotubuli-Reaktion, die einen kontrollierten mittleren Durchflussgeschwindigkeitsbereich von 4–8 m/s demonstriert. Die vorgestellte Methode öffnet die Tür zum Design mikrofluidischer Geräte, bei denen die Durchflussraten im Kanal lokal abstimmbar sind, ohne dass ein Ventil erforderlich ist.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktive Materie unterscheidet sich von konventioneller Passivmaterie aufgrund ihrer Fähigkeit, chemische Energie in mechanische Arbeit umzuwandeln. Ein Material, das eine solche Fähigkeit besitzt, kann aus lebenden oder nicht lebenden Wesen wie Bakterien, Insekten, Kolloiden, Körnern und Zytoskelettfilamenten1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Diese materiellen Entitäten interagieren mit ihren Nachbarn. In größerem Maßstab organisieren sie sich entweder in turbulenten Wirbeln (aktive Turbulenzen) oder Materialflüsse11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Ein Verständnis der Selbstorganisation von aktiver Materie hat zu verschiedenen Anwendungen in molekularen Shuttles, optischen Geräten und paralleler Berechnung21,22,23geführt. Um Anwendungen auf die nächste Stufe zu bringen, bedarf es einer Kontrolle über die Selbstorganisation hinaus. Zum Beispiel entwickelten Palacci et al. ein Hämatit-verkapseltes Kolloid, das nur selbstgetrieben wurde, wenn es manuell kontrolliertem blauem Licht ausgesetzt wurde, was zur Entstehung lebender Kristalle führte24. Morin et al. etablierten die Steuerung der rollenden Quincke-Kolloide durch die Verwendung eines abstimmbaren externen elektrischen Feldes, was zu kolloidalen Beflockungen in einem Rennstrecken-ähnlichen Kanal25führte. Diese früheren Arbeiten zeigen die Rolle der lokalen Kontrolle in Anwendungen und fördern die Wissensbasis der aktiven Materie.

In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Steuerbarkeit von kinesingetriebenen, mikrotubuli (MT)-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten. Die Flüssigkeiten bestehen aus drei Hauptkomponenten: MTs, Kinesin-Molekularmotoren und Depletanten. Die Erschöpfungskräfte induzieren eine Erschöpfungskraft, um die MTs zu bündeln, die später durch Motorcluster überbrückt werden. Diese Motoren laufen entlang der MTsgegenüber des Plus-Ends. Wenn ein Paar überbrückte MTsis antiparallel, die entsprechenden Motoren gehen in entgegengesetzte Richtungen. Die Motoren sind jedoch in einem Cluster gebunden und können nicht auseinandergehen, so dass sie kooperative MT-Paare auseinanderschieben (Interfilament-Gleiten, Abbildung 1A). Diese Gleitdynamik akkumuliert, wodurch sich die MTsto-Bündel bis zum Erreichen ihres Knickinstabilitätspunkts ausdehnen und brechen (Extensile-Bündel, Abbildung 1B)26. Die gebrochenen Bündel werden durch die Erschöpfungskraft geglüht, die sich anschließend wieder ausdehnt, und die Dynamik wiederholt sich. Während des Prozesses der sich wiederholenden Dynamik rühren die Bündelbewegungen die nahe flüssigkeitsnahe und induzierenden Ströme, die durch Doping mit Mikron-Tracern visualisiert werden können (Abbildung 1C). Sanchez et al. und Henkin et al. haben die mittleren Geschwindigkeiten von Tracern charakterisiert und festgestellt, dass die Geschwindigkeiten durch Variation der Konzentrationen von Adenosintriphosphat (ATP), Depletanten, Motorclustern und MTs19,27abstimmbar waren. Eine solche Tunabilität existierte jedoch erst vor der aktiven Flüssigkeitssynthese. Nach der Synthese ging die Tunability verloren und die Flüssigkeiten selbst organisiert auf ihre eigene Weise. Um die aktive Flüssigkeitsaktivität nach der Synthese zu steuern, berichtete Ross.et al. über eine Methode, bei der die lichtaktivierte Dimerisierung von motorischen Proteinen verwendet wurde, so dass die Flüssigkeitsaktivität mit Licht28ein- und ausgeschaltet werden konnte. Während die Lichtsteuerung in Bezug auf die lokale Aktivierung der Flüssigkeiten praktisch ist, erfordert die Methode eine Neugestaltung der Strukturen von motorischen Proteinen sowie die Änderung der optischen Pfade im Mikroskop. Hier bieten wir eine einfach zu bedienende Methode zur lokalen Steuerung von Flüssigkeitsströmen ohne Mikroskopmodifikation unter Beibehaltung der Motorstruktur.

Unsere Methode der lokalen Abstimmung des aktiven Flüssigkeitsflusses basiert auf dem Arrhenius-Gesetz, da die Kinesin-MT-Reaktion mit der Temperatur29,30,31,32zunimmt. Unsere früheren Studien zeigten, dass die Temperaturabhängigkeit der mittleren Geschwindigkeit eines aktiven Flüssigkeitsflusses der Arrhenius-Gleichung folgte: v = A exp(-Ea/RT), wobei A ein präexponentieller Faktor ist, R die Gaskonstante ist, Ea die Aktivierungsenergie und T die Systemtemperatur33. Daher ist die Flüssigkeitsaktivität empfindlich auf die Temperaturumgebung, und die Systemtemperatur muss konsistent sein, um die Motorleistung und damit die Flüssigkeitsdurchflussgeschwindigkeit34zu stabilisieren. In diesem Artikel zeigen wir die Verwendung der Temperaturabhängigkeit des Motors, um die Fließgeschwindigkeiten von aktiven Flüssigkeiten kontinuierlich zu optimieren, indem die Systemtemperatur eingestellt wird. Wir zeigen auch die Herstellung einer aktiven Flüssigkeitsprobe, gefolgt von der Montage der Probe auf einer Mikroskopstufe, deren Temperatur über Computersoftware gesteuert wird. Die Erhöhung der Temperatur von 16 °C auf 36 °C beschleunigt die mittleren Durchflussgeschwindigkeiten von 4 auf 8 m/s. Zusätzlich ist die Tunbarkeit reversibel: Immer wieder erhöht und verringert die Temperatur sequentiell beschleunigt und verlangsamt den Durchfluss. Die demonstrierte Methode ist auf eine Breite von Systemen anwendbar, bei denen die Hauptreaktionen dem Arrhenius-Gesetz gehorchen, wie z. B. der MT-Gleittest29,30,31,32.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung von MTs

VORSICHT: In diesem Schritt reinigen wir Tubuline aus Rinderhirngewebe. Rinderhirn kann Die Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJD)verursachen 35. Daher sollten die Hirnabfälle und die damit verbundenen Lösungen, Flaschen und Pipettenspitzen in einem Bioabfallbeutel gesammelt und nach den Regeln der Institution als biogefährlicher Abfall entsorgt werden.

