Method Article

Identifizierung von Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit Hefetoxizität und Suppressor-Screens gezielt werden

DOI:

10.3791/60488

⸱

October 25th, 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterielle Krankheitserreger sezernieren Proteine in den Wirt, die auf entscheidende biologische Prozesse abzielen. Die Identifizierung der Wirtswege, auf die bakterielle Effektorproteine abzielen, ist der Schlüssel zur Bekämpfung der molekularen Pathogenese. Hier wird eine Methode beschrieben, bei der ein modifizierter Hefesuppressor und ein Toxizitäts-Bildschirm verwendet werden, um Wirtswege aufzuklären, die von toxischen bakteriellen Effektorproteinen angegriffen werden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intrazelluläre Bakterien sezernieren Virulenzfaktoren, sogenannte Effektorproteine, in das Wirtszytosol, die wirtsproteine und/oder die damit verbundenen biologischen Bahnen zum Nutzen des Bakteriums untergraben. Die Identifizierung von vermeintlichen bakteriellen Effektorproteinen ist aufgrund der Fortschritte bei der Sequenzierung des bakteriellen Genoms und des Aufkommens von Algorithmen, die die Silico-Identifizierung von Genen ermöglichen, die Sekretionskandidaten und/oder eukaryotisch-ähnliche Domänen. Die Identifizierung dieser wichtigen Virulenzfaktoren ist jedoch nur ein erster Schritt. Natürlich ist das Ziel, die molekulare Funktion von Effektorproteinen zu bestimmen und zu klären, wie sie mit dem Wirt interagieren. In den letzten Jahren haben Techniken wie der Hefe-Zwei-Hybrid-Bildschirm und großflächige Immunpräzipitationen in Verbindung mit Massenspektrometrie bei der Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen unterstützt. Obwohl die Identifizierung eines Wirtsbindungspartners der entscheidende erste Schritt zur Aufklärung der molekularen Funktion eines bakteriellen Effektorproteins ist, hat das Wirtsprotein manchmal mehrere biologische Funktionen (z. B. Actin, Clathrin, Tubulin) oder Das bakterielle Protein kann Wirtsproteine nicht physisch binden, was dem Forscher wichtige Informationen über den genauen Wirtsweg, der manipuliert wird, vorenthält. Ein modifizierter Hefetoxizitätssieb in Verbindung mit einem Suppressor-Bildschirm wurde angepasst, um Wirtswege zu identifizieren, die von bakteriellen Effektorproteinen beeinflusst werden. Der Toxizitäts-Bildschirm beruht auf einer toxischen Wirkung in Hefe, die durch das Effektorprotein verursacht wird, das die biologischen Wirtswege stört, was sich oft als Wachstumsfehler manifestiert. Expression einer Hefegenombibliothek wird verwendet, um Wirtsfaktoren zu identifizieren, die die Toxizität des bakteriellen Effektorproteins unterdrücken, und so Proteine in dem Weg zu identifizieren, auf den das Effektorprotein abzielt. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen sowohl für die Toxizitäts- als auch für die Unterdrückerbildschirme. Diese Techniken können in jedem Labor durchgeführt werden, das in der Lage ist, molekulares Klonen und Kultivieren von Hefe und Escherichia coli.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der erste Bericht über Verfahren ähnlich denen, die hier vorgestellt wurden, charakterisierte die Legionella pneumophila Typ IV Effektor SidD, eine DeAMPylase, die Rab11ändert. Vergleichbare Techniken wurden für die Charakterisierung mehrerer L. pneumophila Effektoren1,2,3verwendet. Der Assay wurde angepasst, um ein Coxiella burnetii Typ IV Effektorprotein4zu charakterisieren, und vor kurzem wurde der Nutzen dieser Technik für die Charakterisierung von Chlamydia trachomatis Inklusionsmembranproteinen erweitert5 .

