Methodenartikel

Trennung der Zellhülle für gramnegative Bakterien in innere und äußere Membranfraktionen mit technischen Anpassungen für Acinetobacter baumannii

DOI:

10.3791/60517

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10. April 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Gramnegative Bakterien produzieren zwei räumlich getrennte Membranen. Die äußere Membran wird durch ein Periplasma und eine Peptidoglykanschicht von der inneren Membran abgetrennt. Die Fähigkeit, die beiden Doppelschichten dieser Mikroben zu isolieren, war entscheidend für das Verständnis ihrer Physiologie und Pathogenese.

Zusammenfassung

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Diese Methode arbeitet, indem die Hülle von Gram-negativen Bakterien in Total-, Innen- und Außenmembranfraktionen (OM) aufgeteilt wird, und schließt mit Assays, um die Reinheit der Bilayer zu bewerten. Das OM hat eine erhöhte Gesamtdichte im Vergleich zur inneren Membran, hauptsächlich aufgrund des Vorhandenseins von Lipooligosacchariden (LOS) und Lipopolysacchariden (LPS) innerhalb der äußeren Packungsbeilage. LOS- und LPS-Moleküle sind amphipathische Glykolipide, die eine ähnliche Struktur haben, die aus einem Lipid-A-Disaccharolipid und Einem Kern-Oligosaccharid-Substituenten besteht. Allerdings sind nur LPS-Moleküle mit einer dritten Untereinheit, die als O-Polysaccharid oder O-Antigen bekannt ist, verziert. Die Art und Menge der vorhandenen Glykolipide wirkt sich auf die OM-Dichte eines Organismus aus. Daher haben wir getestet, ob die Membranen von Bakterien mit unterschiedlichem Glykolipidgehalt mit unserer Technik ähnlich isoliert werden können. Für die LPS-produzierenden Organismen, Salmonella enterica serovar Typhimurium und Escherichia coli,waren die Membranen leicht zu isolieren und die LPS-O-Antigen-Moiety wirkte sich nicht auf die Bilayer-Partitionierung aus. Acinetobacter baumannii produziert LOS-Moleküle, die eine ähnliche Masse wie O-Antigen-mangelhafte LPS-Moleküle haben; Die Membranen dieser Mikroben konnten jedoch zunächst nicht getrennt werden. Wir argumentierten, dass das OM von A. baumannii weniger dicht war als das von Enterobacteriaceae, so dass der Saccharosegradient angepasst wurde und die Membranen isoliert wurden. Die Technik kann daher für den Einsatz mit anderen Organismen angepasst und modifiziert werden.

Einleitung

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Gram-negative Bakterien produzieren zwei Membranen, die durch einen periplasmischen Raum und eine peptidoglykanische Zellwand1getrennt sind. Die innere Membran (IM) umschließt das Zytosol und ist eine symmetrische Bischicht von Phospholipiden. Peptidoglycan schützt vor Turgordruck und verleiht dem Bakterium eine Zellform und wird durch Lipoproteine2,3an der äußeren Membran (OM) befestigt. Das OM umgibt das Periplasma und ist überwiegend asymmetrisch. Die innere Packungsbeilage besteht aus Phospholipiden und die äußere Packungsbeilage besteht aus Glycolipiden, die als Lipooligosaccharide (LOS) oder Lipopolysaccharide (LPS)4,5bekannt sind. Die Lipidasymmetrie und die Biochemie der LOS/LPS-Moleküle in der äußeren Packungsbeilage verleihen der Zelloberfläche Barriereeigenschaften, die das Bakterium vor Gefahren in seiner Umgebung schützen6,7.

LPS-Moleküle bestehen aus drei Bestandteilen: dem Lipid A Disaccharolipid, dem Kernoligosaccharid und dem O-Polysaccharid oder O-Antigen. Lipid A ist ein multipliziertes acyatiertes Disaccharolipid. Kernoligosaccharide bestehen aus 10–15 Zuckern, die als grobes LPS oder R-LPS bekannt sind. Der Kern ist in den inneren Bereich unterteilt, der aus 2-Keto-3-Deoxy-D-Manno-Octulosesäure (kdo) und einem oder mehreren Heptoserückständen besteht, und einem äußeren Bereich, der im Allgemeinen aus Hexosen (Glucose oder Galaktose) und Häptosen oder Acetamidozuckern5besteht. Der äußere Kernbereich ist in seinen Komponenten und seiner Struktur variabler als der innere Kern. In Salmonella spp. wurde nur eine Kernstruktur beschrieben; In Escherichia coli gibt es jedoch fünf verschiedene Kernstrukturen (bezeichnet K-12, R1, R2, R3 und R4)8. E. coli K-12 DH5, die wir in diesem Verfahren verwenden, trägt eine Mutation, die in der Produktion R-LPS9führt. Den R-LPS-Molekülen fehlt die O-Antigen-Moiety und sie haben ein ähnliches Molekulargewicht wie LOS-Moleküle.

