Methodenartikel

Trennung der Zellhülle für gramnegative Bakterien in innere und äußere Membranfraktionen mit technischen Anpassungen für Acinetobacter baumannii

DOI:

10.3791/60517

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10. April 2020

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1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Gramnegative Bakterien produzieren zwei räumlich getrennte Membranen. Die äußere Membran wird durch ein Periplasma und eine Peptidoglykanschicht von der inneren Membran abgetrennt. Die Fähigkeit, die beiden Doppelschichten dieser Mikroben zu isolieren, war entscheidend für das Verständnis ihrer Physiologie und Pathogenese.

Zusammenfassung

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Diese Methode arbeitet, indem die Hülle von Gram-negativen Bakterien in Total-, Innen- und Außenmembranfraktionen (OM) aufgeteilt wird, und schließt mit Assays, um die Reinheit der Bilayer zu bewerten. Das OM hat eine erhöhte Gesamtdichte im Vergleich zur inneren Membran, hauptsächlich aufgrund des Vorhandenseins von Lipooligosacchariden (LOS) und Lipopolysacchariden (LPS) innerhalb der äußeren Packungsbeilage. LOS- und LPS-Moleküle sind amphipathische Glykolipide, die eine ähnliche Struktur haben, die aus einem Lipid-A-Disaccharolipid und Einem Kern-Oligosaccharid-Substituenten besteht. Allerdings sind nur LPS-Moleküle mit einer dritten Untereinheit, die als O-Polysaccharid oder O-Antigen bekannt ist, verziert. Die Art und Menge der vorhandenen Glykolipide wirkt sich auf die OM-Dichte eines Organismus aus. Daher haben wir getestet, ob die Membranen von Bakterien mit unterschiedlichem Glykolipidgehalt mit unserer Technik ähnlich isoliert werden können. Für die LPS-produzierenden Organismen, Salmonella enterica serovar Typhimurium und Escherichia coli,waren die Membranen leicht zu isolieren und die LPS-O-Antigen-Moiety wirkte sich nicht auf die Bilayer-Partitionierung aus. Acinetobacter baumannii produziert LOS-Moleküle, die eine ähnliche Masse wie O-Antigen-mangelhafte LPS-Moleküle haben; Die Membranen dieser Mikroben konnten jedoch zunächst nicht getrennt werden. Wir argumentierten, dass das OM von A. baumannii weniger dicht war als das von Enterobacteriaceae, so dass der Saccharosegradient angepasst wurde und die Membranen isoliert wurden. Die Technik kann daher für den Einsatz mit anderen Organismen angepasst und modifiziert werden.

Einleitung

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Gram-negative Bakterien produzieren zwei Membranen, die durch einen periplasmischen Raum und eine peptidoglykanische Zellwand1getrennt sind. Die innere Membran (IM) umschließt das Zytosol und ist eine symmetrische Bischicht von Phospholipiden. Peptidoglycan schützt vor Turgordruck und verleiht dem Bakterium eine Zellform und wird durch Lipoproteine2,3an der äußeren Membran (OM) befestigt. Das OM umgibt das Periplasma und ist überwiegend asymmetrisch. Die innere Packungsbeilage besteht aus Phospholipiden und die äußere Packungsbeilage besteht aus Glycolipiden, die als Lipooligosaccharide....

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Protokoll

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1. Allgemeine Reagenzien und Medienvorbereitung für die Membranextraktion

  1. Bakterielle Wachstumsmedien: Bereiten Sie 1 L Brühemedien in einem gründlich gereinigten und autoklavten 2 L Kolben vor und sterilisieren.
  2. Allgemeiner Reaufhängungspuffer (1 M Tris Puffer pH 7,5; 50 ml): 6,05 g Tris-Basis in 30 ml H2O auflösen. pH auf 7,5 mit 5 M HCl einstellen. Endvolumen auf 50 ml mit Reinst h2O einstellen.
  3. Master-Vorrat an divalenter Kationen-Chelationslösung (0,5 M EDTA pH 8; 100 ml): 18,6 g Dinatriumethylen-Tetraacetat hinzufügen 2H2bis 80 mlH2O. Kräftig umrühren und pH auf 8,0 mit NaOH einstellen. En....