Dieses Protokoll kann in zwei Hauptteile unterteilt werden: 1) der Hefetoxizitätssieb, in dem das bakterielle Effektorprotein von Interesse in Hefe exprimiert wird und Klone auf einen toxischen Phänotyp untersucht werden, wie ein Wachstumsdefekt belegt ist, und 2) der Hefesuppressor-Bildschirm , bei dem der toxische Phänotyp durch Expression einer Hefe-Genombibliothek im toxischen Stamm unterdrückt wird. So ist der Toxizitätsbildschirm ein Bildschirm für toxische Phänotypen, die sich als Wachstumsdefekte manifestieren, wenn der bakterielle Effektor von Interesse überexprimiert wird. Toxische Klone, die erfolgreich mit dem bakteriellen Effektor transformiert und exemittiert werden, werden ausgewählt und für den nächsten Schritt gespeichert. Der zweite große Schritt besteht darin, eine teilweise verdaute Hefe-Genombibliothek im toxischen Hefeklon zu exexzessither zu exexzessiert. Plasmide, die die hefegenomische Bibliothek ausmachen, die für die Verwendung in diesem Protokoll vorgeschlagen wird, tragen 5-20 kb Einsätze, die in der Regel 3-13 Hefe-Open-Leserahmen (ORF) mit einer durchschnittlichen Gengröße von 1,5 kb über alle Plasmide entsprechen, die das gesamte abgedeckte Hefegenom darstellen. ca. 10x. Dieser Teil des Assays wird als Suppressor-Bildschirm bezeichnet, da das Ziel darin besteht, die Toxizität des bakteriellen Effektorproteins zu unterdrücken. Potenzielle Suppressorplasmide werden aus Hefe isoliert, sequenziert und die unterdrückenden ORFs identifiziert. Die dem Suppressor-Bildschirm zugrunde liegende Begründung ist, dass das Effektorprotein Komponenten des Wirtswegs bindet, mit ihm verbindet und/oder überwältigt, und dass die Bereitstellung dieser Wirtsproteine im Überschuss die toxische Wirkung auf den Pfad retten und somit, Wachstumsfehler. So stellen identifizierte ORFs, die Toxizität unterdrücken, oft mehrere Teilnehmer eines Wirtswegs dar. Orthogonale Experimente werden dann durchgeführt, um zu überprüfen, ob der bakterielle Effektor tatsächlich mit dem implizierten Weg interagiert. Dies ist insbesondere dann notwendig, wenn ein Bindungspartner wie Clathrin oder Actin identifiziert wurde, da diese Proteine an einer Vielzahl von Wirtsprozessen beteiligt sind. Weitere Experimente können dann die physiologische Funktion des Effektorproteins während der Infektion aufklären. Die Toxizitäts- und Unterdrückersiebe sind auch leistungsfähige Werkzeuge zur Entschlüsselung der physiologischen Funktion von bakteriellen Effektorproteinen, die Wirtsproteine nicht physisch mit Affinitäten binden, die ausreichen, um durch Immunpräzipitation zu erkennen, oder die mit dem in enzymatischen Hit-and-Run-Interaktionen, die möglicherweise nicht von einem Hefe-zwei-Hybrid-Bildschirm erkannt werden.

Obwohl der Suppressor-Bildschirm eine leistungsfähige Methode sein kann, um potenzielle physiologische Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Effektorproteinen und Wirtswegen aufzudecken, muss das bakterielle Effektorprotein einen Wachstumsfehler in Hefe induzieren, andernfalls Suppressor-Bildschirm wird wenig nutzen. Darüber hinaus muss der toxische Phänotyp zu mindestens einem Wachstumsdefizit von 2 bis 3 Log10 führen, oder es wird schwierig sein, Unterdrücker zu identifizieren. Wenn ein Labor für die Zellkultur eingerichtet ist, kann das Screening von Effektorproteinen auf Toxizität in gängigen Zelllinien wie HeLa oft einen Einblick geben, ob es sich lohnt, mit dem Hefetoxizitätsbildschirm fortzufahren. Die ektopische Expression des Effektorproteins in HeLa-Zellen führt manchmal zu toxizitätsbegierig, die sehr stark mit der Toxizität des Hefestamms korreliert, der für diese Bildschirme verwendet wird4. Beobachtbare Merkmale der Belastung in HeLa-Zellen sind der Verlust von Stressfasern, die Zellablösung von der Platte und die kerntechnische Kondensation, die auf Apoptose hindeutet. Jede visuelle Indikation von Stress in HeLa-Zellen macht das Protein von Interesse zu einem guten Kandidaten für die Induktion eines Wachstumsfehlers in Hefe, die sich viel schneller replizieren und somit besser auf Störungen wesentlicher Wege reagieren.