Die Zugabe von O-Antigen zu R-LPS verwandelt dieses Molekül in glattes LPS oder S-LPS. Die O-Antigene sind aus kurzen 3-4 Kohlenhydrat-Untereinheiten gebaut und bestehen aus mehreren Modalitäten mit unterschiedlichen Kettenlängen10. Einige LPS-produzierende Bakterien, wie Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), zeigen eine trimodale Verteilung von LPS-Molekülen auf ihrer Oberfläche10,11. Sehr lange Ketten-O-Antigene können über hundert Untereinheiten enthalten und mehr als hundert Kilodaltonen wiegen. Die O-Antigene verleihen dem Bakterium Oberflächeneigenschaften, die notwendig sind, um Antibiotika zu widerstehen, Raubüberfällen durch Bakteriophagen zu entgehen und Krankheiten zu verursachen.

Arten von Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria und andere erzeugen LOS Moleküle anstelle von LPS Moleküle auf ihrer Oberfläche12. LOS-Moleküle bestehen aus Lipid A und Kern-Oligosacchariden, aber das O-Antigen fehlt. Diese Arten von Gram-negativen Bakterien modifizieren ihre Kernoligosaccharide mit zusätzlichen Zuckern und Zuckerkombinationen, um die Oberflächeneigenschaften zu verändern12. Sowohl LOS- als auch LPS-produzierende Mikroben leiten die Phosphate auf Lipid A und Kernmoleküle mit kationischen Molekülen7ab. Zu diesen Zusätzen gehören Phosphoethanolamin, Galactosamin und Aminoarabinosesubstitutionen, die durch Neutralisierung der anionischen Oberflächenladung und damit zum Schutz vor kationischen antimikrobiellen Peptiden funktionieren. Gram-negative Bakterien verändern auch die Kern-Oligosaccharid-Struktur mit variablen nicht-stoichiometrischen Substitutionen von Zuckern oder zusätzlichen kdo-Molekülen und verändern die Anzahl der Acylketten auf Lipid-A-Disaccharolipiden7.

Die Fähigkeit, das IM aus dem OM von Gram-negativen Bakterien zu isolieren, war entscheidend für das Verständnis der Rolle der Zellhülle bei der antimikrobiellen Resistenz und Krankheitspathogenese11,12. Ableitungen dieses Ansatzes wurden verwendet, um Mechanismen der Montage, Wartung und Umgestaltung des Proteins, Phospholipid, und Glykolipid Bestandteile für die OM abzuleiten.

Unser Labor führt routinemäßig bakterielle lipidomische Analysen durch, um die proteinvermittelte Lipidregulation und Lipidfunktion bei einer Vielzahl von Gram-negativen Arten zu untersuchen. Die im Protokoll verwendeten Volumina spiegeln die routinemäßige Anwendung dieses Verfahrens zur Analyse nicht radioaktiv markierter Phospholipide durch Dünnschichtchromatographie und Flüssigchromatographie Tandemmassenspektrometrie13,14wider.

Das Protokoll beginnt damit, eine gekühlte Suspension von Gram-negativen Bakterien einer hochosmolaren Lösung von Saccharose auszusetzen und Lysozym hinzuzufügen, um das OM von der zugrunde liegenden Peptidoglykanschicht zu trennen (Abbildung 1)12. EDTA wird dann hinzugefügt, um das Eindringen des Lysozym zu erleichtern, da die divalente Kationsequestrierung die lateralen elektrostatischen Überbrückungswechselwirkungen zwischen benachbarten LOS/LPS-Molekülen15stört. Das ursprüngliche Protokoll, von dem unser Protokoll angepasst wurde, erforderte die Bildung von Spheroplasten, einer gramnegativen Bakterienzellform, die aus einer Plasmamembran und Zytosol besteht, aber die Peptidyllykanschicht und ein OM fehlt. Es ist möglich, dass Spheroplaste nach dem angepassten Verfahren hergestellt werden; jedoch, die Technik nicht verlassen oder beabsichtigen auf ihre Bildung für den Erfolg. Stattdessen werden die lysozym-EDTA-behandelten Bakterien schnell durch Zentrifugation geerntet und in einer Saccharoselösung mit geringerer Konzentration vor der Drucklyse wieder suspendiert. Die OMs, die durch die Bildung von Spheroplasten freigesetzt worden sein könnten, sollten theoretisch aus den Überstand der behandelten Zellen geerntet werden können, aber dieser Ansatz ist hierin nicht detailliert. Letztlich werden die behandelten Zellen einer konventionellen Homogenisierung und Lyse unterzogen, was die Effizienz und Reproduzierbarkeit des Membrantrennverfahrens verbessert16.

