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Methodenartikel

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

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DOI:

10.3791/60498

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28. Mai 2020

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1Department of Physiology and Department of Cardiology of the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Wuxi Lung Transplant Center, Wuxi People's Hospital affiliated to Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Ganzmontage-IN-situ-RNA-Hybridisierungsanalyse in Zebrafischen und Rohrbildungs-Assay in patientenabgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Endothelzellen vorgestellt, um die Rolle von Endoglin bei der Gefäßbildung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Vaskuläre Entwicklung wird durch die sequentielle Expression spezifischer Gene bestimmt, die durch In-situ-Hybridisierungstests bei Zebrafischen in verschiedenen Entwicklungsstadien untersucht werden können. Um die Rolle von Endoglin(eng) bei der Gefäßbildung während der Entwicklung einer erblichen hämorrhagischen Telangangiektasien (HHT) zu untersuchen, werden Morpholino-vermittelte gezielte Knockdown von eng in Zebrafischen verwendet, um seine zeitliche Expression und die damit verbundenen Funktionen zu untersuchen. Hier wird die Voll-In-situ-RNA-Hybridisierung (WISH) für die Analyse von eng und seinen nachgelagerten Genen in Zebrafischembryonen eingesetzt. Außerdem werden Rohrbildungstests in HHT-Patienten-abgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzell-differenzierten Endothelzellen eng (iPSC-ECs; mit eng-Mutationen) durchgeführt. Ein spezifisches Signalverstärkungssystem mit der gesamten In-Situ-Hybridisierung – WISH bietet eine höhere Auflösung und niedrigere Hintergrundergebnisse im Vergleich zu herkömmlichen Methoden. Um ein besseres Signal zu erhalten, wird die Nachfixierungszeit nach der Sondenhybridisierung auf 30 min eingestellt. Da Fluoreszenzfärbung bei Zebrafischembryonen nicht empfindlich ist, wird sie hier durch Diaminobelidin (DAB) ersetzt. In diesem Protokoll werden von HHT-Patienten abgeleitete iPSC-Linien, die eine eng-Mutation enthalten, in Endothelzellen differenziert. Nach der Beschichtung einer Platte mit Kellermembranmatrix für 30 min bei 37 °C werden iPSC-ECs als Monolayer in Brunnen ausgesät und 3 h bei 37 °C gehalten. Anschließend werden die Rohrlänge und die Anzahl der Zweige anhand mikroskopischer Bilder berechnet. So wird mit diesem verbesserten WISH-Protokoll gezeigt, dass eine reduzierte Eng-Expression die Endothel-Vorläuferbildung bei Zebrafischembryonen beeinflusst. Dies wird durch Rohrbildungstests mit iPSC-ECs bestätigt, die von einem Patienten mit HHT abgeleitet wurden. Diese Assays bestätigen die Rolle für eng in der frühen Gefäßentwicklung.

Einleitung

Eine einzige Mutation auf eng (CD105) wurde bei Patienten mit HHT berichtet. Die Mutation führt zu einer erhöhten PROLIFERATION der EG und einer reduzierten durchflussvermittelten EG-Dehnung1,2. Es wurde auch bereits berichtet, dass ENG-Mangel reduziert endotheliale Marker Expression (d.h. kdrl, cdh5, hey2) in Zebrafisch3. Endoglin, das hauptsächlich in Endothelzellen exprimiert wird, ist ein Transmembran-Glykoprotein und fungiert als Co-Rezeptor zur Transformation des Wachstumsfaktors (TGF-) Familienmitglieder. Es weist die BMP9-Bindung auf die Zelloberfläche an, um das nachgeschaltete Gen, einschließlich der Id1-Expression, zu regulieren, um eine Stammzelldifferenzierung in Richtung ECs4zu induzieren. Somit spielt das eng-Gen eine wichtige Rolle bei der Vaskulogenese und der menschlichen Gefäßerkrankung5,6. Wir haben zuvor die Auswirkungen von Endoglin-Knockdown auf die Gefäßbildung in Zebrafischembryonen untersucht, gefolgt von einer Analyse von iPSCs-abgeleiteten ECs, die von einem HHT-Patienten mit einer eng-Mutation 7erworben wurden. Dieses Protokoll zeigt die Auswirkungen des ENG-Mangels auf die endotheliale Vorläufermarkerexpression und Rohrbildung, eine quantifizierbare Methode zur Messung der In-vitro-Angiogenese.