Es sollte beachtet werden, dass der Suppressor-Bildschirm nicht immer Host-Bindungspartner als Unterdrücker identifiziert, aber es kann immer noch kritische Komponenten des(n) Ziels des Wirtswegs mit einimplizieren, was zu einer ganzheitlichen Sicht auf die biologischen Prozesse führt, die von der bakterielles Effektorprotein. Oberflächlich betrachtet scheint dies kontraintuitiv, da die Bereitstellung des Bindungspartners des Effektorproteins im Überschuss den Wachstumsdefekt zu retten erwarten wäre. Bei den Bemühungen, die vom C. trachomatis Effector Protein CT229 (CpoS), das während derInfektionan mindestens 10 verschiedene Rab GTPases bindet, zu identifizieren, unterdrückte keiner der Rab-Bindenden die Toxizität von CT229. Es wurden jedoch zahlreiche Unterdrücker identifiziert, die am Handel mit Klathrin-beschichteten Vesikel (CCV) beteiligt waren, was zu weiteren Arbeiten führte, die belegen, dass CT229 den Von Rab abhängigen CCV-Handel gezielt untergräbt. In ähnlicher Weise wurden bei der Untersuchung des C. burnetii Effektorproteins Cbu0041 (CirA) mehrere Rho GTPases identifiziert, die den Hefewachstumsdefekt retteten, und es wurde später festgestellt, dass CirA als GTPase-aktivierendes Protein (GAP) für RhoA4fungiert.

Die Nützlichkeit des Hefesuppressor-Bildschirms zur Aufklärung von Wirtswegen, die von bakteriellen Effektorproteinen ins Visier genommen werden, kann nicht überbewertet werden, und andere Forscher, die versuchen, intrazelluläre bakterielle Effektorproteine zu charakterisieren, können diese Techniken. Diese Assays sind von Wert, wenn Immunpräzipitiermitteln und/oder Hefe-zwei Hybrid-Screens keinen Bindungspartner gefunden haben und klären können, welche Wege durch das bakterielle Effektorprotein ins Visier genommen werden. Hier werden detaillierte Protokolle für die Toxizitäts- und Unterdrücker-Screens zur Identifizierung von wirtlichen biologischen Pfaden bereitgestellt, die von intrazellulären bakteriellen Effektorproteinen ins Visier genommen werden, sowie einige der häufigsten Hindernisse, die bei der Verwendung dieser Assays und ihrer entsprechenden Lösungen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Herstellung von Medien und Reagenzien

HINWEIS: Die Platten sollten vor dem Tag des Assays vorbereitet werden und sind gut für 1 Monat. Medien und Reagenzien können jederzeit hergestellt werden und sind gut für 1 Monat.