Nach der Lyse werden die Gesamtmembranen durch Ultrazentrifugation gesammelt und auf einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten aufgetragen, um die IMs und OMs zu fraktionieren. Der klassische Ansatz verwendet einen kontinuierlicheren Gradienten, der aus mindestens fünf verschiedenen Saccharoselösungenbesteht 11,12. Der diskontinuierliche Gradient in unserem Protokoll besteht aus drei Saccharoselösungen und teilt die Doppelschichten in zwei unterschiedliche Brüche17. Die LOS- und LPS-Moleküle innerhalb der OMs von Gram-negativen Bakterien treiben die Hülle in eine obere braune IM-Fraktion mit niedriger Dichte und eine niedrigere weiße OM-Fraktion mit hoher Dichte(Abbildung 1 und Abbildung 2).

Acinetobacter baumannii sind wichtige multiresistente menschliche Krankheitserreger, die LOS-Moleküle in ihrem OM produzieren und eine Zellhülle aufrichten, die schwer zu trennen ist18,19. Jüngste Arbeiten deuten darauf hin, dass eine Ableitung des Protokolls, das wir hier präsentieren, verwendet werden kann, um die Doppelschichten dieser Organismen zu partitionieren20. Deshalb haben wir unser Protokoll auf A. baumannii 17978 getestet. Anfangs war das Verfahren unzureichend. Allerdings haben wir die Saccharosekonzentration der Lösung mit mittlerer Dichte modifiziert und die Trennung stark verbessert (Abbildung 2). Ein NADH-Dehydrogenase-Assay und ein LOS/LPS-Extraktions- und Detektionsverfahren wurden verwendet, um die Trennung für A. baumannii, Wildtyp S, zu bestätigen. Typhimurium und zwei O-Antigen-defizide enterobakterielle Genotypen; nämlich galE-mutant S. Typhimurium und ein Laborstamm, E. coli DH5 (Abbildung 3 und Abbildung 4).

Die Absicht dieser Arbeit ist es, einen schlanken Ansatz für die reproduzierende Isolierung der Membranen von Gram-negativen Bakterien zu liefern. Das Protokoll kann verwendet werden, um viele Arten von membranassoziierten Molekülen für diese Mikroben zu untersuchen.

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Protokoll

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1. Allgemeine Reagenzien und Medienvorbereitung für die Membranextraktion