  1. Reinigen Sie Tubuline aus dem Rinderhirn (modifiziert von Castoldi et al.36).
    1. Transportieren Sie etwa 1,5 kg frische Rinderhirne von einem örtlichen Schlachthof in einen Universitäts-Kühlraum. Während des Transports die Gehirne im Phosphatpuffer (20 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.2) auf Eis lagern.
      HINWEIS: Um die endliche Ausbeute von Tubulin zu maximieren, ist die anfängliche Menge an funktionellem Tubulin im frischen Hirngewebe der Schlüssel. Frischere Gehirne enthalten mehr funktionelles Tubulin. Um die frischesten Gehirne aus dem Schlachthof zu erhalten, empfehlen wir, den Metzger zu bitten, Gehirne von den zuletzt geschlachteten Kühen zur Verfügung zu stellen. Gehirne sollten nicht älter als 3 h sein, wenn das Verfahren begonnen wird, da die Verkürzung der Zeit zwischen Schlachtung und Beginn des Verfahrens zu besseren Erträgen führt.
    2. Homogenisieren und klären Sie die Gehirne.
      1. Reinigen Sie das Gehirn, indem Sie Skalpelle verwenden, um Blutgefäße und Bindegewebe in kleinere Stücke zu schneiden und sie von Hand aus dem Gehirn zu entfernen.
        HINWEIS: Die gereinigten Gehirne sollten rosa sein.
      2. Tauchen Sie das gereinigte Hirngewebe in 1 L Depolymerisationspuffer (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) Ethansäure, 1 mM CaCl2, pH 6,6) pro Kilogramm Gehirn ein.
      3. Homogenisieren Sie das Gehirn mit einem Küchenmixer.
      4. Zentrifugieren Sie die homogenisierte Hirnlösung bei 10.000 x g und 4 °C für 150 min.
    3. Polymerisieren Sie MTs (erste Polymerisation).
      1. Sammeln und mischen Sie den Überstand mit gleichen Volumina der folgenden Lösungen bei 37 °C: Glycerin, hochmolareren PIPES-Puffer (HMPB: 1 M PIPES, 10 mM MgCl2, 20 mM Ethylenglykol-Bis(-Aminoehylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure [EGTA], pH 6.9)
      2. 1,5 mM ATP und 0,5 mM Guanosintriphosphat (GTP) in die Mischung geben.
      3. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 1 h.
    4. Depolymerisieren Sie MTs (erste MT-Depolymerisation).
      1. Pellet MT durch Zentrifugieren bei 151.000 x g und 37 °C für 30 min.
      2. Überstand entsorgen und jedes MT-Pellet in 10 ml 4 °C DB wieder aufhängen.
      3. 30 min auf Eis bebrüten.
      4. Rühren Sie die Mischung alle 5 min mit einer Pipettenspitze, um MT Sedimentation zu vermeiden.
        HINWEIS: Die Mischung sollte sich in 30 min klar machen, was auf den Abschluss der MT-Depolymerisation hinweist.
    5. Polymerisieren Sie MTs (zweite MT-Polymerisation).
      1. Klären Sie die Lösung durch Zentrifugieren bei 70.000 x g und 4 °C für 30 min.
      2. Sammeln und mischen Sie den Überstand mit gleichen Volumina von 37 °C Glycerin und HMPB.
      3. 1,5 mM ATP und 0,5 mM GTP in die Mischung geben.
      4. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 30 min.
    6. Wiederholen Sie Schritt 1.1.4, ersetzen Sie HMPB durch Brinkley Reassembly Buffer (BRB) 80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8), gefolgt von der Klärung der geclearten Mischung durch Zentrifugieren bei 79.000 x g und 4 °C für 30 min.
    7. Sammeln Sie den Überstand. Messen Sie die 280 nm Absorption mit einem Spektrometer. Bestimmen Sie die Tubulinkonzentration nach dem Beer-Lambert-Gesetz (Aussterbekoeffizient von Tubulin: 1,15 (mg/ml)-1cm-1)37,38.
    8. Bewahren Sie das Protein bei -80 °C auf.
  2. Recycling-Tubuline (modifiziert von Castoldi et al.36).
    HINWEIS: Um die Tubulinrität zu verbessern, wird das gereinigte Tubulin wieder polymerisiert und depolymerisiert.
    1. Polymerisieren Sie die MTs, indem Sie das gereinigte Tubulin (Schritt 1.1.7) mit 500 'M Dithiothreitol (DTT) und 20 'M GTP mischen, gefolgt von 30 min Inkubation bei 37 °C.
    2. Pellet die MTs.
      1. 1 ml Glycerinkissen (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v Glycerin, pH 6.8) in den Boden eines Zentrifugenrohrs geben.
      2. Legen Sie die polymerisierten MTs auf das Kissen.
      3. Zentrifuge bei 172.000 x g für 90 min bei 37 °C.
    3. Depolymerisieren Sie die MTs.
      1. Entfernen Sie den Überstand und Kissen.
      2. Setzen Sie jedes MT-Pellet in 150 l mit 4 °C MT-Puffer (M2B: 80 mM PIPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8) wieder auf.
      3. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 30 min.
      4. Rühren Sie die Mischung mit einer Pipettenspitze alle 5 min. Die Mischung sollte klar werden.
    4. Klären Sie die Mischung durch Zentrifugieren bei 172.000 x g und 4 °C für 30 min.
    5. Sammeln Sie den Überstand. Messen Sie die Proteinkonzentration. Bei -80 °C lagern.
  3. Beschriften Sie das Tubulin mit fluoreszierendem Farbstoff39.
    1. Polymerisieren Sie die MTs. Mischen Sie das gereinigte Tubulin (Schritt 1.1.7) mit 500 M DTT und 16,7 M GTP, und brüten Sie die Mischung bei 37 °C für 30 min.
    2. Pellet die MTs.
      1. 1 ml 37 °C High-pH-Kissen (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v Glycerin, pH 8,6) in ein Zentrifugenrohr geben.
      2. Legen Sie die polymerisierten MTs auf das Kissen.
      3. Zentrifuge bei 327.000 x g für 50 min bei 37 °C.
    3. Label Tubulin.
      1. Setzen Sie jedes MT-Pellet mit 700 l 37 °C-Etikettierpuffer (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 40% v/v Glycerin, pH 8,6) wieder auf.
      2. Mischen Sie die Suspension mit einem 10-20 MolarenÜberschuss an weitrotem Fluoreszenzfarbstoff funktionalisiert mit einem Succinimidylester.
      3. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 30 min im Dunkeln, damit die MTs mit dem Ester des Fluoreszenzfarbstoffs reagieren können.
      4. Beenden Sie die Etikettierungsreaktion, indem Sie den Ester des aufhängenden Farbstoffs mit 50 mM K-Glutamat sättigen und 5 min bei 37 °C inkubieren.
    4. Pellet die beschrifteten MTs: Wiederholen Sie Schritt 1.3.2, ersetzen Sie das High-pH-Kissen durch Low-pH-Kissen (80 mM Rohre, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v Glycerin, pH 6.8).
    5. Depolymerisieren Sie MTs.
      1. Entsorgen Sie den Überstand und das Kissen.
      2. Das Pellet in 700 l mit 4 °C M2B wieder aufhängen.
      3. Inkubieren Sie die Suspension auf Eis.
      4. Alle 5 min mit einer Pipettenspitze aufräumen, bis die Lösung klar ist.
    6. Klären Sie die geklärte Lösung durch Zentrifugieren bei 184.000 x g und 4 °C für 35 min.
    7. Verbessern Sie die Reinheit der beschrifteten Tubulinlösung, indem Sie die Schritte 1.2.1–1.2.4 wiederholen.
    8. Messen Sie die Konzentration von Proteinen und Fluoreszenzfarbstoffen. Verwenden Sie diese Messungen, um die Tubulinkonzentration und die Fraktionen von markiertem Tubulin zu bestimmen, definiert als das Verhältnis der Konzentrationen von Fluoreszenzfarbstoff zu Tubulin.
    9. Bewahren Sie die beschriftete Tubulinlösung bei -80 °C auf.
  4. Polymerisieren Sie die MTs (angenommen von Sanchez et al.19):
    1. Mischen Sie das recycelte Tubulin (Schritt 1.2.5) mit beschriftetem Tubulin (Schritt 1.3.9) in einem Verhältnis, das eine 3% markierte Tubulinfraktion ergibt.
    2. Mischen Sie die 8 mg/ml Tubulin-Mischung mit 1 mM DTT und 0,6 mM Guanosin-5'[()-Methyleno]triphosphat (GMPCPP), gefolgt von 30 min Inkubation bei 37 °C.
    3. Nach der Inkubation die MTs bei Raumtemperatur im Dunkeln für 6 h annealieren.
    4. Aliquot und lagern bei -80 °C.