  1. 1 L der Glukoselösung (10% w/v) vorbereiten, indem 100 g D-(+)-Glucose in 800 ml destilliertem Wasser in einem 1 000 ml Becher gelöst werden. Stellen Sie die Lautstärke mit destilliertem Wasser auf 1 L ein. Filtern Sie durch einen 0,2 m sterilen Filter in eine sterile 1 L Medienspeicherflasche.
  2. 1 L der Galaktoselösung (10% w/v) vorbereiten, indem 100 g D-(+)- Galaktose in 800 ml destilliertem Wasser in einem 1 L Becher gelöst werden. Stellen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 1 ml ein und filtern Sie es durch einen 0,2 m sterilen Filter in eine sterile 1.000 ml Medienspeicherflasche.
  3. Bereiten Sie 1 L Hefeextrakt Peptondextrose (YPD) Agar durch Auflösen von 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 20 g Glukose und 20 g Agar in 1.000 ml destilliertem Wasser vor. Autoklav für 20 min und abkühlen in 56 °C Wasserbad bis zum Abkühlen. Gießen Sie in 100 mm Platten mit 20 ml Medien pro Platte.
  4. Bereiten Sie 1 L YPD-Brühe vor, indem Sie 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton und 20 g Glukose in 1.000 ml destilliertem Wasser auflösen. Autoklav für 20 min.
  5. Bereiten Sie den synthetischen Aussetzer (SD) Uracil (Ura-) Glucose-Agar vor. Für 1 L 6,7 g Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 1,9 g Aussetzerzusatz ohne Uracil und 15 g Agar in 800 ml destilliertem Wasser auflösen. Autoklav für 20 min und abkühlen in einem 56 °C Wasserbad, bis die Temperatur 50 bis 60 °C beträgt. Mit einer 50 ml serologischen Pipette oder einem sterilen abgestuften Zylinder 200 ml der in Schritt 1.1 zubereiteten Glukoselösung hinzufügen. Gut mischen, indem Sie sanft wirbeln oder auf Rührplatte platzieren. Gießen Sie in 100 mm Platten mit 20 ml Medien pro Platte.
  6. Bereiten Sie den synthetischen Aussetzer (SD) uracil (Ura-) galactose agar vor. Für 1 L 6,7 g Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 1,9 g Aussetzerzusatz ohne Uracil und 15 g Agar in 800 ml destilliertem Wasser auflösen. Autoklav für 20 min und abkühlen in einem 56 °C Wasserbad, bis die Temperatur 50 bis 60 °C beträgt. Mit einer 50 ml serologischen Pipette oder einem sterilen abgestuften Zylinder 200 ml der in Schritt 1.2 vorbereiteten Galaktoselösung hinzufügen. Gut mischen, indem Sie sanft wirbeln oder auf die Rührplatte legen. Gießen Sie in 100 mm Platten mit 20 ml Medien pro Platte.
  7. Bereiten Sie den synthetischen Aussetzer (SD) Uracil (Ura-) Glukosebrühe vor. Für 1 L 6,7 g Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren und 1,9 g Aussetzerzusatz ohne Uracil in 800 ml destilliertem Wasser auflösen. Autoklav für 20 min und abkühlen in einem 56 °C Wasserbad, bis die Temperatur 50 bis 60 °C beträgt. Mit einer 50 ml serologischen Pipette oder einem sterilen abgestuften Zylinder 200 ml der in Schritt 1.1 zubereiteten Glukoselösung hinzufügen.
  8. Bereiten Sie den synthetischen Aussetzer (SD) uracil (Ura-) Leucin (Leu-) Glucose-Agar vor. Für 1 L 6,7 g der Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren auflösen; 1,9 g Aussteigerzulage ohne Uracil, Leucin und Tryptophan; 15 g Agar; und 0,076 g Tryptophan in 800 ml destilliertem Wasser. Autoklav für 20 min und abkühlen in einem 56 °C Wasserbad, bis die Temperatur 50 bis 60 °C beträgt. Mit einer 50 ml serologischen Pipette oder einem sterilen abgestuften Zylinder 200 ml der in Schritt 1.1 zubereiteten Glukoselösung hinzufügen. Gießen Sie in 100 mm Platten mit 20 ml Medien pro Platte.
  9. Bereiten Synthetische sD (SD) uracil (Ura-) Leucin (Leu-) Galactose Agar. Für 1 L 6,7 g Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren auflösen; 1,9 g Aussteigerzulage ohne Uracil, Leucin und Tryptophan; 15 g Agar; und 0,076 g Tryptophan in 800 ml destilliertem Wasser. Autoklav für 20 min und abkühlen in einem 56 °C Wasserbad, bis die Temperatur 50 bis 60 °C beträgt. Mit einer 50 ml serologischen Pipette oder einem sterilen abgestuften Zylinder 200 ml der in Schritt 1.2 vorbereiteten Galaktoselösung hinzufügen. Gut mischen, indem Sie sanft wirbeln oder auf eine Rührplatte legen. Gießen Sie in 100 mm Platten mit 20 ml Medien pro Platte.
  10. Bereiten Synthetische sD (SD) Uracil (Ura-) Leucin (Leu-) Glukosebrühe vor. Für 1 L 6,7 g Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren auflösen; 1,9 g Aussteigerzulage ohne Uracil, Leucin, Tryptophan; und 0,076 g Tryptophan in 800 ml destilliertem Wasser. Autoklav für 20 min und abkühlen in einem 56 x 60 °C Wasserbad, bis die Temperatur 50 °C beträgt. Mit einer 50 ml serologischen Pipette oder einem sterilen abgestuften Zylinder 200 ml der in Schritt 1.1 zubereiteten Glukoselösung hinzufügen.
  11. Herstellung der Polyethylenglykollösung (PEG). 50% w/v Polyethylenglykol 3350 in destilliertem Wasser hinzufügen. Sterilisieren durch Autoklavieren.
  12. 1 M Lithiumacetat (LiAc) vorbereiten, indem 10,2 g Lithiumacetat dehydriert in 200 ml destilliertem Wasser gelöst werden. Sterilisieren durch Autoklavieren.
  13. Bereiten Sie Hering Sperma DNA vor. 10 mg/ml HeringSperma-DNA mit destilliertem Wasser auf 2 mg/ml verdünnen. Bei 100 °C 5 min erhitzen und sofort 5 min auf Eis legen.