  1. Bakterielle Wachstumsmedien: Bereiten Sie 1 L Brühemedien in einem gründlich gereinigten und autoklavten 2 L Kolben vor und sterilisieren.
  2. Allgemeiner Reaufhängungspuffer (1 M Tris Puffer pH 7,5; 50 ml): 6,05 g Tris-Basis in 30 ml H2O auflösen. pH auf 7,5 mit 5 M HCl einstellen. Endvolumen auf 50 ml mit Reinst h2O einstellen.
  3. Master-Vorrat an divalenter Kationen-Chelationslösung (0,5 M EDTA pH 8; 100 ml): 18,6 g Dinatriumethylen-Tetraacetat hinzufügen 2H2bis 80 mlH2O. Kräftig umrühren und pH auf 8,0 mit NaOH einstellen. Endvolumen auf 100 ml mit Reinstem H2O einstellen.
    HINWEIS: Das Dinatriumsalz von EDTA löst sich erst auf, wenn der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von NaOH auf 8,0 0 00 00,0 eingestellt ist.
  4. Osmotischer Puffer A (0,5 M Saccharose, 10 mM Tris pH 7,5; 1 L): 171,15 g Saccharose wiegen und in einen 1 L-Zylinder überführen. 10 ml von 1 M Tris pH 7.5 hinzufügen. Auf ein Endvolumen von 1 L mit Ultrapure H2O einstellen. Bei 4 °C lagern.
  5. Lysozym (10 mg/ml; 5 ml): 50 mg (Hühnerei-weiß) Lysozym wiegen und in 5 ml ultrareinesH2O auflösen. Bei 4 °C lagern.
  6. Verdünnte divalente Kationen-Chelationslösung (1,5 mM EDTA; 500 ml): 1,5 ml 0,5 M EDTA (Schritt 1,3) bis 497,5 ml ultrareine H2O. bei 4 °C lagern.
  7. Osmotischer Puffer B (0,2 M Saccharose, 10 mM Tris pH 7,5; 2 L): 136,8 g Saccharose wiegen und auf einen 2 L-Zylinder übertragen. 20 ml von 1 M Tris pH 7.5 hinzufügen. Endvolumen auf 2 L mit Reinst h2O einstellen. Bei 4 °C lagern.
  8. Nuklease-Co-Faktor (1 M MgCl2; 10 ml): 2,03 g MgCl2-6H2O in 8 ml Reinst-H2O auflösen. Volumen auf 10 ml einstellen. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
  9. Nuklease-Lösungscocktail einschließlich RNase- und DNase-Enzyme: Siehe Tabelle der Materialien. Bei -20 °C lagern.
  10. Protease-Hemmer-Cocktail: Siehe Tabelle der Materialien. Bei 4 °C lagern.
  11. Isopycnic-Saccharose-Gradientenlösung mit geringer Dichte (20% w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Lösung; 100 ml): 20 g Saccharose wiegen und auf einen 200 ml Zylinder übertragen. Fügen Sie 100 l von 1 M Tris Buffer pH 7,5 und 200 l von 0,5 M EDTA pH 8 hinzu. Endvolumen auf 100 ml mit Reinst lageren H2O. bei Raumtemperatur einstellen.
  12. Isopycnic-Saccharose-Gradientenlösung mittlerer Dichte (53% w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 Lösung; 100 ml): 53 g Saccharose wiegen und auf einen 200 ml abgestuften Zylinder übertragen. Fügen Sie 100 l von 1 M Tris Buffer pH 7,5 und 200 l von 0,5 M EDTA pH 8 hinzu. Endvolumen auf 100 ml mit Reinst lageren H2O. bei Raumtemperatur einstellen.
    HINWEIS: Bereiten Sie diese Lösung in einem abgestuften Zylinder vor, um die Genauigkeit aufgrund des hohen Saccharoseanteils zu gewährleisten. Einen magnetischen Rührstab hinzufügen und rühren, bis die Saccharose vollständig in Lösung gelöst ist. Dieser Vorgang kann mehrere Stunden dauern.
  13. Hochdichte Isopycnic-Saccharose-Gradientenlösung (73% w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Lösung; 100 ml): Wiegen Sie 73 g Saccharose und übertragen Sie auf einen 200 ml abgestuften Zylinder. Fügen Sie 100 l von 1 M Tris Buffer pH 7,5 und 200 l von 0,5 M EDTA pH 8 hinzu. Endvolumen auf 100 ml mit Reinst lageren H2O. bei Raumtemperatur einstellen.
    HINWEIS: Bereiten Sie diese Lösung in einem abgestuften Zylinder vor, um die Genauigkeit aufgrund des hohen Saccharoseanteils zu gewährleisten. Einen magnetischen Rührstab hinzufügen und rühren, bis die Saccharose vollständig aufgelöst ist. Dieser Vorgang kann mehrere Stunden dauern.
  14. Isolierter Membran-Speicherpuffer (10 mM Tris Puffer pH 7,5; 1 L): 1 ml 1 M Tris Buffer pH 7,5 zu einem 1 L Kolben hinzufügen und das Endvolumen mit Ultrareinst H2O auf 1 L einstellen.
  15. Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) (10 mg/ml-Lösung): 10 mg NADH in2Reinst-H2 O aufheben. Wöchentlich frische Vorräte zubereiten. Bei -20 °C lagern.
  16. Phenollösung gleicht mit 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA: Siehe Materialtabelle. Bewahren Sie die Lösung bei 4 °C auf.
  17. Lipopolysaccharid Gel-Make-kit: Siehe Tabelle der Materialien.
  18. Bradford Reagenz: Siehe Tabelle der Materialien.
    HINWEIS: Alle Lösungen und Medien sollten innerhalb der Woche nach der Durchführung des Assays vorbereitet werden, um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten.

2. Vorbereitung von Bakterien für die Membranextraktion

  1. Die Bakterien aus gefrorenen Glyzerinbeständen auf frische Agarplatten aufbrechen. Lagern Sie die Platten bei 4 °C, sobald sich Kolonien entwickeln. Impfen Sie eine einzelne Kolonie in eine 5 ml Tube mit Brühe Medien gefüllt und Kultur der Bakterien wie gewünscht über Nacht.
  2. Verdünnen Sie die über Nacht bakterielle Kultur in 1 L bevorzugter Brühemedien und kultisieren Sie die Bakterien, bis die gewünschte optische Dichte erreicht ist.
    HINWEIS: Die Impfung einer einzelnen Bakterienkolonie in 1 L Brühemedien wird für mutierte Genotypen empfohlen, die anfällig für die Unterdrückung von Wachstumsphänotypen sind, aber einige Gram-negative Bakterien wachsen einfach langsamer als andere. Wenn es nicht möglich ist, eine ausreichende Kulturdichte durch Dieimpfung einer Einzigen Kolonie zu erreichen, ist die Verdünnung einer Übernachtkultur in 1 L Medien eine Strategie, um Wachstum zu synchronisieren. Die Zusammensetzung der Bakteriellen Membran variiert je nach Wachstumsphase der Kultur (logarithmische vs. stationäre Phase)13. Wachstumskurven, die die Veränderung der optischen Dichte für die Bakterienkulturen in Abhängigkeit von der Zeit messen, sollten mit allen Stämmen durchgeführt werden, um die Kulturdichte mit der Wachstumsphase zu korrelieren.
  3. Stellen Sie die Kolben mit den Brühekulturen auf Eis. Lesen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) und berechnen Sie das Kulturvolumen, das zwischen 6,0 und 8,0 x 1011 bakteriellen Koloniebildenden Einheiten (cfu) entspricht. Für S. Typhimurium entspricht 1 L Kultur bei einem OD600 von 0,6-0,8, da ein OD600 von 1.0 etwa 1,0x109 cfu/ml entspricht. Fügen Sie dieses Volumen zu einem Zentrifugenrohr hinzu und stellen Sie sicher, dass die verbleibenden Kulturen auf Eis bleiben, bis sie verwendet werden.
  4. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 4 °C bei 7.000-10.000 x g in einem festen Winkel Hochgeschwindigkeitszentrifuge für 10 min.
    HINWEIS: Vorkühlen und halten Sie die Zentrifugen bei niedriger Temperatur. Bewahren Sie die Proben während des gesamten Verfahrens auf Eis auf.
  5. Dekantieren und entsorgen Sie den Überstand sorgfältig.
    HINWEIS: Das Pellet kann bei -80 °C blitzgefroren und/oder gelagert werden, wenn die Membranfraktionen nicht sofort extrahiert werden. Es wird jedoch empfohlen, direkt mit der Plasmolyse am selben Tag fortzufahren, an dem die Zellen geerntet werden, und wird besonders für nicht-enterobakterielle Arten empfohlen.