2. Synthetisieren von Kinesin-Clustern

HINWEIS: Bakterien existieren allgegenwärtig und können in den Medien wachsen und den Herstellungsprozess kontaminieren. Um eine Kontamination zu verhindern, müssen Aktionen mit Kontakt mit den Zellkulturen (z. B. Pipettierung) in der Nähe einer Flamme durchgeführt werden. Werkzeuge wie Kolben, Pipetten, Pipettenspitzen, Medien und Platten MÜSSEN vor der Verwendung autoklaviert werden.

  1. Express-Kinesinmotoren in Escherichia coli40.
    1. Transformieren Sie die Zellen.
      1. Pipette 1 l des K401-BCCP-H6-Plasmids in 10 l kompetente Zellen.
      2. 5 min auf Eis bebrüten.
      3. Hitzeschock bei 42,5 °C für 45 s.
      4. Inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 2 min, um eine Erholung zu ermöglichen.
      5. Mischen Sie die Zellen mit 300 l antibiotikafreiem 2XYT (5 g/L NaCl, 10 g/L Hefeextrakt, 16 g/L Trypton).
      6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 1 h.
        HINWEIS: Sofern nicht angegeben, ist eine Überwachung des Zellwachstums während der Inkubation nicht erforderlich.
    2. Inokulatierte Plattenmedien.
      1. Die Zellkultur auf einer 2XYT-Platte (10 g/L NaCl, 5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L Trypton, 15 g/L Agar, 100 g/ml Ampicillin, 25 g/ml Chloramphenicol) verteilen.
      2. Die Platte über Nacht bei 37 °C auf den Kopf stellen.
    3. Flüssige Medien impfen.
      1. Von der Nachtplatte eine isolierte Kolonie mit einer Pipettenspitze ernten.
      2. Die Spitze in einen Kolben mit 50 ml 2XYT auswerfen.
      3. Bebrüte und schütteln Sie die Kulturmedien bei 37 °C und 200 Umdrehungen von 12 bis 16 Stunden.
    4. Erweitern Sie die Zellen.
      1. Mischen Sie 2,5 ml der Zellkultur in 500 ml 2XYT.
      2. Die 500 ml-Kultur bei 37 °C und 250 Umdrehungen von 1/min für 3–6 h bebrüten und schütteln.
    5. Induzieren Sie die Proteinexpression.
      1. Überwachen Sie während der Inkubation das Zellwachstum, indem Sie die Absorption bei 600 nm messen, indem Sie 2XYT als Referenz verwenden. Messen Sie die Absorption alle 60 min, bis sie OD600 = 0,3 erreicht. Messen Sie dann die Absorption alle 30 min, bis sie 0,5–0,6 erreicht.
      2. Lassen Sie die Zellen wachsen, bis die Absorption OD600 = 0,5–0,6 erreicht.
      3. Fügen Sie der Zellkultur 24 g/ml Biotin und 1 mM Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) hinzu.
        HINWEIS: IPTG wird verwendet, um die Proteinexpression der Kinesinmotoren zu induzieren, die mit Biotin-Carboxylträgerprotein (BCCP) und sechs Histiminien (H6) markiert sind. Das H6-Tag wird im Reinigungsprozess (Schritt 2.2) verwendet, während BCCP an die zugesetzten Biotinmoleküle bindet, um die exprimierten Kinesinmotoren zu biotinylatieren.
      4. Die Zellkultur bei 20 °C und 250 Umdrehungen von 12 bis 20 H bebrüten und schütteln.
    6. Ernte der Zellen durch Zentrifugieren bei 5.000 x g und 4 °C für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand. Bewahren Sie die Zellpellets bei -80 °C auf.
  2. Reinigen Sie das Kinesin-Motorprotein (modifiziert von Spriestersbach et al.41):
    1. Setzen Sie das Zellpellet (Schritt 2.1.6) mit einem gleichen Volumen von Lysepuffer (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 m ATP, 10 mM 2-Mercaptoethanol (ME), 20 mM Imidazol, pH 7,2), gefolgt von einer Tablette Proteasehemmer, 2 mg Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 2 mg Lysozyzym.
    2. Lyse die Zellen durch Blitz einfrieren in flüssigem Stickstoff (LN) 3x und auftauen die Zellmischung.
      HINWEIS: Nach dem Lysing sollte die Mischung zähflüssig werden.
    3. Klären Sie das lysierte Zellgemisch durch Zentrifugieren bei 230.000 x g und 4 °C für 30 min.
    4. Sammeln Sie den Überstand und fließen Sie ihn durch eine Gravitationssäule, gefolgt vom Waschen der Säule mit 10 ml Lysepuffer.
      HINWEIS: Proteine mit einem H6-Tag, wie Kinesin K401-BCCP-H6, sollten in der Spalte verbleiben.
    5. Eluieren Sie das markierte Protein mit 5 ml Elutionspuffer (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 'M ATP, 500 mM Imidazol, pH 7.2). Sammeln Sie den Durchfluss sequenziell in 1 ml-Fraktionen. Um die proteinhaltigen Fraktionen zu bestimmen, mischen Sie 3 l jeder Fraktion mit 100 l Triphenylmethanfarbstoff. Die proteinhaltigen Fraktionen sollten blau werden. Kombinieren Sie diese Fraktionen und verdünnen Sie durch 5x mit Lysepuffer.
    6. Konzentrieren Sie die Proteinlösung.
      1. Laden Sie die Lösung in ein Zentrifugalfilterrohr.
      2. Zentrifuge bei 3.000 x g für 10 min bei 4 °C.
      3. Das Rohr vorsichtig schütteln und zentrieren, bis das Lösungsvolumen <3 ml beträgt.
    7. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Spektrometer (Aussterbekoeffizient: 0,549 (mg/ml)-1cm-1)42,43. Verdünnen Sie das Protein auf 1 mg/ml, während Sie 35% w/v Saccharose hinzufügen.
    8. Bei -80 °C lagern.
  3. Messen Sie die Kinesinkonzentrationen mit einem Elektrophorese-Gel (modifiziert von Taylor et al.44).
    HINWEIS: Um die Kinesinkonzentration mit einem Elektrophorese-Gel zu messen, ist Tubulin aufgrund seiner hohen Reinheit und seiner messbaren Konzentration über ein Spektrometer (Abbildung 2A)36eine ideale Konzentrationsleiter.
    1. Bereiten Sie Tubulinproben mit Konzentrationen von 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 und 1,25 mg/ml vor. Mischen Sie 15 l jeder Tubulin-Probe und Kinesinprobe (Schritt 2.2.8) getrennt mit 5 l Probenpuffer (200 mM Tris-HCl, 8% Natriumdodecylsulfat (SDS), 400 mM DTT, 0,2% Bromphenolblau, 40% Glycerin, pH 6,8) und inkubieren bei 90 °C für 3 min.
    2. Bereiten Sie die Elektrophorese vor.
      1. Verriegeln Sie ein Elektrophorese-Gel in die Gelbox.
      2. Füllen Sie die Box mit Laufpuffer (50 mM MOPS, 50 mM Tris Basis, 0,1% SDS, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 7,7).
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Pufferebene über der oberen Öffnung des Gels befindet.
    3. 10 L Protein-Standardleiter, Tubulinproben und Kinesinproben in separate Brunnen laden und 45 min 200 V über das Gel auftragen.
    4. Gel färbung.
      1. Das Gel mit gekochter (ca. 95 °C) Fleckenlösung A (0,5 g/L Triphenylmethanfarbstoff, 10% v/v Essigsäure, 25% Isopropanol) für 5 min inkubieren und gestein, dann das Gel mit deionisiertem (DI) Wasser abspülen.
      2. Wiederholen Sie dies mit den Farblösungen B (0,05 g/L Triphenylmethanfarbstoff, 10 % v/v Essigsäure, 10 % Isopropanol), C (0,02 g/L Triphenylmethanfarbstoff, 10 % v/v Essigsäure) und D (10 % v/v Essigsäure) nacheinander. Das Gel über Nacht in DI-Wasser brüten und schaukeln.
    5. Scannen Sie das Gel. Konvertieren Sie das Gelbild in ein Graustufenbild, gefolgt von einer Schwarzweiß-Inversion und Kontrastverbesserung, um helle Proteinbänder im schwarzen Hintergrund anzuzeigen.
    6. Messen Sie die Helligkeit jedes Bandes, indem Sie die Pixelwerte summieren. Wenden Sie die lineare Passung C = aB + ban, wobei B die Helligkeit eines Tubulinbandes, C die entsprechende Konzentration und a und b passende Parameter sind. Bestimmen Sie die Konzentration von Kinesin Ck, indem Sie die Helligkeit des Kinesinbandes Bk verwenden, um die lineare Gleichung zu berechnen: Ck = aBk + b.
  4. Clustern Sie die Kinesinmotoren.
    1. Mischen Sie 1,5 m Kinesin (Schritt 2.2.8) mit 120 M DTT und 120 nM Streptavidin. 30 min auf Eis bebrüten.
    2. Bei -80 °C lagern.