2. Klonen des Gens von Interesse in das Hefetoxizitätsplasmid pYesNTA-Kan

HINWEIS: Derzeit gibt es eine Vielzahl von Hefe Toxizität Vektoren sowohl kommerziell als auch akademisch verfügbar. Der Hefe-Suppressor-Bildschirm kann in Verbindung mit vielen dieser Vektoren verwendet werden, sofern das Plasmid, das das Effektorprotein von Interesse ausdrückt, eine andere Aussetzerauswahl als Uracil und einen anderen Antibiotikum-Marker als BlaRverwendet. Diese Arbeit verwendet einen modifizierten pYesNTA Vektor4,5, der eine Kanamycin-Widerstand-Kassette für eine einfachere Abschirmung für potenzielle Unterdrücker enthält. Das Klonschema muss es ermöglichen, dass das Effektorprotein mit dem Gal-Promoter und His-Tag im Rahmen sein kann. Das Chlamydia trachomatis Inklusionsmembranprotein CT229 wurde als Prinzipiellbeweis für diese Assays verwendet.

  1. Verwenden Sie PCR, um CT229 aus C. trachomatis genomischer DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers mit CT229 +1 Kpn F (CCGGTACCAATGAGCTGTTCTAATGTTAATTCAGGT) und CT229 XhoI R (CCCTCTCTTTTTTTTACGACGGGATGCC) Primer zu verstärken. Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen: (1) 98 °C für 30 s; (2) 98 °C für 10 s, 55 °C für 30 s, 72 °C für 2 min; (3) Schritt 2 für insgesamt 25x wiederholen; (4) 72 °C für 10 min; und (5) 4 °C halten.
  2. Analysieren Sie 5 l des PCR-Produkts auf einem 1% Agarose-Gel (Abbildung 1).
  3. Reinigen Sie die restlichen 45 L DNA mit einem PCR-Reinigungskit nach den Anweisungen des Herstellers.
  4. Verdauen Sie die 50 l gereinigten PCR-Einsatz und pYesNTA-Kan (Abbildung 2) für 1 h bei 37 °C in einem Wasserbad mit KpnI-HF und XhoI-HF.
    ANMERKUNG: Verdauen Sie für pYesNTA-Kan 5 g Plasmid mit 5 l KpnI-HF, 5 l XhoI-HF und 6 l Puffer in einem Gesamtvolumen von 60 l. Verdauen Sie für den Einsatz die gesamten 50 L des gereinigten PCR-Produkts mit 2 L KpnI-HF, 2 l XhoI-HF und 6 l Puffer.
  5. Führen Sie den gesamten Plasmid-Digest auf einem 1% Agarose-Gel aus. Führen Sie die Reinigung des verdauten Plasmids mit einem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  6. Reinigen Sie den verdauten PCR-Einsatz mit einem PCR-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  7. Klonen Sie den Einsatz in pYesNTA-Kan mit 2 l pYesNTA-Kan (Schritt 2,5), 2 l DNA-Ligasepuffer, 1 l T4-Ligase und 15 l Einsatz (Schritt 2,6). Bei Raumtemperatur 1 h inkubieren.
  8. Fügen Sie die gesamte Klonreaktion zu 50 l E. coli-fähigen Zellen hinzu und führen Sie die Transformationsreaktion durch.
  9. Die gesamte Transformationsreaktion auf einer LB-Platte, die 100 g/ml Carbenicillin enthält, verplatten.
  10. Impfen Sie 10 ml der LB mit 100 g/ml Carbenicillin mit drei einzelindividuellen Kolonien. Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 150 Umdrehungen von 150 Umdrehungen/min inkubieren.
  11. Isolieren Sie das Plasmid mit einem Plasmid-Miniprep-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  12. Sequenzieren Sie die isolierten Plasmide mit genspezifischen Primern (Schritt 2.1).