3. Dissoziation der Äußeren Membran und Plasmolyse

  1. Die Zellpellets auf Eis auftauen, wenn sie zuvor bei -80 °C gelagert wurden, und die Proben für den Rest des Verfahrens auf Eis behalten. Setzen Sie jedes Zellpellet innerhalb des Zentrifugenrohrs in 12,5 ml Puffer A wieder auf. Fügen Sie der Zellsuspension einen magnetischen Rührbalken hinzu.
  2. Fügen Sie jeder Zellresuspension 180 l von 10 mg/ml Lysozym (Endkonzentration von 144 g/ml) hinzu. Halten Sie die Proben auf Eis unter Rühren für 2 min.
  3. Fügen Sie 12,5 ml 1,5 ml EDTA-Lösung zu jeder Zellresuspension hinzu und rühren Sie auf Deme für weitere 7 min weiter.
  4. Decant die Suspension in ein 50 ml konisches Rohr und Zentrifuge bei 9.000-11.000 x g für 10 min bei 4 °C.
  5. Überstoffe in einen Biorisiko-Abfallbehälter entsorgen und die Pellets auf Eis behalten.
  6. Fügen Sie dem Zellpellet 25 ml Puffer B hinzu.
  7. Fügen Sie 55 l von 1 M MgCl2, 1 L RNase/DNase Nuklease-Reagenz hinzu (um Viskositätsprobleme im Zusammenhang mit Bakterien, die vor der Homogenisierung einer Plasmolyse unterzogen werden), und 1 l Proteasehemmer-Cocktail auf das Volumen des Puffers B, der auf dem Zellpellet sitzt, zu vermeiden.
  8. Das Pellet in der Puffer-B-Mischung wieder aussetzen. Kräftig Pipetten und Wirbel bis zur Beobachtung einer homogenen Lösung.
    HINWEIS: Es ist sehr wichtig, eine homogene Lösung zu haben, bevor Sie mit Schritt 4 dieses Protokolls fortfahren. Die resuspendierten Zellen sollten ein zähflüssiges Kuchen-Teig wie Aussehen und Konsistenz haben.
  9. Wirbel jede Probe für 15 s. Halten Sie Suspensionen auf Eis und fahren Sie mit Schritt 4.

4. Druck homogenisierung und Lyse

HINWEIS: Für die Lyse können mehrere Methoden verwendet werden. Beschallung ist nicht ideal aufgrund der Erzeugung von Wärme. Osmotische Lyse kann erreicht werden, ist aber oft ineffizient. Daher empfehlen wir eine Hochdrucklyse. Mit einer Vielzahl von Instrumenten kann eine Hochdrucklyse erreicht werden. Wir schlagen Homogenisierungsmaschinen wie die französische Presse oder die Emusliflex vor. Wir arbeiten mit vielen Arten von Gram-negativen Bakterien, deren Reaktion auf hochosmolare Saccharose-Lösungen variiert. Der Hochdruckhomogenisierungsschritt verbessert Effizienz, Reproduzierbarkeit und Ausbeute.