3. Bereiten Sie polyacrylamidbeschichtete Glasglyse und Abdeckungen (modifiziert von Lau et al.45)

  1. Laden Sie neue Glasschieber und Glasabdeckungen in entsprechende Behälter. Die Rutschen und Deckelinlagen in 1% v/v Waschmittel in DI-Wasser untertauchen und dann das Wasser in einer Mikrowelle kochen.
  2. Beschallen Sie die Rutschen und Abdeckungen für 5 min und spülen Sie dann mit DI-Wasser, um Reinigungsmittel zu entfernen.
  3. Untertauchen und beschallen Sie die Rutschen und Deckellipsen in Ethanol für 5 min. Spülen Sie mit DI-Wasser.
  4. Untertauchen und beschallen Sie die Dias und Abdeckungen in 100 mM Kaliumhydroxid (KOH) für 5 min. Mit DI-Wasser abspülen.
  5. Die Dias und Deckelinlipse in einer Silanlösung (1% Essigsäure und 0,5% 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat in Ethanol) 15 min inkubieren und dann mit DI-Wasser abspülen.
  6. Inkubieren Sie die Dias und Abdeckungen in Acrylamidlösung (2% w/w Acrylamid, 0,7 mg/ml Ammoniumpersulfat und 0,0035% v/v Tetramethylethylendiamin in DI-Wasser) für 3 h.
  7. Bewahren Sie die Dias und Abdeckungen in der Acrylamidlösung auf.

4. Bereiten Sie kinesingetriebene, MT-basierte Aktive Flüssigkeiten vor

  1. Bereiten Sie aktive Flüssigkeiten (modifiziert von Sanchez et al.19).
    HINWEIS: Die folgenden Schritte veranschaulichen den Prozess der Herstellung von 100 l einer aktiven Flüssigkeit anhand von Beispielbeständen. Das Endvolumen ist skalierbar, und die Konzentrationen der Beispielbestände können angepasst werden, solange die Endkonzentration der einzelnen Komponenten beibehalten wird.
    1. Mischen Sie 16,7 l mit 8 mg/ml MTs (Schritt 1,4,4) mit 6,7 l mit 1,8 -M-Kinesin-Motorclustern (Schritt 2,4,2) und 1,1 l mit 500 mM DTT in Hochsalz-M2B (M2B + 3,9 mM MgCl2).
    2. Bündeln Sie MTs durch Zugabe von 11,4 l 7% w/w Polyethylenglykol (PEG).
    3. Aktivieren Sie Kinesinmotoren, indem Sie 2,8 l von 50 mM ATP hinzufügen.
    4. Halten Sie die ATP-Konzentrationen aufrecht, indem Sie 2,8 l Pyruvatkinase/Laktatdehydrogenase (PK/LDH) und 13,3 l von 200 ml Phosphenolpyruvat (PEP) hinzufügen.
    5. Reduzieren Sie die Photobleichwirkung, indem Sie 10 l von 20 mM Trolox, 1,1 l 3,5 mg/ml Kataalase, 1,1 l mit 20 mg/ml Glukoseoxidase und 1,1 l 300 mg/ml Glukose hinzufügen.
    6. Verfolgen Sie die Bewegung der Flüssigkeit, indem Sie 1,6 l von 0,025 % v/v Tracerpartikeln hinzufügen.
    7. Fügen Sie Hochsalz-M2B hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 l zu erreichen.
      HINWEIS: Die Mischaufträge in den Schritten 4.1.1–4.1.6 sind austauschbar. Sobald jedoch ATP, MTs und die Motoren gemischt sind, beginnen die Motoren, ATP zu verbrauchen, während sie die MTs entlang treten. Die Probe wird aufgrund der begrenzten Kraftstoffe (ATP und PEP) mit einer begrenzten Lebensdauer aktiviert, daher sollte das Experiment umgehend gestartet werden. Die endgültige Aktive Flüssigkeit sollte 1,3 mg/ml MT, 120 nM Kinesin-Motorcluster, 5,5 mM DTT, 0,8 % mit PEG, 1,4 mM ATP, 2,8 % v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0,038 mg/ml Kataalase, 0,22 mg/ml Glukoseoxidase, 3,3 mg/ml Glukose und 0,0004 % v/void in Salz-M2B.
  2. Bereiten Sie eine Probe in einem Strömungskanal vor (modifiziert von Chandrakar et al.46):
    1. Spülen Sie einen polyacrylamidbeschichteten Glasschlitten und Einen Deckelschlupf (Schritt 3.7) mit DI-Wasser. Trocknen Sie die Gläser mit Druckluft. Auf eine saubere, flache Oberfläche stellen.
    2. Schneiden Sie zwei Streifen von Wachsfolien mit einer Breite von 3 mm und der gleichen Länge wie der Glasdeckel (20 mm). Legen Sie die Streifen als Kanalabstandhalter zwischen dem Schieberegler und dem Coverslip ein.
    3. Das Glas an der Wachsfolie anbringen, indem Sie den Glaswachskomplex auf eine 80 °C-Kochplatte legen, um das Wachs zu schmelzen. Während des Schmelzens den Deckelrutsch vorsichtig mit einer Pipettenspitze drücken, um den Wachsfilm gleichmäßig an den Glasoberflächen zu befestigen. Nach der Haftung den Glaskomplex auf Raumtemperatur abkühlen.
    4. Laden Sie die aktiven Flüssigkeiten (Schritt 4.1) in den Strömungskanal. Versiegeln Sie den Kanal mit UV-Kleber.

