Bewertung von T Follicular Helper Cells und Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

In den letzten zehn Jahren konzentrierten sich zahlreiche Studien auf die neu identifizierte CD4⁺ T-Zell-Untermenge, Tfh-Zell-Submenge, für ihre wesentliche Rolle in der Entwicklung des Keimzentrums (GC) B. B-Zell-Lymphom 6 (Bcl6), das hauptsächlich als Genrepressor betrachtet wird, ist der Liniendefinierende Faktor von Tfh-Zellen für den Beweis, dass die ektopische Expression von Bcl6 ausreicht, um die Tfh-Differenzierung anzutreiben, während ein Mangel an Bcl6 zu einer verschwundenen Tfh-Differenzierung^1,2,3führt. Im Gegensatz zu anderen CD4⁺ T-Helfer-Untergruppen, die ihre Effektorfunktion durch Migration zu den Entzündungsstellen ausführen, bieten Tfh-Zellen die B-Zellhilfe hauptsächlich in der B-Zell-Follikelzone von Milz und Lymphknoten. Die kostimulierenden Moleküle ICOS und CD40L spielen eine wichtige Rolle in der Interaktion zwischen Tfh- und GC-B-Zellen. Während der Tfh-Differenzierung überträgt ICOS notwendige Signale von kognaaten B-Zellen und fungiert auch als Rezeptor, der Migrationssignale von Bystander-B-Zellen für die B-Zellzonenlokalisierung^4,5empfängt. CD40L ist ein Mediator von Signalen von Tfh-Zellen für B-Zellen Proliferation und Überleben⁶. Ein weiterer Faktor, der die ähnliche Rolle wie CD40L spielt, ist das Zytokin IL21, das hauptsächlich von Tfh-Zellen abgesondert wird. IL21 reguliert direkt die Entwicklung und Produktion von Gc B-Zellen entwicklung und Produktion von hochaffinen Antikörpern, aber seine Rolle bei der Tfh-Differenzierung ist immer noch umstritten^7,8. PD-1 und CXCR5, die heute am häufigsten bei der Identifizierung von Tfh-Zellen in der Durchflusszytometrie-Analyse verwendet werden, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Differenzierung und Funktion dieser Teilmenge. CXCR5 ist der Rezeptor für B-Zell-Follikuläres Chemokin und vermittelt die Lokalisierung von Tfh-Zellen in B-Zellfollikel⁹. PD-1 ist nun nicht nur identifiziert, um die follikuläre Führungsfunktion zu haben, sondern auch kritische Signale im Prozess der GC B-Zellen Affinitätsreifung¹⁰zu übertragen. Basierend auf diesen Erkenntnissen könnte die Bewertung der Expression dieser Moleküle im Wesentlichen die Reifung und Funktion von Tfh-Zellen widerspiegeln.

GC ist eine induzierte transiente mikroanatomische Struktur in sekundären Lymphorganen und stark von Tfh-Zellen abhängig, was eine perfekte Auslesung zur Bewertung der Tfh-Antwort ist. In GC unterliegen B-Zellen nach dem Empfang von Signalen, die durch Zytokine und kostimulierende Moleküle vermittelt werden, Klassenumschaltungen und somatischer Hypermutation, um hochaffine Antikörper zu erzeugen¹¹. Differential-Antikörper-Klassen-Switching tritt in Differential-Zytokin-Nische, in der IL4 und IL21 induzieren IgG1-Klasse Schalten, während IFN induziert IgG2-Klasse Switching¹². Plasmazellen sind die Produzenten von abgesonderten Antikörpern und endlos differenzierte Zellen. Wie Tfh-Zellen ist die Entwicklung von B-Zellen in GC mit der dynamischen Expression vieler signifikanter Moleküle verbunden. Basierend auf der aktuellen Studie können GC B-Zellen als B220⁺PNA⁺Fas⁺ oder B220⁺GL7⁺Fas⁺ Zellen und Plasmazellen identifiziert werden, im Vergleich zu ihren Vorläufern, Downregulate Expression von B220 und upregulate CD138 Expression¹³. Darüber hinaus können beide Eigenschaften in der Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzanalyse nachgewiesen werden, was eine angemessene Bewertung der GC-Reaktion ist.