Um die räumliche und zeitliche Expression zu untersuchen, wird WISH verwendet, um die Genexpression in vivo8zu detektieren. In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine Methode zur Verwendung von markierten Sonden mit Komplementsequenzen von Zielnukleinsäuren (DNA oder mRNA), um Zielnukleinsäurehybriden in einer festen Probe zu erkennen und zu visualisieren. Der Prozess verstärkt Genexpressionssignale in vivo und wird verwendet, um die Expression von Genen durch Mikroskopie zu erkennen. WISH wurde häufig in verschiedenen Modelltieren verwendet, vor allem in Zebrafischen9. Es wird auch verwendet, um die folgenden Daten zu erfassen: 1) Gen räumliche /zeitliche Expressionsmuster, die Informationen über Genfunktion und Klassifizierung liefern; und 2) speziell exprimierte Genmarker, die in Hochdurchsatzmedikamenten oder Mutanten-Screening10verwendet werden.

Chromogene Sonden lassen sich mit der traditionellen Chromosomen-In-situ-Hybridisierung (CISH) leicht abbauen, was zu hohem Hintergrundrauschen und unspezifischen Signalen11,12führt. Die WISH-Methode verwendet zwei unabhängige Doppel-Z-Sonden, die entwickelt wurden, um RNA-Sequenzen auf das Ziel auszutosen. Jede Sonde enthält eine 18-25-Sequenz, die die Ziel-RNA ergänzt, und eine 14 Base-Tail-Sequenz (konzeptioniert als Z). Die Zielsonden werden in einem Paar (doppel Z) verwendet. Die beiden Hecksequenzen bilden zusammen eine 28 Basishybridisierungsstelle für den Vorverstärker, die 20 Bindungsstellen für den Verstärker enthält. Der Verstärker wiederum enthält 20 Bindungsstellen für die Etikettensonde und kann theoretisch bis zu 8.000 Etiketten für jede Ziel-RNA-Sequenz ergeben.

Diese fortschrittliche Technologie ermöglicht die gleichzeitige Signalverstärkung und Hintergrundunterdrückung, um eine Einzelmolekül-Visualisierung zu erreichen und gleichzeitig die Gewebemorphologie zu erhalten13. Weitere Modifikationen der WISH-Methoden basieren auf früheren Forschungsarbeiten14, einschließlich zusätzlicher Fixierung und DAB-Färbung. Vorausgesetzt, hier ist ein verbessertes WISH-Protokoll, das auch dann funktionieren kann, wenn die Ziel-RNA teilweise verkleinert oder abgebaut wird. Zu den Vorteilen gehört, dass es in 24 h ohne RNase-freie Bedingungen abgeschlossen werden kann. Signale können auch gleichzeitig über mehrere Kanäle von mehreren Zielen erkannt werden, und die Ergebnisse sind konsistent und kompatibel mit Ergebnissen von verschiedenen Automatisierungsplattformen mit hohem Durchsatz.