5. Kontrolle der Probentemperatur

  1. Erstellen Sie eine Temperaturregelung (modifiziert von Designs in Lowensohn et al. und Wu et al.47,48,49).
    1. Bereiten Sie einen Aluminium-Kühlblock vor.
      1. Fräsen Sie eine Aluminiumplatte mit Abmessungen von ca. 30 mm x 30 mm x 5 mm.
      2. Bohren Sie einen internen Kanal durch die Platte (Abbildung 3A) und installieren Sie Schlaucharmaturen an den Kanalenden.
      3. Haken Sie jede Anbringung an ein Wasserrohr.
      4. Schließen Sie ein Rohr an eine Fischtankpumpe in einem Wasserreservoir an, während Sie das andere Rohr zum Reservoir verlängern.
        HINWEIS: Die Pumpe zirkuliert Reservoirwasser durch die Aluminium-Innenkanäle, um die Blocktemperatur bei etwa Raumtemperatur zu halten.
    2. Verdrahten Sie einen thermoelektrischen Kühler (TEC) und einen Thermosensor mit einem Temperaturregler. Schließen Sie den Controller über einen USB-Anschluss an einen Computer an (Abbildung 3B).
    3. Verdrahten Sie den Temperaturregler mit einem Gleichstrom-Netzteil ( DC). Schalten Sie den Controller ein, indem Sie das Netzteil an eine Steckdose anschließen.
    4. Führen Sie die Ersteinrichtung des TEC nach der Anleitung des Controllerherstellers durch. Testen Sie den TEC-Ausgang. Es wird empfohlen, den Temperaturregler über eine vom Hersteller bereitgestellte Software zu steuern, was die Aufzeichnung von thermosensorischen Daten und eine einfachere Manipulation des Temperaturreglers ermöglicht.
    5. Identifizieren Sie die Heiz- und Kühlseiten des TEC.
    6. Befestigen Sie die Kühlseite des TEC mit Thermopaste am Kühlblock (Schritt 5.1.1).
    7. Befestigen Sie eine Saphirscheibe mit Thermopaste an der Wärmeseite des TEC.
    8. Die Einrichtung ist abgeschlossen. Die Saphiroberfläche und der Thermosensor können eine Probe kontaktieren, um die Probe basierend auf ihrer Temperatur und Zieltemperatur abzukühlen und zu erwärmen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, dass der TEC und der Kühlblock eine ausgerichtete zentrale Bohrung für die Abbildung der Proben mittels Hellfeldmikroskopie haben (Abbildung 3C).
  2. Verwenden Sie das Temperaturregelungs-Setup, um die Probentemperatur33zu steuern.
    1. Montieren Sie das Beispiel am Setup.
      1. Legen Sie die aktive Flüssigkeitsprobe (Schritt 4.2.4) auf die Saphiroberfläche, wobei die Gleitseite die Oberfläche ankortiert.
      2. Sichern Sie die Glasfolie mit Papierband.
      3. Befestigen Sie den Thermosensor mit Kupferband an der Deckbedeckungsoberfläche.
    2. Montieren Sie das Setup auf einer Mikroskopbühne mit der abdeckungsrutschigen Seite, die den Zielen zugewandt ist. Bei einem invertierten Mikroskop sollte beispielsweise die Abdeckungsrutschseite nach unten. Sichern Sie das Setup ggf. mit Papierband und den Mikroskop-Stufennadelklemmen.
      HINWEIS: Die vorgestellte Temperaturstufe sollte mit gängigen Mikroskopen arbeiten, die entweder invertiert oder aufrecht sind. Um sicherzustellen, dass die Temperaturstufe während des Experiments nicht bewegt wird, ist es am besten, die Temperaturstufe mit Klebeband auf die Mikroskopstufe zu befestsichern.
    3. Steuern Sie die Probentemperatur.
      1. Schalten Sie den Temperaturregler und die Fischtankpumpe ein.
      2. Folgen Sie der Anleitung des Herstellers, um die Zieltemperatur einzustellen und die Temperaturregelung zu aktivieren. Der Regler passt die Vom Thermosensor ermittelte Heiz- oder Kühlleistung basierend auf der Zieltemperatur und der Probentemperatur an.
    4. Zeichnen Sie Probentemperaturen auf.
      1. Folgen Sie dem Leitfaden des Herstellers, um Thermosensor-Temperaturdaten während des Experiments aufzuzeichnen.
        ANMERKUNG: Die Probentemperatur sollte nun vom Controller gesteuert und vom Computer aufgezeichnet werden (Abbildung 3D).

6. Charakterisieren Sie die aktive Flüssigkeitsaktivität (modifiziert von Methoden von Henkin et al. und Wu et al.20,27)

HINWEIS: Die vorherigen Abschnitte werden verwendet, um aktive Flüssigkeitsproben zu erstellen (Abschnitte 1–4) und deren Temperatur zu steuern (Abschnitt 5). Um die Verwendung von Temperatur zur Steuerung der aktiven Flüssigkeitsaktivität zu demonstrieren, beobachten Sie das Flüssigkeitsverhalten, analysieren sie ihre Aktivitäten und charakterisieren sie ihre Reaktion auf die Temperatur.