Robuste zelluläre und humorale Reaktionen werden bei Influenza-Virus-Infektionen induziert, wobei Tfh- und Th1-Zellen die CD4⁺ T-Zellreaktion¹⁴dominieren, was sie zu einem perfekten Modell für die Tfh-Zelldifferenzierungsstudie macht. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), ein häufig verwendeter mausangepasster Stamm, wird häufig in dieser Studie verwendet^14,15,16. Hier beschreiben wir einige grundlegende Protokolle des Tfh-Studien-relevanten Assays bei Influenza-Virusinfektionen: 1) intranasale Impfung des PR8-Virus; 2) antigenspezifische Tfh-Zellen, GC B- und Plasmazellen und IL21-Nachweis mit Durchflusszytometrie; 3) histologische Visualisierung von GC; 4) Nachweis von antigenspezifischem Antikörpertiter im Serum mit ELISA. Diese Protokolle liefern die notwendigen Techniken für neue Forscher in Tfh-assoziierten Studien.

Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Institut Pasteur of Shanghai, China, genehmigt. Alle Experimente wurden auf der Grundlage der vom Institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss genehmigten Tierprotokolle durchgeführt.

HINWEIS: Virusinfektion von Mäusen und Isolierung von Organen sollten unter ABSL2 Zustand durchgeführt werden.

1. Impfung des PR8-Influenzavirus und Aufzeichnung des Mäusegewichts

1. Bereiten Sie 8 Wochen alte männliche C57BL/6 Mäuse auf eine Infektion im ABSL2-Raum vor.
   HINWEIS: Dieses Protokoll eignet sich auch für Experimente mit weiblichen Mäusen.
2. Verdünnung des PR8-Virus:Entfernen Sie das Virus aus dem -80 °C Gefrierschrank und inkubieren Sie auf Eis, bis es in Flüssigkeit schmilzt. Vortex das Stammvirus gründlich und verdünnen Sie das Virus auf 2 PFU / L mit steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄) in einem vorgekühlten 1,5 ml Rohr.
3. Mäuseanästhesisierung: Wiegen Sie jede Maus und berechnen Sie das Volumen (4-fach (l) das Mausgewicht (g)) von Natriumpentobarbital (2 mg/ml) zu verwenden. Injizieren Sie das berechnete Volumen von Natriumpentobarbital intraperitoneally.
   HINWEIS: Dieser Schritt soll Mäuse stetig und friedlich atmen lassen, so dass der genaue Titer des Virus intranasal geimpft werden kann. Zu schnelle oder langsame Herzschläge deuten auf eine unangemessene Anästhesisierung hin. Darüber hinaus wird die Verwendung von Tierarztsalbe empfohlen, um Augentrockenheit zu vermeiden.
4. Intranasale Inokulation: Wirbel das verdünnte PR8-Virus gründlich. Pipetten Sie 10 l und führen Sie sorgfältig intranasale Impfung auf einer Seite Tropfen für Tropfen. Nach Beendigung der Impfung aller Mäuse in einem Käfig (maximal 5 Mäuse) auf dieser Seite, wiederholen Sie die Impfung auf der anderen Seite (halten Sie die Atmung der Maus friedlich und stetig durch die Gesamteinimpfung). Jede Maus ist mit 40 PFU PR8 Virus insgesamt infiziert.
5. Legen Sie die Mäuse in sternal recumbency in warmen Käfigen für eine bessere Wiederbelebung.
6. Überwachen Sie das Mausgewicht täglich für 10 Tage. (Der Infektionstag wird als Tag 0 aufgezeichnet).