Die Ergebnisse von Tiermodellen spiegeln nicht das gleiche Phänomen wider, das beim Menschen auftritt. ENG enthält zwei Paare konservierter Cysteins, C30-C207 und C53-C182, die Disulfidbrücken in verwaisten Regionen bilden. Um die Rolle von eng bei HHT-Patienten weiter zu untersuchen, wurden Tube-Formations-Assays mit iPSCs, die von HHT-Patienten abgeleitet wurden, in Zellen ohne/mit eng-Mutationen (Cys30Arg, C30R)15durchgeführt. Nachdem Kubota et al. zuerst über das Rohrbildungsexperiment16berichtet haben, wurde der Assay auf verschiedene Weise entwickelt. Es wurde verwendet, um angiogene oder antiangiogene Faktoren zu identifizieren, die Signalwege in der Angiogenese zu definieren und Gene zu identifizieren, die die Angiogenese regulieren17.

Vor der Verfügbarkeit von patientenabgeleiteten iPSC-ECs verwendeten die Forscher hauptsächlich kultivierte ECs, um Angiogense16zu untersuchen. Für Endothelzellen ist es jedoch eine technische Herausforderung, exogene Gene mit einem Virus zu transduzieren, da die Durchreisezahl der ECs begrenzt ist. Dies liegt daran, dass es kaum genug zelluläres Material gibt, um von menschlichen Gefäßen entweder aus der Operation oder von den zugelassenen Spendern gesammelt zu werden. Mit der Erfindung der iPSC-Generierungstechnik von Shinya Yamanaka können aus iPSCs abgeleitete humane ECs zuverlässig in In-vitro-Experimenten eingesetzt werden, wie zuvorberichtet 18.

Die Verwendung viral transduzierter ECs mit begrenzten Anzahln und Passagen kann für Signalstudien ausreichen, aber für funktionelle Studien ist es besser, mutierte pluripotente Stammzelllinien (entweder iPSCs oder CRISPER/Cas9-gezielte hESCs) zu erzeugen und sie dann in ECs für Angiogenesestudien zu differenzieren, die Röhrenbildungstestsverwenden 19. Die Rohrbildung kann verwendet werden, um die Funktion von Endothelzellen zu bewerten, die Mutationen tragen. Dieses Protokoll beschreibt auch die Rohrbildung auf einer Angiogeneseplatte, die eine einfache, kostengünstige und reproduzierbare Methode ist.

Das nachstehende Protokoll bietet eine zuverlässige und systemische Methode zur Untersuchung der Rolle bestimmter Gene bei der Gefäßbildung, zusammen mit Details für in vivo-Expressionsmuster und In-vitro-Funktionalquantifizierung zur Modellierung menschlicher Krankheiten.

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Protokoll

Alle beschriebenen Tierversuche wurden von der Forschungsethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Zhejiang genehmigt.