  1. Überwachen Sie Tracer.
    1. Stellen Sie die Probe mit einem konstanten Intervallmit Hilfe der Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP) dar, um die Bewegung der Tracerpartikel zu erfassen.
      ANMERKUNG:Es sollte so gewählt werden, dass die Tracerbewegung verfolgt werden kann. Große Werte, z.B. 100 s, führen zum Verlust der Tracer-Trajektorien, während kurzeWerte, z. B. 0,1 s, verhindern, dass der Tracking-Algorithmus die Tracerbewegung zwischen Frames erkennt. Ein arbeitendest sollte es ermöglichen, dass die Tracerverschiebung zwischen Frames innerhalb von 9 Pixeln liegt. Für bildgebende Tracer, die sich mit einem 4x Objektiv bei 10 'm/s bewegen,wird empfohlen, 1–5 s zu sein.
    2. Speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien, benennen Sie die Dateien basierend auf der Framenummer, und speichern Sie sie in einem separaten Ordner. Diese Prozesse sind notwendig, um sicherzustellen, dass die erfassten Bilder mit dem bereitgestellten MATLAB-Skript korrekt analysiert werden (Schritt 6.2.2).
  2. Track Tracer unter Annahme der Tracking-Software von Ouellette et al.50,51entwickelt ):
    1. Laden Sie die Tracking-Software vom Environmental Complexity Laboratory der Stanford University (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml) herunter. Stellen Sie sicher, dass sich jede MATLAB-Datei im selben Ordner befindet.
    2. Verfolgen Sie Tracer mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Skript: particle_tracking.m. Das Skript liest Tracer-Bilder (Schritt 6.1) und verfolgt Tracer-Bewegungen mit der Software von Ouellette et al.50,51. Es gibt zwei Dateien aus: 1) background.tif, die den Bildhintergrund darstellen, und 2) Tracking.mat, die die Partikelbahnen und Geschwindigkeiten in jedem Frame enthalten (Abbildung 4A).
  3. Analysieren Sie die Mittelwertgeschwindigkeiten des Tracers mithilfe eines benutzerdefinierten MATLAB-Skripts: analysis.m. Das Skript liest die Tracking-Datei (Tracking.mat) und gibt die mittlere Geschwindigkeit von Tracern im Vergleich zur Zeit aus, zusammen mit einer zeitgemittelten Mittleren Geschwindigkeit mit angegebenen Mittelungsfenstern (Abbildung 4B)33.
  4. Zeichnen Sie die zeitgemittelte Mittlere Geschwindigkeit auf.
  5. Messen Sie die zeitgemittelte Mittlere Geschwindigkeit, indem Sie das Experiment (Schritte 4, 5.2 und 6.1–6.4) bei 10–40 °C wiederholen. Verwenden Sie die aufgezeichneten mittleren Geschwindigkeiten, um die mittlere Geschwindigkeit vs. Temperatur zu zeichnen (Abbildung 4C)33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Vorbereitung der kinesingetriebenen, MT-basierten Aktivenflüssigkeiten erfordert sowohl Kinesin als auch MTs. Die MTs wurden aus markierten Tubulinen (Schritte 1.3 und 1.4) polymerisiert, die von Rinderhirnen gereinigt wurden (Schritt 1.1, Abbildung 2A), gefolgt von Recycling zur Verbesserung der Reinheit (Schritt 1.2, Abbildung 2B). Die Kinesin-Motorproteine wurden in E. coli exprimiert und gereinigt (Schritte 2.1 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Kontrolle der aktiven Materie vor Ort öffnet die Tür zur gerichteten Selbstorganisation der aktiven Materie4,5,24,28,54. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll zur Verwendung von Temperatur zur Steuerung von kinesingetriebenen, MT-basierten Aktivenflüssigkeiten vor Ort vor, basierend auf der Arrhenius-Kennlinie des Systems29