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Ergebnisse

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Diese Technik bietet ein wirksames Mittel, um die IMs und OMs für Gram-negative Bakterien zu isolieren. Ein Überblick über das gesamte Verfahren ist dargestellt (Abbildung 1). Im Allgemeinen stellt die Normalisierung der Kulturen auf eine OD600 von 0,6-0,8 in 1 L Medien oder die Ernte zwischen 6,0 und 8,0 x 1011 Bakterienzellen sicher, dass die entsprechende Menge an Membranmaterial für die nachfolgende Trennung gesammelt wird.

Beim Lysing de.......

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Diskussion

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Diese Methode wird den Forschern weiterhin dabei helfen, die Rolle der Zellhülle in der bakteriellen Physiologie und Pathogenese zu verstehen. Nach den sequenziellen Ultrazentrifugationsschritten kann eine gereinigte Gesamt-, Innen- und OM-Fraktion erhalten werden. Diese Membranen können isoliert untersucht werden, um Hypothesen im Zusammenhang mit der Lokalisierung und Funktion des Membranproteins, dem Transport und dem Handel über das Periplasma und die Zusammensetzung der einzelnen Doppelschichten unter verschiedenen .......

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von P20GM10344 und R01AI139248 an Z. D. Dalebroux vergeben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 L Zentrifugenflaschen, PC/PPCO, super Speed, mit Verschlusskappe, NalgeneVWR525-0466
1 L Pyrex Medienvorratsflasche mit HochtemperaturverschlussVWR10416-312
2.000 mL Erlenmeyerkolben, EnghalsVWR10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 wellBIORAD4561095
4x Laemmli Probe Puffer 10 mLBIORAD1610747
50 mL sterile Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenVWR89049-174
7 mL Dounce Gewebehomogenisator mit zwei GlasstößelnVWR71000-518
70 mL Polycarbonat-FlaschenbaugruppeBeckman Coulter Life Sciences355622
Agar PulverVWRA10752
B10P Tischgerät pH-Messgerät mit pH-SondeVWR89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (Bankversion)ThermoFisher Scientific50136146
Benzonase-NukleaseMilliporeSigma70746-3
EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat 99,0-101,0%, Kristalle, hochreines Bioreagenz Molekularbiologische Qualität, J.T. BakerVWR4040-01
EmulsiFlex-C3Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy FestwinkelrotorThermoFisher Scientific75006526
Salzsäure 6,0 NVWRBDH7204
IBI Scientific Orbital-PlattformschüttlerFischer Scientific15-453-211
LB Bouillon MillerVWR214906
Lysozym, Eiweiß, Ultra Pure GradeVWRVWRV0063
Magnesiumchlorid-HexahydratSigma AldrichM2670
NADHSigma Aldrich10107735001
Optima XPN-80 - IVDBeckman Coulter Life SciencesA99839
Pharmco Produkte  REINER ALKOHOL 200 PROOF GL 4/CS Fischer ScientificNC1624582
Phenollösung, äquilibriert mit 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, BioReagenz, für die MolekularbiologieSigma - MilliporeP4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay KitThermofisher23238
Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharid Gel Stain KitThermofisherP20495
Proteacease -50, EDTA freiG Biosciences786-334
Proteinase K, Molekularbiologie GradeNew England BiolabsP8107S
Natriumhydroxid ≥ 99.99%VWRAA45780-22
Sorval RC 6 Plus ZentrifugeThermoFisher Scientific36-101-0816
SaccharoseMilliporeSigmaSX1075-3
SW 41 Ti SchwingschaufelrotorBeckman Coulter Life Sciences331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS, Trometamol) ≥ 99,9 % (getrocknete Basis), hochreines Bioreagenz Molekularbiologische Qualität, J.T. BakerVWRJT4109-6
Typ 45 Ti Titanrotor mit festem WinkelBeckman Coulter Life Sciences339160
Ultraklares Rohr, 14 x 89 mmBeckman Coulter Life Sciences344059
Vortex-Genie 2VWR102091-234

Referenzen

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  1. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414(2010).
  2. Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).<....

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Schlagwörter

Gram negative BacteriaInner MembraneOuter MembraneSucrose Density GradientMembrane FractionationUltracentrifugationAcinetobacter baumanniiLipooligosaccharidesNADH Dehydrogenase AssayMembrane Purity

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