1. Ganzmontierte In-situ-Hybridisierung

  1. Zebrafisch Linie Haltung und Fortpflanzung
    1. Füttern und züchten Sie alle erwachsenen Zebrafische bei 26-28 °C in einem rezirkulierenden Aquakultursystem mit 14 h Licht/10 h dunklem Zyklus für jeden Tag. Verwenden Sie AB (Wild-Typ) Zebrafischlinien für die folgenden Verfahren.
    2. Legen Sie eine Schicht Kieselsteine in den Boden der Zuchtbox als Unterschlupf für Eier. Gruppieren Sie elternfische im Verhältnis 2:1 (d.h. zwei Weibchen und ein Männchen) in jede Box. Lassen Sie die weiblichen Fische für 1 Tag laichen. Entfernen Sie am Ende des Laichens die Elternfische sofort, um sie daran zu hindern, die Eier zu essen.
    3. Injizieren Sie die 2 ng Morpholinos und 500 pg mRNA in einzellige Stadium-Embryonen mit dem Femto Jet Injektionssystem unter dem Mikroskop (Endoglin-MOs-Sequenz: 5'-GATGAACTCAACACTCGTGTCTGAT-3'; 5-Fehlpaar-Kontroll-MOs-Sequenz: 5'-AAACACACACACACATCC-3').
    4. Die Zygoten in saurem Meerwasser bei 27 °C für ca. 48 h inkubieren.
  2. Sammlung und Fixierung von Zebrafischembryonen
    1. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um 20-40 Zebrafischembryonen aus dem zirkulierenden Systemwasser (pH = 5,0) in einem 1,5 ml Rohr zu sammeln, wenn sie dechorioniert werden und eine bestimmte Entwicklungsphase erreichen. 1 ml frisch zubereitete 4% PFA-Lösung bei Raumtemperatur (RT) hinzufügen.
      HINWEIS: Der Zeitraum, in dem der gewählte Embryo ausgewählt wird, basiert auf dem Zweck des Experiments. Tabelle 1 zeigt die Fixierungszeit, die für verschiedene Embryonale Zeiträume erforderlich ist.
    2. Entfernen Sie die Fixierlösung, waschen Sie Embryonen mit phosphatgepufferter Lösung mit Tween-20 (PBST, verdünnt 1 ml Tween in 1000 ml PBS-Lösung) 3x für jeweils 5 min bei RT.
    3. Dehydrieren Sie die Embryonen durch Inkubation in einer Reihe von 25%, 50% und 75% Methanol (in PBST verdünnt) für jeweils 5 min. Embryonen für 5 min auf 100% Methanol übertragen und durch frisches Methanol ersetzen. Lagern Sie die Embryonen bei -20 °C über Nacht oder länger.
  3. Hydration und Verdauung
    1. Hydrat-Embryonen, die in 100% Methanol mit einem Sieb mit Nylongewebe am Boden konserviert wurden, um Embryonen in den Brunnen von 12 Brunnenplatten mit einer Reihe von 75%, 50% und 25% Methanol (in PBST verdünnt) für jeweils 5 min nacheinander zu waschen. Waschen Sie die Embryonen mit PBST 3x für jeweils 5 min bei RT.
    2. Fügen Sie mit Embryonen 50 l Proteinase K (10 mg/ml) in die Röhre und folgen Sie der Verdauungszeit in Tabelle 2 bei RT.
    3. Entfernen Sie die Proteinase K und waschen Sie Embryonen mit PBST 3x für jeweils 5 min bei RT.
  4. Probehybridisierung und Postfixierung
    1. Setzen Sie die nach den mRNA-Sequenzen jedes Gens entworfenen Sonden in ein 40 °C-Hybridizatin-System, bis der Niederschlag gelöst ist, Mischen Sie die Zielsonden von z.B. (XM_007116.7) und zwei weitere wichtige Gene in der frühen mesoderm endotheialen Vorläuferbildung (hier aplnr [NM_001075105.1] und nrp1a [NM_001040326.1]) in einem 1,5 ml Rohr mit einem Verhältnis von 50:1:1.
    2. Fügen Sie in jeder Röhre mit Embryonen 50-100 l gemischte Zielsonden hinzu und inkubieren Sie sie dann über Nacht bei 40 °C.
      HINWEIS: Vorgemischte Sonden müssen vor gebrauchsbeheizt auf 40 °C vorgewärmt und vor Gebrauch auf RT gekühlt werden.