  1. Prechill die Französische Presszelle bei 4 °C oder legen Sie die Metallspule aus der Homogenisatormaschine auf Eis.
  2. Gießen Sie die Probe in die französische Druckzelle oder den Homogenisator-Probenzylinder und bringen Sie die Zelle unter den gewünschten Homogenisierungsdruck (10.000 psi sollte bei Verwendung einer französischen Presse oder 20.000 psi bei Verwendung eines Homogenisators ausreichen).
  3. Stellen Sie den Auslassstrom auf etwa einen Tropfen pro Sekunde ein, während Sie den Druck bei Verwendung einer französischen Presse beibehalten.
  4. Sammeln Sie die Zelle lysieren in 50 ml konische Röhren, während Proben auf Eis zu halten.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 drei- bis fünfmal, um eine vollständige Lyse zu erreichen, die typischerweise durch eine allmähliche Erhöhung der Transparenz der Probe angezeigt wird.
    HINWEIS: Die Probenkammer sollte mit Puffer B zwischen den Proben gewaschen und ausgeglichen werden.
  6. Lysed Zellen auf Eis halten.

5. Gesamte Membranfraktionierung

  1. Zentrifugieren Sie die lysierten Bakterienproben bei 6.169 x g für 10 min bei 4 °C, um das verbleibende intakte Zellmaterial zu pelleten. (z. B. unlysierte Bakterienzellen).
  2. Verteilen Sie den restlichen Teil des Überstandes, der nun die homogenisierten Membranen enthält, in eine Polycarbonatflasche zur Ultrazentrifugation.
    ACHTUNG: Bei Bedarf können Zellproben durch Verdünnung mit Puffer B ausgeglichen werden.
  3. Ultrazentrifugieren Sie die Zelle bei 184.500 x g für mindestens 1 h, bei 4 °C. Dieser Schritt kann über Nacht durchgeführt werden, ohne die Qualität der Membranen zu beeinträchtigen.
  4. Restüberstand im Ultrazentrifugenrohr entsorgen und Membranpellets auf Eis behalten (Abbildung 1).
  5. Setzen Sie die Membranpellets in 1 ml der isopycnic-sucrose Gradientenlösung mit geringer Dichte mit einem Glas-Dounce-Homogenisator aus. Verwenden Sie eine glasierte Pasteurpipette, um das Probenhomogenat in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr zu übertragen und auf Eis zu behalten.
    HINWEIS: Wenn nur eine Gesamtmembranzusammensetzungsanalyse gewünscht wird, ersetzen Sie 1 ml isopycnic-sucrose Gradientenlösung mit geringer Dichte für 1 ml isolierten Membranspeicherpuffer. Schritt 5.5 ist der Endpunkt der Isolation, wenn nur gesamtbakterielle Membranproben gewünscht werden. Proben bei -20 °C lagern, bis weitere nachgelagerte Analysen erforderlich sind.

6. Dichtegradient Ultrazentrifugation zur Trennung der DualMembranen

  1. Sammeln Sie die entsprechende Anzahl von 13 ml Polypropylen oder ultraklaren offenen Rohren, die für einen schwingenden Schaufelrotor und eine Ultrazentrifuge angegeben sind.
  2. Halten Sie das Rohr in einer leicht geneigten Position und bereiten Sie den Saccharosegradienten vor, indem Sie langsam Saccharoselösungen von höherer Dichte zu niedrigerer Dichte in der folgenden Reihenfolge hinzufügen:
    2 ml von 73% w/v Saccharose,1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    4 ml mit 53% w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    1. Als Nächstes fügen Sie die gesamte Membranfraktion (1 ml) hinzu, die in der 20% w/v Saccharoselösung (Schritt 5.5) resuspendiert wurde. Vermeiden Sie das Mischen der Membranfraktion mit der Saccharoselösung, die darunter liegt. Divisionen sollten zwischen jeder dieser Ebenen sichtbar sein.
    2. Schließlich füllen Sie das Rohr mit der Low-Density-Isopycnic-Sucrose-Gradientenlösung (ca. 6 ml). Polypropylen- und ultraklare Offene Rohre sollten so voll wie möglich (2 oder 3 mm von der Rohroberseite) für den Rohrträger gefüllt werden.
  3. Anpassung für Acinetobacter baumannii 17978
    1. Passen Sie einen angepassten Saccharosegradienten für die Verwendung mit verschiedenen Bakterienproben an. Für A. baumanniiermöglicht der folgende Saccharosegradient eine vollständigere Trennung der Membranen (Abbildung 2).
      2 ml 73% w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
      4 ml 45% w/v Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    2. Als Nächstes fügen Sie die gesamte Membranfraktion (1 ml) hinzu, die in der 20% w/v Saccharoselösung (Schritt 5.5) resuspendiert wurde. Vermeiden Sie das Mischen der Membranfraktion mit der Saccharoselösung, die darunter liegt. Divisionen sollten zwischen jeder dieser Ebenen sichtbar sein.
    3. Schließlich füllen Sie das Rohr mit low-density isopycnic-sucrose Gradientlösung (ca. 6 ml). Polypropylen- und ultraklare Offene Rohre sollten so voll wie möglich (2 oder 3 mm von der Rohroberseite) für den Rohrträger gefüllt werden.
  4. Ultrazentrifugieren Sie die Proben mit einem Schwingen-Schaufelrotor bei 288.000 x g und 4 °C über Nacht.
    HINWEIS: Für die in den vorherigen Schritten verwendeten Volumina empfehlen wir Zentrifugationszeiten zwischen 16 h und 23 h.
  5. Schneiden Sie das Ende einer P1000 Pipettenspitze ca. 5 mm vom Punkt aus. Entfernen Sie die oberbraune IM-Schicht mit der Pipette. Übertragen Sie die IM-Fraktion zur Ultrazentrifugation in eine Polycarbonatflasche.
  6. Lassen Sie ca. 2 ml der Saccharoselösung über der 53-73% Schnittstelle, um sicherzustellen, dass das untere weiße OM nicht mit der IM-Fraktion verunreinigt ist. Wiederholen Sie den Pipettiervorgang aus Schritt 6.4 für den OM-Fraktion (Abbildung 1).
    HINWEIS: Die Membranen können auch gesammelt werden, indem die Zentrifugenrohre am Boden mit einer Nadel punktiert und die Membranen als Tropfen tropfenweise gesammelt werden.
  7. Füllen Sie die restliche Leere des Ultrazentrifugenrohres mit einem isolierten Membranspeicherpuffer und mischen Sie sie durch Inversion oder Pipettierung. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.
  8. Sammeln Sie die jetzt gewaschenen und isolierten Membranen durch Ultrazentrifugation bei 184.500 x g für 1 h und 4 °C.
  9. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Membranen durch Dounce-Homogenisierung wieder auf. Fügen Sie 500-1000 L Speicherpuffer hinzu. Sammeln Sie Proben in 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  10. Bewahren Sie die bakteriellen Membranproben bei -20 °C auf.

