Hier wird ein Protokoll zur Ganzmontage-IN-situ-RNA-Hybridisierungsanalyse in Zebrafischen und Rohrbildungs-Assay in patientenabgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Endothelzellen vorgestellt, um die Rolle von Endoglin bei der Gefäßbildung zu untersuchen.
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Methodenartikel
Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Vaskuläre Entwicklung wird durch die sequentielle Expression spezifischer Gene bestimmt, die durch In-situ-Hybridisierungstests bei Zebrafischen in verschiedenen Entwicklungsstadien untersucht werden können. Um die Rolle von Endoglin(eng) bei der Gefäßbildung während der Entwicklung einer erblichen hämorrhagischen Telangangiektasien (HHT) zu untersuchen, werden Morpholino-vermittelte gezielte Knockdown von eng in Zebrafischen verwendet, um seine zeitliche Expression und die damit verbundenen Funktionen zu untersuchen. Hier wird die Voll-In-situ-RNA-Hybridisierung (WISH) für die Analyse von eng und seinen nachgelagerten Genen in Zebrafischembryonen eingesetzt. Außerdem werden Rohrbildungstests in HHT-Patienten-abgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzell-differenzierten Endothelzellen eng (iPSC-ECs; mit eng-Mutationen) durchgeführt. Ein spezifisches Signalverstärkungssystem mit der gesamten In-Situ-Hybridisierung – WISH bietet eine höhere Auflösung und niedrigere Hintergrundergebnisse im Vergleich zu herkömmlichen Methoden. Um ein besseres Signal zu erhalten, wird die Nachfixierungszeit nach der Sondenhybridisierung auf 30 min eingestellt. Da Fluoreszenzfärbung bei Zebrafischembryonen nicht empfindlich ist, wird sie hier durch Diaminobelidin (DAB) ersetzt. In diesem Protokoll werden von HHT-Patienten abgeleitete iPSC-Linien, die eine eng-Mutation enthalten, in Endothelzellen differenziert. Nach der Beschichtung einer Platte mit Kellermembranmatrix für 30 min bei 37 °C werden iPSC-ECs als Monolayer in Brunnen ausgesät und 3 h bei 37 °C gehalten. Anschließend werden die Rohrlänge und die Anzahl der Zweige anhand mikroskopischer Bilder berechnet. So wird mit diesem verbesserten WISH-Protokoll gezeigt, dass eine reduzierte Eng-Expression die Endothel-Vorläuferbildung bei Zebrafischembryonen beeinflusst. Dies wird durch Rohrbildungstests mit iPSC-ECs bestätigt, die von einem Patienten mit HHT abgeleitet wurden. Diese Assays bestätigen die Rolle für eng in der frühen Gefäßentwicklung.
Einleitung
Eine einzige Mutation auf eng (CD105) wurde bei Patienten mit HHT berichtet. Die Mutation führt zu einer erhöhten PROLIFERATION der EG und einer reduzierten durchflussvermittelten EG-Dehnung1,2. Es wurde auch bereits berichtet, dass ENG-Mangel reduziert endotheliale Marker Expression (d.h. kdrl, cdh5, hey2) in Zebrafisch3. Endoglin, das hauptsächlich in Endothelzellen exprimiert wird, ist ein Transmembran-Glykoprotein und fungiert als Co-Rezeptor zur Transformation des Wachstumsfaktors (TGF-) Familienmitglieder. Es weist die BMP9-Bindung auf ....
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Protokoll
Alle beschriebenen Tierversuche wurden von der Forschungsethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Zhejiang genehmigt.
1. Ganzmontierte In-situ-Hybridisierung
- Zebrafisch Linie Haltung und Fortpflanzung
- Füttern und züchten Sie alle erwachsenen Zebrafische bei 26-28 °C in einem rezirkulierenden Aquakultursystem mit 14 h Licht/10 h dunklem Zyklus für jeden Tag. Verwenden Sie AB (Wild-Typ) Zebrafischlinien für die folgenden Verfahren.
- Legen Sie eine Schicht Kieselsteine in den Boden der Zuchtbox als Unterschlupf für Eier. Gruppieren Sie elternfische im Verhältnis 2:1 (d.h. zwei Weibchen und ein Männ....
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Ergebnisse
Die gesamte Mount-in-situ-Hybridisierung basiert auf einem Prinzip, das der Fluoreszenzresonanzenergieübertragung ähnelt. Es wurde entwickelt, um sowohl die Empfindlichkeit und Spezifität in Zebrafisch ISH zu verbessern sowie zielspezifische Signale zu verstärken, ohne das Hintergrundsignal zu beeinflussen.
In 24 hpf Zebrafischembryonen exprimiert sich Endoglin stark in der hinteren Kardinalvene (PCV), intersegmentalen .......
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Diskussion
Dieses Protokoll wendete eine verbesserte In-situ-RNA-Analyseplattform für Zebrafisch- und Röhrenbildungstests auf iPSC-ECs an, die von einem HHT-Patienten abgeleitet wurden. Die traditionelle ISH-Methode erfordert einen längeren Experimentellen Zyklus mit zusätzlichen experimentellen Schritten. Das Protokoll hat einige wichtige Verbesserungen, die Verwendung von unabhängigen Doppel-Z-Sonden und iPSCs von einem Patienten mit HHT abgeleitet, die in WISH-Assays bzw. Rohrbildung angewendet wurden. Diese Verfeinerungen sind .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Key Research and Development Program of China-stem cell and translational research [grant number 2016YFA0102300 (to Jun Yang)];the Nature Science Foundation of China [grant number 81870051, 81670054 (to Jun Yang)]] unterstützt; der CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [Fördernummer 2016-I2M-4-003 (an Jun Yang)]; der PUMC Youth Found und die Fundamental Research Funds for the Central Universities [Grant Nummer 2017310013 (to Fang Zhou)].
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Zellkulturverstärker |
| 1-FL | ACD | SDS | Signalverstärkungsverstärker |
| 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signalverstärkungsverstärker |
| 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signalverstärker |
| 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signalverstärkung |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-freies Wasser |
| Human Endothel-SFM | Thermofisher | 11111044 | Zellkultur |
| Paraformaldehyd | Sigma | 30525-89-4 | Fixierte Embryonen |
| Paraformaldehyd | Sigma | 30525-89-4 | Fixierte Zellen |
| Protease K | ACD | SDS | Digest |
| tissue Natriumcitrat | Sigma | 6132-04-3 | SSCT-Lösung: Waschpuffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Wachstumsfaktor |
Referenzen
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