    3. 0,2x Saline-Natriumcitratlösung mit Tween-20 (SSCT) vorbereiten: 175,3 g NaCl und 88 g Natriumcitrat in 1 L dH2O auflösen, um eine 20x SSC-Lösung zu erhalten. Verdünnen Sie dann die Lösung 1:100 in dH2O, um eine 0,2 x SSCT-Lösung zu erhalten. Tween-20 1:1000 in der 0.2x SSCT-Lösung verdünnen.
    4. Übertragen Sie die recycelten Sonden in ein neues Rohr. Waschen Sie die Embryonen in 0,2x SSCT-Lösung 3x für je 15 min bei RT. Die recycelten Sonden können 5x-10x wiederverwendet werden.
    5. Verwenden Sie 4% Paraformaldehyd (PFA), um die Embryonen für 30 min bei RT zu fixieren. Waschen Sie die Embryonen in 0,2x SSCT-Lösung 3x für jeweils 15 min bei RT.
      HINWEIS: Die Arbeit von Gross-Thebing et al. schlägt eine Nachfixierungsperiode von 10 min14vor, aber der tatsächliche Betrag muss entsprechend angepasst werden. Hier haben wir 10 min Post-Fixierung 3x getestet, und die Empfindlichkeit des DAB-Sterbens wird maßgeblich beeinflusst. Stellen Sie nach der Untersuchung sicher, dass 0,5-1,0 h Fixierung die optimale Bedingung ist (eine kürzere Fixierungszeit kann kein klares Signal aus der Ziel-RNA erzeugen, und die entsprechende Verlängerung der Fixationszeit hilft, das Signal zu stärken und weniger Hintergrundgeräusche zu erzeugen).
  5. Sequenzielle Verstärker- und Etikettensondenhybridisierung
    1. Entfernen Sie die SSCT-Lösung, und ersetzen Sie sie durch 50 L Amp 1. Lassen Sie die Embryonen 30 min bei 40 °C in Amp 1 absetzen. Dann waschen Sie die Embryonen in 0,2x SSCT-Lösung 3x für jeweils 15 min bei RT.
    2. Entfernen Sie die SSCT-Lösung, und fügen Sie 50 L Amp 2 hinzu. Lassen Sie die Embryonen 15 min bei 40 °C absetzen. Dann waschen Sie die Embryonen in 0,2x SSCT-Lösung 3x für jeweils 15 min bei RT.
    3. Entfernen Sie die SSCT-Lösung, fügen Sie 50 L Amp 3 hinzu und tippen Sie mild auf das Rohr. Dann inkubieren Sie die Embryonen bei 40 °C für 30 min. Waschen Sie die Embryonen in 0,2x SSCT-Lösung 3x für jeweils 15 min bei RT.
    4. Entfernen Sie die SSCT-Lösung, fügen Sie 50 L Amp 4 tropfenweise hinzu, und tippen Sie vorsichtig auf das Rohr. Dann inkubieren Sie die Embryonen bei 40 °C für 15 min. Waschen Sie die Embryonen in 0,2x SSCT 3x für jeweils 15 min bei RT.
  6. Gegenfärbung und Mikroskopie
    1. Entfernen Sie die SSCT-Lösung, und fügen Sie jedem Rohr 50 L DAPI hinzu. Die Embryonen über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    2. Waschen Sie die Embryonen mit PBST und bereiten Sie sie mit einer 1% Low Melting Point Agarose (LMP) Lösung (1 g LMP gelöst in 100 ml dH2O) in einer mit PBST gefüllten Petrischale auf die Bildgebung vor.
    3. Verwenden Sie ein DAB Peroxidase Substrat Kit, um die Probe zu färben. Fügen Sie die Farbreagenzien A, B und C (je 50 l) zu 1 ml destilliertem Wasser hinzu und mischen Sie sie gut, um eine vollständige DAB-Arbeitsflüssigkeit zu erhalten. Fügen Sie die Flüssigkeit in die Probe und decken Sie für 10 min.
    4. Waschen Sie die Probe nach der Färbung gründlich mit PBST.
    5. Verwenden Sie ein optisches Mikroskop mit einer fotografischen Funktion für die Abbildung der Proben.
      HINWEIS: Wenn Sie später Bilder aufnehmen, sollten die Rohre in Aluminiumfolie eingewickelt und bei 4 °C gelagert werden.