7. Bestätigung der Trennung der Bilayer

HINWEIS: Eine unvollständige Trennung der Doppelschichten kann aufgrund eines technischen Fehlers oder der einzigartigen Zellhüllenzusammensetzung einiger Arten auftreten. Um die Trennung zu bestätigen, empfehlen wir die Verwendung von zwei unabhängigen Assays, um den Grad der Kreuzkontamination zwischen den Bilayern zu quantifizieren. Der erste Test erkennt die enzymatische Aktivität der NADH-Dehydrogenase, die ausschließlich im IM existiert. Der zweite Test erkennt das Vorhandensein von LOS oder LPS, das überwiegend im OM existiert.

  1. Bestätigen, dass die Organisationsortvon iMs von den IMs isoliert sind
    1. Messen Sie die Proteinkonzentration in jeder isolierten Membranfraktion mit einem Bradford-Protein-Assay.
    2. Fügen Sie das Probenvolumen, das zwischen 50 und 500 g Protein entspricht, zu einem leeren 2 ml Mikrozentrifugenrohr hinzu. Die Konzentration variiert je nach Art, aber 50 g sind in der Regel ausreichend für Enterobacteriaceae. Fügen Sie das entsprechende Volumen von 10 mM Tris-Puffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 990 L zu erreichen. Übertragen Sie den Inhalt auf eine Küvette für Spektrophotometrie.
    3. Fügen Sie der Probe 10 l einer 10 mg/ml-Lösung von NADH hinzu und messen Sie die Anfängliche Absorption bei 340 nm.
    4. Messen Sie die Absorption alle 30 s für 5 min.
    5. Kompilieren Sie die Daten und zeichnen Sie die Änderung der Absorption (y-Achse) im Vergleich zur Zeitänderung (x-Achse) für jeden Membranbruch (Abbildung 3).
  2. Bestätigen, dass die IMs von den Organisationsoms isoliert sind
    1. Fügen Sie das Probenvolumen, das zwischen 50 und 500 g Protein entspricht, zu einem leeren 2 ml Mikrozentrifugenrohr hinzu. Die Konzentration variiert je nach Bakterienart, aber 50 g sind in der Regel ausreichend für Enterobacteriaceae. Füllen Sie auf ein Endvolumen von 100 l mit Phosphat gepufferter Saline, die im Folgenden als wässrige Phase bezeichnet wird.
    2. Fügen Sie der wässrigen Phase 5 l Proteinase K (Lager 800 U/ml) hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei 59 °C.
    3. 10 ml Aliquot von Tris-gesättigtem Phenol 10 min bei 68 °C erwärmen.
    4. Drehen Sie die wässrigen Phasenproben, die mit der Proteinase K behandelt wurden, und fügen Sie das "heiße" Tris-gesättigte Phenol im Verhältnis 1:1 mit der wässrigen Phase hinzu, wirbeln Sie kräftig und brüten bei 68 °C für 10 min.
    5. Die nun milchig-weißen Proben von 68 °C in ein Eiswasserbad geben und 10 min inkubieren.
    6. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.100 x g für 10 min bei 4 °C.
    7. Die obere wässrige Phase in ein neues Rohr geben und das Rohr bei -20 °C lagern, wenn die Probe nicht sofort verwendet werden soll.
    8. Proben im SDS-Ladepuffer verdünnen und die Brunnen eines 4-20% Tris-Glycin-Gradientengels beladen.
    9. Elektrophorese für 45 min oder bis sich die Farbstofffront an der Unterseite des Gels befindet.
    10. Färben Sie das Gel mit dem LPS-Färbeset nach den Anweisungen des Herstellers.