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasmid K401-BCCP-H6 war ein Geschenk von Dr. Zvonimir Dogic. Diese Forschung wurde vom Start-up-Fonds von Dr. Kun-Ta Wu im Worcester Polytechnic Institute unterstützt. Wir danken Dr. Zvonimir Dogic für die Protokolle zur Reinigung und Kennzeichnung von Tubulin und zur Synthese von Aktivenflüssigkeiten. Wir danken Dr. Marc Ridilla für seine Expertise in der Proteinexpression und -reinigung. Wir danken Dr. William Benjamin Roger für die Unterstützung beim Bau der temperaturgeregelten Bühne. Wir würdigen Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) für die Nutzung der Biological Materials Facility (BMF). Wir würdigen die Royal Society of Chemistry für die Anpassung der Figuren von Bate et al. auf Soft Matter33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäureSigma-Aldrich238813Trolox
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC216550050
3,2mm Innendurchmesser Tygon Tubing R-3603HACH2074038Wasserschläuche
31,75 mm Durchmesser unbeschichtet, SaphirfensterEdmund Optics43-637Saphirscheibe
3M 1181 Kupferband - 1/2 Zoll Breite x 18 YD Länge - 2,6 MIL Gesamtdicke - 27551R.S. HUGHES054007-27551Kupferband
EssigsäureSigma-AldrichA6283
Acrylamidlösung (40%/Elektrophorese), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1402-1
Adenosin-5'-Triphosphat-DikaliumsalzhydratSigma-AldrichA8937ATP
Alexa Fluor 647 NHS-Ester (Succinimidylester)Thermo Fisher ScientificA20006Hellroter Fluoreszenzfarbstoff. Alexa 647 kann vor dem Mischen mit Mikrotubuli in Dimethylsulfoxid (DMSO) vorsuspendiert werden (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 ZentrifugalfiltereinheitSigma-AldrichUFC801024Zentrifugalfilterrohr. Cutoff-Molekulargewicht: 10 kDa
Ammoniumpersulfat, 100 g, MP BiomedicalsFisher ScientificICN802829APS
Ampicillin Natriumsalz (kristallines Pulver), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1760Ampicillin
AntivibrationstischNikon63-7590S
Avanti J-E ZentrifugeBeckman Schar369001
Bacto Agar Lötmittel, BD DiagnosticsVWR90000-760Agar
BiotinAlfa Aesar A14207
Eimer-Kunststoff weiß - 2 GallonenBon84-715Wassereimer
CalciumchloridSigma-Aldrich746495CaCl2
Katalase aus RinderleberSigma-AldrichC40
CFI Plan Apo Lambda 4x ObjNikonMRD000454x Luftobjektiv
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero ShiftNikon96372GFP Filterwürfel
CH-109-1.4-1.5TE TechnologyCH-109-1.4-1.5Thermoelektrischer Kühler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificC0378
KühlblockN/AN/ACustom gefrästes Aluminium
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400Bio-Rad1610400Triphenylmethan-Farbstoff
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichG7528
Dimethylsulfoxid (zertifiziert ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificD128DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, für Biochemie, ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050DTT
DOWSIL 340 KühlkörperverbindungDow1446622Wärmeleitpaste
ETHYLALKOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON Poly CubePharmco by GreenfieldGlobal 111000200CB05
Ethanol Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-TETRAESSIGSÄURESigma-AldrichE3889EGTA
EthylendiamintetraessigsäureSigma-Aldrich798681EDTA
Fisher BioReagenzien Mikrobiologie Medien Additive: TryptonFisher ScientificBP1421Trypton
Fisher BioReagenzien Mikrobiologie Medien Additive: HefeextraktFisher ScientificBP1422Hefeextrakt
Fluoresbrite YG Mikrosphären, Kalibriergrad 3,00 & Mikro; mPolysciences18861Tracer-Partikel
Glukoseoxidase aus Aspergillus nigerSigma-AldrichG2133
GlycerinSigma-AldrichG5516
GpCppJena BioscienceNU-405LGuanosin-5'[ (α,β)-Methyleno]triphosphat (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 Fuß, 99,9 % verseiltes sauerstofffreies Kupfer OFC, rot/schwarz 2-adriges gebundenes Zip-Kabel Strom-/Lautsprecher-Elektrokabel für Auto, Audio, HeimkinoAmazonB07428NBCWKupferdraht
Guanosin 5'-Triphosphat-NatriumsalzhydratSigma-AldrichG8877GTP
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939Reinigungsmittel
HEPES Natriumsalz (weißes Pulver), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP410NaHEPES
Hochleistungs-MischmaschineAIMORESAS-UP1250Mixer
His GraviTrapGE Healthcare11003399Schwerkraftsäule
ImidazolSigma-AldrichI5513
IPTGSigma-AldrichI6758Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid
Isopropylalkohol 99%Pharmco by Greenfield Global231000099 Isopropanol
JA-10 RotorBeckman Coulter369687