2. Rohrformationstest

HINWEIS: Die eng mutierten und wildtypisierten ECs (Kontrolle) wurden von iPSCs unterschieden, die von einem HHT-Patienten abgeleitet wurden (hier, eine 62-jährige Patientin mit wiederkehrenden Epistaxis seit 22 Jahren, Magen-Darm-Blutungen, pulmonale arteriovenöse Fehlbildungen, die eine Fehlwahrnehmung in Position c.88T>C von Exon 2 tragen, und ein gesunder Spender (ohne Eng-Mutation), die vom Peking Union Medical College Hospital mit Zustimmung des College-Forschungsethikausschusses zur Verfügung gestellt wurden.

  1. Kontroll- und HHT-iPSC-Zellkulturen
    1. Fügen Sie ein bestimmtes Volumen der Kellermembranmatrix (z.B. Matrigel) zu einer 6-Well-Zell-Kulturplatte hinzu, um den Boden des Brunnens zu bedecken und die Platten für 1 h bei 37 °C zu bebrüten.
      HINWEIS: Bei verwendung der Kellermembranmatrix bei -20 °C lagern, auf Eis oder in einem frostfreien 4 °C-Kühlschrank bebrüten, bis sie aufgetaut sind. Anschließend bei 1:100 in DMEM/F12 verdünnen und dann das Verdünnungsmittel in 200 L-Rohre verteilen, die jeweils 100 l enthalten. Bewahren Sie die Rohre bei -20 °C auf und vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Beim Hinzufügen der verdünnten Kellermembranmatrix keine Blasen erzeugen. Nach Zugabe der verdünnten Kellermembranmatrix die 6 Wellplatte vorsichtig von Hand schütteln, so dass sie den Boden gleichmäßig bedeckt.
    2. Nach dem Beschichten der Platte, entfernen Sie die verwendete Kellermembran Matrixlösung aus den Brunnen. Dann fügen Sie 2 ml mTeSR1 Medium in jeden Brunnen, und Platte die iPSCs aus dem letzten Durchgang bei etwa 1 x 106 pro Brunnen geerntet.
  2. Erzeugung und Erweiterung von ECs von iPSCs
    1. Nach ca. 4 Tagen iPSC-Kultur das Kulturmedium mit BEL-Medium, ergänzt durch Aktivin A (25 ng/ml), BMP4 (30 ng/ml), VEGF165 (50 ng/mL) und CHIR99021 (1,5 m) austauschen. Wachsen Sie die Zellen für 3 Tage, um Mesodermzellen zu erzeugen.
    2. Ersetzen Sie das in Schritt 2.2.1 beschriebene Medium durch BEL-Medium, das durch VEGF (50 ng/mL) und SB431542 (10 m) ergänzt wird, um die Gefäß-ECs zu erweitern. Behandeln Sie die Zellen mit dem gleichen Medium und der gleichen Kultur für weitere 3-4 Tage.
    3. Verwenden Sie CD31-Dynabeads, um die reifen Gefäß-ECs zu reinigen: Beziehen Sie sich auf die Anweisungen im CD31-Dynabeads-Kit, das menschliche CD31-Antikörper mit magnetischen Perlen verbindet, um CD31-Moleküle auf ECs zu kombinieren, und dann die CD31-positiven Zellen durch Elutionspuffer sammeln. Pflege und Erweiterung der gereinigten ECs in EC-SFM-Medium, das VEGF165 (30 ng/ml), bFGF (30 ng/ml) und FBS (1%) enthält.
  3. Beschichtung von Endothelzellen auf Matrigel-beschichteten Platten und Mikroskopie
    1. Fügen Sie 10 l Kellermembranmatrix pro Brunnen hinzu, um die Angiogeneseplatten zu beschichten (siehe Materialtabelle) und bei 30 min bei 37 °C zu brüten.
    2. Endothelzellen nach Überprüfung der Endothelmarker CD31 und VE-Cadherin mit Immunfluoreszenzfärbung ernten und im endotheliaalen Wachstumsmedium 2 durch wiederholtes Pipetieren wieder aussetzen. Fügen Sie 50 l Zellsuspension (2 x 105 Zellen/ml) pro Bohrung in die erstarrte Matrix ein und inkubieren Sie die Zellen für 3-5 h bei 37 °C.
      HINWEIS: Vor dem Röhrenbildungsexperiment sollten Endothelmarker überprüft werden, um sicherzustellen, dass der richtige Phänotyp der funktionellen Endothelzellen. 1 x 104 Zelle pro Brunnen ist eine ideale Zahl für die Rohrbildung. Zu viele oder zu wenige Zellen sind der Rohrbildung nicht förderlich. Fügen Sie Zellen von der Seite der Schale hinzu und berühren Sie nicht die Kellermembranmatrix. Verwenden Sie Lichtmikroskop im Feld mit hoher Vergrößerung, um die Zellen zu überprüfen und Fotos zu machen.
  4. Quantitative Ergebnisse der Rohrbildung
    1. Beobachten Sie die Ergebnisse mit einem Mikroskop mit hoher Auflösung und machen Sie Bilder von mindestens 10 Bereichen für jede Gruppe, um zuverlässige Datenstatistiken zu erhalten.
    2. Untersuchen Sie die Bildung von Endothelrohren: Schätzen Sie das Ausmaß der Rohrbildung, indem Sie die gesamte Rohrlänge, die Rohrzahl und die Verzweigungspunkte untersuchen. Bewerten und zählen Sie die Anzahl und Länge der Zweige mit der ImageJ-Software.