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Ergebnisse

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Diese Technik bietet ein wirksames Mittel, um die IMs und OMs für Gram-negative Bakterien zu isolieren. Ein Überblick über das gesamte Verfahren ist dargestellt (Abbildung 1). Im Allgemeinen stellt die Normalisierung der Kulturen auf eine OD600 von 0,6-0,8 in 1 L Medien oder die Ernte zwischen 6,0 und 8,0 x 1011 Bakterienzellen sicher, dass die entsprechende Menge an Membranmaterial für die nachfolgende Trennung gesammelt wird.

Beim Lysing de...

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Diskussion

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Diese Methode wird den Forschern weiterhin dabei helfen, die Rolle der Zellhülle in der bakteriellen Physiologie und Pathogenese zu verstehen. Nach den sequenziellen Ultrazentrifugationsschritten kann eine gereinigte Gesamt-, Innen- und OM-Fraktion erhalten werden. Diese Membranen können isoliert untersucht werden, um Hypothesen im Zusammenhang mit der Lokalisierung und Funktion des Membranproteins, dem Transport und dem Handel über das Periplasma und die Zusammensetzung der einzelnen Doppelschichten unter verschiedenen ...

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von P20GM10344 und R01AI139248 an Z. D. Dalebroux vergeben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 L Zentrifugenflaschen, PC/PPCO, super Speed, mit Verschlusskappe, NalgeneVWR525-0466
1 L Pyrex Medienvorratsflasche mit HochtemperaturverschlussVWR10416-312
2.000 mL Erlenmeyerkolben, EnghalsVWR10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 wellBIORAD4561095
4x Laemmli Probe Puffer 10 mLBIORAD1610747
50 mL sterile Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenVWR89049-174
7 mL Dounce Gewebehomogenisator mit zwei GlasstößelnVWR71000-518
70 mL Polycarbonat-FlaschenbaugruppeBeckman Coulter Life Sciences355622
Agar PulverVWRA10752
B10P Tischgerät pH-Messgerät mit pH-SondeVWR89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (Bankversion)ThermoFisher Scientific50136146
Benzonase-NukleaseMilliporeSigma70746-3
EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat 99,0-101,0%, Kristalle, hochreines Bioreagenz Molekularbiologische Qualität, J.T. BakerVWR4040-01
EmulsiFlex-C3Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy FestwinkelrotorThermoFisher Scientific75006526
Salzsäure 6,0 NVWRBDH7204
IBI Scientific Orbital-PlattformschüttlerFischer Scientific15-453-211
LB Bouillon MillerVWR214906
Lysozym, Eiweiß, Ultra Pure GradeVWRVWRV0063
Magnesiumchlorid-HexahydratSigma AldrichM2670
NADHSigma Aldrich10107735001
Optima XPN-80 - IVDBeckman Coulter Life SciencesA99839
Pharmco Produkte  REINER ALKOHOL 200 PROOF GL 4/CS Fischer ScientificNC1624582
Phenollösung, äquilibriert mit 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, BioReagenz, für die MolekularbiologieSigma - MilliporeP4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay KitThermofisher23238
Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharid Gel Stain KitThermofisherP20495
Proteacease -50, EDTA freiG Biosciences786-334
Proteinase K, Molekularbiologie GradeNew England BiolabsP8107S
Natriumhydroxid ≥ 99.99%VWRAA45780-22
Sorval RC 6 Plus ZentrifugeThermoFisher Scientific36-101-0816
SaccharoseMilliporeSigmaSX1075-3
SW 41 Ti SchwingschaufelrotorBeckman Coulter Life Sciences331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS, Trometamol) ≥ 99,9 % (getrocknete Basis), hochreines Bioreagenz Molekularbiologische Qualität, J.T. BakerVWRJT4109-6
Typ 45 Ti Titanrotor mit festem WinkelBeckman Coulter Life Sciences339160
Ultraklares Rohr, 14 x 89 mmBeckman Coulter Life Sciences344059
Vortex-Genie 2VWR102091-234

Referenzen

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  10. Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
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  16. Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
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Schlagwörter

Gram negative BacteriaInner MembraneOuter MembraneSucrose Density GradientMembrane FractionationUltracentrifugationAcinetobacter baumanniiLipooligosaccharidesNADH Dehydrogenase AssayMembrane Purity

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