L-Glutaminsäure KaliumsalzmonohydratSigma-AldrichG1501K-Glutamat
Lysozym aus HühnereiweißSigma-AldrichL6876
Magnesiumchlorid-HexahydratSigma-AldrichM2670MgCl2• 6H2O
MES NatriumsalzSigma-AldrichM50572-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
Natriumsalz MOPSSigma-AldrichM12543-(N-Morpholino)propansulfonsäure
MP-3022TE TechnologyMP-3022Thermoelement
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC138450500TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS SpektralphotometerThermo Fisher ScientificE112352Spektrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverses MikroskopNikonMEA54000
Norland Optischer Klebstoff 81Norland ProductsNOA81UV-Kleber
Novex Sharp Pre-stained Protein StandardThermo Fisher ScientificLC5800Protein Standard
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,5 mm, 10-wellThermo Fisher ScientificNP0335BOXSDS
Gel Optima L-90K UltrazentrifugeBeckman Coulter365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" breit; 125 Ft/RolleCole-ParmerEW-06720-40Wachsfilm
Pe 300 ultra Beleuchtungssystem Single Band, 3mm Lichtleitersteuerung Pod NetzteilNikonPE-300-UT-L-SB-40Cooler LED-Strahler
PhenylmethansulfonylfluoridSigma-Aldrich78830PMSF
Phosphoenolpyruvinsäure Monokaliumsalz, 99%BeanTown Chemisches129745PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23200
Pierce Proteaseinhibitor Mini-TablettenThermo Fisher ScientificA32953
ROHRESigma-AldrichP67571,4-Piperazindiethansulfonsäure
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
Poly(ethylenglykol)Sigma-Aldrich81300PEG. Durchschnittliches Molekulargewicht 20.000 Da
Kaliumhydroxid (Pellets/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificP250-500KOH
PowerEase 300W Netzteil (115 VAC)ThermoFisher ScientificPS0300DC Netzteil der Gelbox
PS-12-8.4ATE TechnologyPS-12-8.4ADC Netzteil des Temperaturreglers
Pyruvat-Kinase/Milchsäuredehydrogenase-Enzyme aus KaninchenmuskelnSigma-AldrichP-0294PK/LDH
Quiet One Lifegard Springbrunnenpumpe, 296 Gallonen pro StundeAmazonB005JWA612Aquarienpumpe
Rosetta 2(DE3)pLysS Kompetente Zellen - NovagenMillipore Sigma71403Kompetente Zellen
Sharp Mikrowelle ZSMC0912BS Sharp 900W Arbeitsplatten-Mikrowellenherd, 0,9 Kubikfuß, EdelstahlAmazonB01MT6JZMRMikrowelle zum Kochen von Wasser
Natriumchlorid (kristallin/ACS-zertifiziert), Fisher ChemicalFisher ScientificS271-500NaCl
NatriumdodecylsulfatSigma-AldrichL3771SDS
Natriumphosphat monobasischSigma-AldrichS8282NaH2PO4
Streptavidin ProteinThermo Fisher Scientific21122
SaccharoseSigma-AldrichS7903
TC-720TE TechnologyTC-720Temperaturregler
Tris Base, Molekularbiologie - CAS 77-86-1 - CalbiochemSigma-Aldrich648310Tris-HCL
Typ 45 Ti RotorBeckman Schar339160
Typ 70 Ti RotorBeckman Schar
Typ 70.1 Ti RotorBeckman Coulter342184
VWR Allzweck-Labor-BeschriftungsbandVWR89097-916Papierbänder
VWR Micro Cover Gläser, quadratisch, Nr. 1 1/2VWR48366-227Glasdeckgläser
VWR Plain und Frosted Micro Dias, PremiumVWR75799-268Glasdias
XCell SureLock Mini-CellThermoFisher ScientificEI0001Gelbox
ZYLA 5.5 USB3.0 KameraNikonZYLA5.5-USB3Monochrome CCD-Kamera
Leiter337922

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002(2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102(2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114(2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375(2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470(2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688(2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1(2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246(2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564(2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486(2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601(2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037(2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102(2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142(2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102(2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333(1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006(2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304(2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microtubule Based Active FluidsKinesin Driven Flow ControlTemperature Tuning MethodFlow Speed RegulationActive Fluid PreparationFluorescent Microscopy ImagingTracer Particle TrackingTemperature Control SetupMicrofluidic Device DesignArrhenius Characteristic Analysis

Related Articles