Identifizierung von Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit Hefetoxizität und Suppressor-Screens gezielt werden

Summary

Bakterielle Krankheitserreger sezernieren Proteine in den Wirt, die auf entscheidende biologische Prozesse abzielen. Die Identifizierung der Wirtswege, auf die bakterielle Effektorproteine abzielen, ist der Schlüssel zur Bekämpfung der molekularen Pathogenese. Hier wird eine Methode beschrieben, bei der ein modifizierter Hefesuppressor und ein Toxizitäts-Bildschirm verwendet werden, um Wirtswege aufzuklären, die von toxischen bakteriellen Effektorproteinen angegriffen werden.

Abstract

Intrazelluläre Bakterien sezernieren Virulenzfaktoren, sogenannte Effektorproteine, in das Wirtszytosol, die wirtsproteine und/oder die damit verbundenen biologischen Bahnen zum Nutzen des Bakteriums untergraben. Die Identifizierung von vermeintlichen bakteriellen Effektorproteinen ist aufgrund der Fortschritte bei der Sequenzierung des bakteriellen Genoms und des Aufkommens von Algorithmen, die die Silico-Identifizierung von Genen ermöglichen, die Sekretionskandidaten und/oder eukaryotisch-ähnliche Domänen. Die Identifizierung dieser wichtigen Virulenzfaktoren ist jedoch nur ein erster Schritt. Natürlich ist das Ziel, die molekulare Funktion von Effektorproteinen zu bestimmen und zu klären, wie sie mit dem Wirt interagieren. In den letzten Jahren haben Techniken wie der Hefe-Zwei-Hybrid-Bildschirm und großflächige Immunpräzipitationen in Verbindung mit Massenspektrometrie bei der Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen unterstützt. Obwohl die Identifizierung eines Wirtsbindungspartners der entscheidende erste Schritt zur Aufklärung der molekularen Funktion eines bakteriellen Effektorproteins ist, hat das Wirtsprotein manchmal mehrere biologische Funktionen (z. B. Actin, Clathrin, Tubulin) oder Das bakterielle Protein kann Wirtsproteine nicht physisch binden, was dem Forscher wichtige Informationen über den genauen Wirtsweg, der manipuliert wird, vorenthält. Ein modifizierter Hefetoxizitätssieb in Verbindung mit einem Suppressor-Bildschirm wurde angepasst, um Wirtswege zu identifizieren, die von bakteriellen Effektorproteinen beeinflusst werden. Der Toxizitäts-Bildschirm beruht auf einer toxischen Wirkung in Hefe, die durch das Effektorprotein verursacht wird, das die biologischen Wirtswege stört, was sich oft als Wachstumsfehler manifestiert. Expression einer Hefegenombibliothek wird verwendet, um Wirtsfaktoren zu identifizieren, die die Toxizität des bakteriellen Effektorproteins unterdrücken, und so Proteine in dem Weg zu identifizieren, auf den das Effektorprotein abzielt. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen sowohl für die Toxizitäts- als auch für die Unterdrückerbildschirme. Diese Techniken können in jedem Labor durchgeführt werden, das in der Lage ist, molekulares Klonen und Kultivieren von Hefe und Escherichia coli.

Introduction

Der erste Bericht über Verfahren ähnlich denen, die hier vorgestellt wurden, charakterisierte die Legionella pneumophila Typ IV Effektor SidD, eine DeAMPylase, die Rab1¹ändert. Vergleichbare Techniken wurden für die Charakterisierung mehrerer L. pneumophila Effektoren^1,2,3verwendet. Der Assay wurde angepasst, um ein Coxiella burnetii Typ IV Effektorprotein⁴zu charakterisieren, und vor kurzem wurde der Nutzen dieser Technik für die Charakterisierung von Chlamydia trachomatis Inklusionsmembranpr....

Protocol

1. Herstellung von Medien und Reagenzien

HINWEIS: Die Platten sollten vor dem Tag des Assays vorbereitet werden und sind gut für 1 Monat. Medien und Reagenzien können jederzeit hergestellt werden und sind gut für 1 Monat.

1. 1 L der Glukoselösung (10% w/v) vorbereiten, indem 100 g D-(+)-Glucose in 800 ml destilliertem Wasser in einem 1 000 ml Becher gelöst werden. Stellen Sie die Lautstärke mit destilliertem Wasser auf 1 L ein. Filtern Sie durch einen 0,2 m sterilen Filter in eine sterile 1 L Medienspeicherflasche.
2. 1 L der Galaktoselösung (10% w/v) vorbereiten, indem 100 g D-(+)- Galaktose in 800 ml destilliertem Wasser in ....

Results

Bevor der eigentliche Hefesuppressor-Bildschirm durchgeführt werden kann, muss das Effektorprotein von Interesse auf Toxizität in Hefe getestet werden. Dies wird erreicht, indem das Protein von Interesse an Hefe unter der Kontrolle eines Galactose-induzierbaren Promotors zum Ausdruck gebracht wird. Das Wachstum der Glukose (nicht induzierende Bedingungen) sollte zunächst verglichen werden, um sicherzustellen, dass die Toxizität speziell auf die Expression des Proteins von Interesse zurückzuführen ist und kein allgemeiner.......

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt schritt-für-Schritt-Verfahren zur Identifizierung von biologischen Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit einer modifizierten Hefetoxizität und einem Suppressor-Bildschirm ins Visier genommen werden. Der verwendete Hefestamm, S. cerevisiae W303, ist auxotroph für Uracil und Leucin. Uracil-Auxotrophie des Stammes wird verwendet, um Hefe auszuwählen, die das Protein von Interesse auf dem pYesNTA-Kan Vektor trägt, während Leucin-Auxotrophie verwendet wird, um für den Hef.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP2641500
Galaktose	MilliporeSigma	G0750-1KG
GeneJet Gel Extraktionskit	ThermoFisher Scientific	K0691
GeneJet PCR Aufreinigungskit	ThermoFisher Scientific	K0701
GeneJet Plasmid Miniprep Kit	Thermo	K0503
Glukose	MilliporeSigma	G8270-1KG
Hering Sperma DNA	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
Lithiumacetat-Dihydrat	MilliporeSigma	L6883-250G
Pepton	Fisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs	M0530
Poly(ethylenglykol) 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 DNA-Ligase	New England Biolabs	M0202S
Tryptophan	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
Hefeextrakt	Fisher Scientific	BP1422-500
Hefe Miniprep Kit	Zymo	D2001
Hefe Stickstoffbasis ohne Aminosäuren	MilliporeSigma	Y0626-250G
Hefe Synthetisches Drop-out Medium Supplements	MilliporeSigma	Y1501-20G	ohne Uracil
Hefe Synthetisches Drop-out Medium Supplements	MilliporeSigma	Y1771-20G	ohne Uracil, Leucin, Tryptophan