3. Testen Sie das Protein von Interesse auf Toxizität in Hefe

  1. Streak Saccharomyces cerevisiae W303 auf YPD agar (Schritt 1.3), um isolierte Kolonien zu erhalten. Bei 30 °C für 24 h inkubieren.
  2. Impfen Sie 10 ml YPD-Brühe (Schritt 1.4) mit einer einzigen Kolonie aus der Agarplatte (Schritt 3.1). Bei 30 °C mit Schütteln bei 150 Umdrehungen von 150 Rpm über Nacht inkubieren.
  3. 0,5 ml der Nachtkultur auf 10 ml YPD-Brühe (Schritt 1.4) geben und bei 30 °C mit Schütteln bei 150 U/min für 4 h brüten.
    1. Pellet die 10 ml Kultur bei 3.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    2. Das Pellet in 1 ml sterilem Wasser wieder aufhängen, in das Mikrozentrifugenrohr geben und bei Raumtemperatur 1 min bei 3.000 x g pellet.
    3. Das Pellet in 1 ml mit 1 ml Lithiumacetat (LiAc) und Pellet bei 3.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur wieder aufsetzen.
    4. Wiederholen Sie die LiAc-Waschanlage 2x.
    5. Entfernen Sie die Wäsche. Das Pellet in 2,4 ml von 50% PEG 3350 wieder aufsetzen. Fügen Sie 360 l 1M LiAc, 500 l mit 2 mg/ml Hering-Sperma-DNA und 400 l steriles Wasser hinzu.
      HINWEIS: Dies ist ausreichend für 20 Transformationen.
    6. Fügen Sie 180 l des Transformationsmixes aus Schritt 3.3.5 zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzu, das 5 l pYesNTA-Kan CT229 Plasmid-DNA (100-500 ng) aus Schritt 2.12 enthält.
    7. Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 30 °C für 30 min.
    8. Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 42 °C für 30 min.
    9. Pellet bei 3.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur.
    10. Entfernen Sie die Transformationsmischung mit der Pipette. Setzen Sie das Pellet in 100 l sterilem Wasser wieder auf. Platte die Umwandlung auf SD Ura- Agar mit Glukose (Schritt 1.5).
    11. Platten bei 30 °C für 48 h inkubieren.
  4. 5 ml SD Ura- Glucosehaltige Brühe (Schritt 1.7) mit einer einzigen Kolonie von der Platte impfen. Über Nacht bei 30 °C mit Schütteln bei 150 Umdrehungen von 150 Umdrehungen/min inkubieren. Beziehen Sie Hefe, die mit dem Vektor allein als Negativsteuerelement transformiert wurde, ein.
    1. Fügen Sie 180 l steriles Wasser in 5 Brunnen einer 96-Wellplatte (A2-A6) hinzu.
    2. Wirbel die Nachtkultur zu mischen.
    3. Fügen Sie dem ersten Brunnen (A1) 180 L Hefe hinzu. Seriell 1:10 verdünnen (insgesamt sechs Proben einschließlich unverdünnt).
    4. Mit einer Mehrkanalpipette, Punkt 5 l jeder Verdünnung auf SD Ura- Glukose (Schritt 1.5) und Ura- Galaktose (Schritt 1.6) Agarplatten. Bei 30 °C für 48 h inkubieren.
  5. Bewerten Sie die Toxizität, indem Sie das Wachstum der Hefe, die das Effektorprotein von Interesse ausdrückt, das auf den Galaktose-haltigen Medien angebaut wird, mit dem Wachstum von Hefe vergleichen, die den Vektor allein ausdrückt.
  6. Bestätigen Sie die Expression des His-Tag-Fusionsproteins durch Western Blotting.