2. Isolierung von Lymphozyten aus Milz und mediastinalem Lymphknoten (mLN)

1. Maus-Euthanasie: Legen Sie die Mäuse in eine kleine Kammer und einschläfern Sie die Mäuse, indem Sie CO 2 friedlich von der Unterseite der Kammer in CO₂ pumpen. Nehmen Sie Mäuse heraus, wenn sie sich nicht bewegen, und führen Sie zervikale Dislokationen durch, um sicherzustellen, dass Mäuse vollständig sterben. Tauchen Sie die Mäuse mit 75% Ethanol und übertragen Sie auf die Biosicherheitshaube.
2. Immobilisieren Sie die Mäuse mit Seziernadeln auf die saugfähige, mit Papier bedeckte Sezierschaumplatte. Schneiden Sie die Haut entlang der Bauchmittellinie und der Hinterbeine mit einer Sezierschere und dehnen Sie die Haut mit einer Pinzette. Immobilisieren Sie die gestreckte Haut mit Seziernadeln.
3. Bereiten Sie zwei 6 cm Gerichte für jede Maus vor und halten Sie sie auf dem Eis. Legen Sie in jede Schale ein 70-m-Zellsieb und fügen Sie 5 ml DMEM hinzu, ergänzt mit 1% fetalem Rinderserum (DMEM (1% FBS))
4. Milz-Isolierung: Schneiden Sie das Peritoneum, um die Bauchhöhle mit einer Sezierschere zu belichten. Nehmen Sie die Milz und legen Sie sie in die vorbereitete Schale.
5. mLN-Isolierung: Das Zwerchfell und den Boden der Käfigrippe in die Nähe von Thymus schneiden. Ziehen Sie die Rippe zur Seite und heften Sie sie mit Seziernadeln, um die Brusthöhle freizulegen. Ziehen Sie die Lunge zur rechten Seite und verwenden Sie eine Pinzette, um mLN zu nehmen, unter dem Herzen und in der Nähe der ventralen Seite der Luftröhre.
6. Legen Sie die mLN in das vorbereitete Gericht.
7. Erhalten Sie die einzelzelligen Suspensionen: Mischen Sie die Milz oder mLN vorsichtig mit einem Kolben von 3 ml Spritze durch das 70-m-Zellsieb. Spülen Sie das Zellsieb mit 1 ml frischem DMEM (1% FBS). Setzen Sie die Zellsuspension wieder auf und übertragen Sie sie in ein 15 ml Zentrifugenrohr.
8. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 350 x g für 6 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml DMEM (1% FBS) hinzu.
9. Das Zellpellet mit 1 ml-Pipette gründlich aufsetzen. Fügen Sie 4 ml DMEM (1% FBS) in Milzzellensuspensionen ein und halten Sie sie für die folgenden Operationen auf Eis.
   HINWEIS: Es ist notwendig, das Zellpellet mit 1 ml Medium zuerst, nicht 5 ml, für die vollständige Isolierung einzelner Zellen von Pellet wieder aufzuhängen.
   Ab diesem Schritt können alle Vorgänge im regulären Labor ausgeführt werden.
10. Milzzellzählung
    1. Resuspend Zellen durch Drehen der Rohre nach oben und unten für mehrere Male. Nehmen Sie 10 l in 90 l rote Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 155mM NH₄Cl). Bei Raumtemperatur (RT) 3 min inkubieren und 900 l kalte SPBS hinzufügen, um die Reaktion zu beenden.
    2. Zentrifuge bei 400 x g für 6 min bei 4 °C und Überstand entfernen. Resuspend mit 100 l kaltem PBS. Nehmen Sie 10 l Zellen in 10 l von 0,4% w/v Trypan blau und nehmen Sie 10 l aus der Mischung für die Zellzählung mit dem Hämozytometer.
    3. Berechnung: Berechnen Sie Zellen als reguläre Methode. Kurz gesagt, zählen Sie Die Zellennummern in zwei diagonalen Eckquadraten auf dem Hämozytometer und erhalten Sie N1, N2 für jedes Eckquadrat. Die Zellkonzentration der 5-ml-Zellsuspension sollte als (N1+N2)/2 x 10⁴ /ml berechnet werden.

3. Immunostainierung von polyklonalen Tfh-Zellen mit PD-1 und CXCR5

1. Färbung mit Biotin-Anti-CXCR5 Antikörper.
   1. Setzen Sie die Zellsuspensionen wieder auf, indem Sie das Rohr nach oben und unten drehen. Nehmen Sie 2 x 10⁶ Zellen in das FACS-Rohr und fügen Sie 2 ml Färbepuffer (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)) hinzu. Waschen Sie durch Wirbel auf dem Wirbel-Oszillationsgerät.
   2. Zentrifuge bei 350 x g für 6 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Flüssigkeit ausgießen und den Rohrmund zweimal auf das saugfähige Papier tauchen.
   3. Lösen Sie das Zellpellet mit der Rückstandsflüssigkeit, indem Sie auf den Boden des Rohres tippen. Legen Sie das Rohr in den Rohrhalter auf Eis.
      ANMERKUNG: Das Volumen der Rückstandsflüssigkeit beträgt ca. 25 l.
   4. Fügen Sie für jede Röhre 0,2 l Anti-Maus-CD16/CD32 (Fc-Rezeptor-Blocker) hinzu. Wirbel durch sanftes Antippen des Rohrbodens und Inkubieren auf Eis für 10 min.
      HINWEIS: Bereiten Sie Antikörpermischungfür mehrere Proben durch Verdünnung mit 5 l Färbungspuffer für jedes Rohr vor. Das Rezept für die Mischung sollte durch Verdünnung (n/10+1) x 0,2 l Fc-Rezeptor-Blocker in (n/10+1) x 5 l Färbungspuffer hergestellt werden und 5,2 l Mischung in jedes Rohr hinzufügen.
   5. Fügen Sie 0,3 l Biotin-Anti-Maus CXCR5 in den Rückstand 30 l Färbungspuffer für jedes Rohr und Wirbel, indem Sie auf den Rohrboden tippen.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Mischung wie in Schritt 3.1.4 beschrieben vor.
   6. Auf Eis für 1 h mit sanft enstillenden Zellen durch Antippen der Röhre bei 30 min inkubieren.
      HINWEIS: Vortex bei 30 min ist Zellaggregate für eine bessere Färbung zu vermeiden.
   7. Fügen Sie 2 ml Färbepuffer und Wirbel auf dem Wirbel-Oszillationsgerät hinzu. Zentrifuge bei 350 x g für 6 min bei 4 °C und den Überstand wie in Schritt 3.1.2 beschrieben entsorgen. Wirbel durch Anzapfen der Röhre und inkubieren auf Eis für die nachfolgende Färbung.
2. Färbung mit anderen Oberflächenmarkern.
   1. Herstellung von Antikörpergemisch (Tabelle 1) wie in Schritt 3.1.4 beschrieben.
   2. Fügen Sie antikörper-mischung in jedes Rohr. Wirbel durch Anzapfen des Rohrbodens und Inkubieren auf Eis für 30 min.
   3. Waschen Sie Zellen mit 2 ml Färbepuffer. Zentrifuge bei 350 x g für 6 min bei 4 °C.
   4. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 400 L Färbepuffer hinzu. Wirbeln Sie die Röhre auf dem Wirbel-Oszillationsgerät und halten Sie die Röhre in dunkel bis Fluss Zytometrie-Analyse.