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Ergebnisse

Die gesamte Mount-in-situ-Hybridisierung basiert auf einem Prinzip, das der Fluoreszenzresonanzenergieübertragung ähnelt. Es wurde entwickelt, um sowohl die Empfindlichkeit und Spezifität in Zebrafisch ISH zu verbessern sowie zielspezifische Signale zu verstärken, ohne das Hintergrundsignal zu beeinflussen.

In 24 hpf Zebrafischembryonen exprimiert sich Endoglin stark in der hinteren Kardinalvene (PCV), intersegmentalen ...

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Diskussion

Dieses Protokoll wendete eine verbesserte In-situ-RNA-Analyseplattform für Zebrafisch- und Röhrenbildungstests auf iPSC-ECs an, die von einem HHT-Patienten abgeleitet wurden. Die traditionelle ISH-Methode erfordert einen längeren Experimentellen Zyklus mit zusätzlichen experimentellen Schritten. Das Protokoll hat einige wichtige Verbesserungen, die Verwendung von unabhängigen Doppel-Z-Sonden und iPSCs von einem Patienten mit HHT abgeleitet, die in WISH-Assays bzw. Rohrbildung angewendet wurden. Diese Verfeinerungen sind ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Key Research and Development Program of China-stem cell and translational research [grant number 2016YFA0102300 (to Jun Yang)];the Nature Science Foundation of China [grant number 81870051, 81670054 (to Jun Yang)]] unterstützt; der CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [Fördernummer 2016-I2M-4-003 (an Jun Yang)]; der PUMC Youth Found und die Fundamental Research Funds for the Central Universities [Grant Nummer 2017310013 (to Fang Zhou)].

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
µ-Slide Angiogenesisibidi81506Zellkulturverstärker
1-FLACDSDSSignalverstärkungsverstärker
2-FLACDSDS 320853Signalverstärkungsverstärker
3-FLACDSDS 320854Signalverstärker
4 Alt B-FLACDSDS 320856Signalverstärkung
Corning Matrigel MatrixCorning354234Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel
DEPCSigmaD5758RNAase-freies Wasser
Human Endothel-SFMThermofisher11111044Zellkultur
ParaformaldehydSigma30525-89-4Fixierte Embryonen
ParaformaldehydSigma30525-89-4Fixierte Zellen
Protease KACDSDSDigest
tissue NatriumcitratSigma6132-04-3SSCT-Lösung: Waschpuffer
VEGF-165STEMCELL Technologies78073Wachstumsfaktor
320852 322337

Referenzen

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