4. Transformieren Sie giftige Hefe mit der Hefe-Genombibliothek

  1. 100 ml SD Ura- Glukosebrühe (Schritt 1,7) mit 1 ml des Bestands ab Schritt 3.4 impfen. Für 16 bis 24 h bei 30 °C mit Schütteln bei 150 R/min inkubieren. Platz 900 ml SD Ura- Glukosebrühe bei 30 °C über Nacht, um die Medien vorzuwärmen.
  2. Fügen Sie die gesamten 100 ml der Übernachtungskultur zum vorgewärmten 1 L-Kolben hinzu. Bei 30 °C bei 150 R/min für 4 x 5 h inkubieren.
    1. Pellet die Kultur bei 6.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    2. Entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 250 ml sterilem Wasser wieder aufhängen. Pellet die Kultur bei 6.000 x g für 5 min bei 4 °C.
    3. Entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 250 ml von 1 mM LiAc wieder aufhängen. Pellet die Kultur bei 6.000 x g für 5 min bei 4 °C.
    4. Entfernen Sie LiAc und setzen Sie das Pellet in 9,6 ml von 50% PEG 3350 wieder aus. Fügen Sie 1,44 ml 1M LiAc, 2 ml 2 mg/ml Hering-Sperma-DNA, 50 g der genomischen Bibliothek pYep13 hinzu (ATCC 37323). Stellen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf 15 ml ein. Mischen Sie sanft durch Inversion.
    5. Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 30 °C für 30 min.
    6. Fügen Sie 750 l Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzu, um die Transformationseffizienz zu verbessern. In einem Wasserbad bei 42 °C für 30 min. Alle 10 min durch sanfte Umkehrung mischen.
    7. Pellet die Hefe bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    8. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 10 ml sterilem Wasser wieder auf. Pellet bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    9. Das Pellet in 8 ml sterilem Wasser wieder aufhängen.
    10. Um die Umwandlungseffizienz zu bestimmen, verdünnen Sie 1:10 und Platte 100 l jeder Verdünnung auf SD Ura- Leu- Glukose-Agar (Schritt 1.8).
    11. Platte 200 l der Probe auf SD Ura- Leu- Galactose Agar (Schritt 1.9) Platten. Verwenden Sie insgesamt 50 Platten.
    12. Bei 30 °C für 48 x 96 h oder bis Kolonien auftreten.
      HINWEIS: Kolonien erscheinen in der Regel auf Glukose-Agar-Platten bei 48-72 h und Galaktose-Agar-Platten bei 72-96 h.
  3. Patch Kolonien (potenzielle Rettungen) auf SD Ura- Leu- galactose agar (Schritt 1.9) zu erweitern und Lager zu machen. Bei 30 °C für 24 bis 48 H inkubieren.
  4. 5 ml SD Ura- Leu- Glukosebrühe (Schritt 1.10) mit dem Teil des Pflasters impfen. Über Nacht bei 26 °C mit Schütteln bei 150 Umdrehungen von 150 Umdrehungen/min inkubieren.
    1. Fügen Sie 180 l des sterilen Wassers in 5 Brunnen einer 96-Wellplatte (A2-A6) hinzu.
    2. Wirbel die Nachtkultur zu mischen.
    3. Fügen Sie dem ersten Brunnen (A1) 180 L Hefe hinzu. Seriell 1:10 verdünnen (insgesamt sechs Proben einschließlich unverdünnt).
    4. Mit einer Mehrkanalpipette, Punkt 5 l jeder Verdünnung auf SD Ura- Glukose und SD Ura- Galactose AgarPlatten. Fügen Sie toxischeEffektor allein als Kontrolle.
    5. Bei 30 °C für 48 h inkubieren.
  5. Vergleichen Sie das Wachstum der Hefe, die den toxischen Effektor allein exzessiiert, mit Hefe, die die potentiellen Unterdrücker enthält. Gehen Sie nur mit potenziellen Unterdrückern vor, die die Toxizität im Vergleich zur Hefe, die den Effektor ausdrückt, verringert haben.

5. Identifizieren und bestätigen Sie Unterdrücker

  1. 5 ml SD Ura- Leu- Glukosebrühe (Schritt 1,10) mit 100 l Hefe ab Schritt 4.4 impfen und bei 30 °C mit Schütteln bei 150 U/min über Nacht inkubieren.
    1. Pellet die Hefe bei 3.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.
    2. Isolieren Sie das Plasmid mit einem Hefeplasmid Miniprep-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  2. Verwandeln Sie das isolierte Plasmid in die E. coli-kompetenten Zellen und verzappen Sie die gesamte Transformation auf LB-Agar mit 100 g/ml Carbenicillin. Bei 37 °C für 24 h inkubieren.
  3. 10 ml LB-Brühe mit 100 g/ml Carbenicillin impfen, mit drei Kolonien von der Platte aus und bei 37 °C über Nacht mit Schütteln bei 150 U/min bebrüten.
    1. Pelletkulturen bei 3.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Isolieren Sie Plasmid mit einem Miniprep-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  4. Retransformieren Sie die toxische Hefe mit den isolierten Plasmiden aus Schritt 5.3.1 nach den Schritten in Teil 3 des Protokolls.
    1. Ungeimpfen 5 ml SD Ura- Leu- Glukosebrühe mit einer Kolonie aus der Transformationsplatte. Über Nacht bei 30 °C mit Schütteln bei 150 Umdrehungen von 150 Umdrehungen/min inkubieren.
    2. Spot on Ura- Leu- Glukose und Galaktose-Agar zur Bestätigung der Unterdrückung der Toxizität.
  5. Sequenz mit pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) und pYep13 R (TGATGCGCGCCACGATGC) Primer zur Identifizierung von Hefe-ORFs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bevor der eigentliche Hefesuppressor-Bildschirm durchgeführt werden kann, muss das Effektorprotein von Interesse auf Toxizität in Hefe getestet werden. Dies wird erreicht, indem das Protein von Interesse an Hefe unter der Kontrolle eines Galactose-induzierbaren Promotors zum Ausdruck gebracht wird. Das Wachstum der Glukose (nicht induzierende Bedingungen) sollte zunächst verglichen werden, um sicherzustellen, dass die Toxizität speziell auf die Expression des Proteins von Interesse zurückzuführen ist und kein allgemeiner...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt schritt-für-Schritt-Verfahren zur Identifizierung von biologischen Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit einer modifizierten Hefetoxizität und einem Suppressor-Bildschirm ins Visier genommen werden. Der verwendete Hefestamm, S. cerevisiae W303, ist auxotroph für Uracil und Leucin. Uracil-Auxotrophie des Stammes wird verwendet, um Hefe auszuwählen, die das Protein von Interesse auf dem pYesNTA-Kan Vektor trägt, während Leucin-Auxotrophie verwendet wird, um für den Hef...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Shelby Andersen, Abby McCullough und Laurel Woods für ihre Unterstützung bei diesen Techniken. Diese Studie wurde durch Start-up-Fonds der University of Iowa Department of Microbiology and Immunology an Mary M. Weber finanziert.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarFisher ScientificBP2641500
GalaktoseMilliporeSigmaG0750-1KG
GeneJet Gel ExtraktionskitThermoFisher ScientificK0691
GeneJet PCR AufreinigungskitThermoFisher ScientificK0701
GeneJet Plasmid Miniprep KitThermoK0503
GlukoseMilliporeSigmaG8270-1KG
Hering Sperma DNAPromegaD1811
KpnI-HFNew England BiolabsR3142S
Lithiumacetat-DihydratMilliporeSigmaL6883-250G
PeptonFisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA-PolymeraseNew England BiolabsM0530
Poly(ethylenglykol) 3350MilliporeSigma1546547-1G
pYep13ATCC37323
T4 DNA-LigaseNew England BiolabsM0202S
TryptophanMilliporeSigma470031-1G
XhoI-HFNew England BiolabsR0146S
HefeextraktFisher ScientificBP1422-500
Hefe Miniprep KitZymoD2001
Hefe Stickstoffbasis ohne AminosäurenMilliporeSigmaY0626-250G
Hefe Synthetisches Drop-out Medium SupplementsMilliporeSigmaY1501-20Gohne Uracil
Hefe Synthetisches Drop-out Medium SupplementsMilliporeSigmaY1771-20Gohne Uracil, Leucin, Tryptophan

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119(1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070(1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21(2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989(2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Yeast Toxicity ScreenSuppressor ScreenBacterial Effector ProteinsHost Pathway IdentificationChlamydia trachomatisYeast Genomic LibraryPlasmid TransformationGrowth Defect AssaySerial DilutionDouble Drop out Agar

Related Articles