4. Immunostainierung des PR8-Influenzavirus NP-spezifische Tfh-Zellen

HINWEIS: Dieses Protokoll der Färbung von NP-spezifischen Tfh-Zellen stammt aus früheren Studien^15,17.

1. Führen Sie Biotin-CXCR5-Färbung wie in Schritt 3.1 beschrieben durch, mit der Ausnahme, dass die für die Färbung entnommene Zellnummer 3 x 10⁶ beträgt, damit genügend antigenspezifische Zellen in der Durchflusszytometrie aufgezeichnet werden können.
2. Fügen Sie 0,3 l APC-konjugiert-IAbNP311-325 MHC-Klasse II (NP_311-325) Tetramer in das Rohr von 3.1.7. Mischung für mehrere Proben wie in Schritt 3.1.4 vorbereiten
   HINWEIS: Es ist wichtig, Tetramer vor der Zugabe von Anti-CD4-Antikörpern zu färben, da die Bindung zwischen CD4 und Anti-CD4-Antikörper die optimale Tetramerfärbung stören würde.
3. Setzen Sie die Zellmischung wieder auf, indem Sie vorsichtig auf das Rohr tippen und bei RT 30 min im Dunkeln brüten.
   ANMERKUNG: Bedecken Sie ein nasses Papier auf dem Rohrmund, um die Verdunstung zu verringern
4. Fügen Sie die Mischung aus anderen Oberflächenmarkern hinzu (Tabelle 1) und setzen Sie die Inkubation bei RT für 30 min fort.
5. Zellen waschen und resuspendieren, wie in den Schritten 3.2.3 und 3.2.4 beschrieben.

5. Immunostainierung von Bcl6 in polyklonalen Tfh-Zellen

1. Führen Sie Oberflächenmarkierungen (Tabelle 2) Färbung wie in Abschnitt 3 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die letzte Wäsche mit 2 ml PBS anstelle von Färbepuffer.
2. Zentrifuge bei 350 x g für 6 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie Zellpellets wieder auf, indem Sie vorsichtig auf den Rohrboden tippen.
3. Zur Zellfixierung 300 l 3,7 % Formaldehydlösung (verdünnt von 37% Formaldehyd mit PBS) in das Rohr geben. Wirbel auf dem Wirbel-Oszillationsgerät und inkubieren bei RT für 20 min.
4. 2 ml Färbepuffer für Waschen und Zentrifugen bei 500 x g für 6 min bei 4 °C hinzufügen. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen wieder auf, indem Sie sanft auf das Rohr tippen.
5. Fügen Sie 300 l von 0,2% Triton-X 100 hinzu und suspendieren Sie Zellen durch Wirbel auf dem Wirbel-Oszillationsgerät. 15 min bei RT inkubieren.
6. Fügen Sie 2 ml Färbung Puffer zum Waschen. Zentrifuge bei 500 x g für 6 min bei 4 °C. Verwerfen Sie Überstand und suspendieren Sie Zellen, indem Sie sanft auf den Rohrboden tippen.
7. Fügen Sie für jedes Rohr 1,5 l PE-Anti-Bcl6-Antikörper hinzu. Tippen Sie vorsichtig auf den Rohrboden, um die Mischung wieder aufzuhängen und bei RT für 2 h zu brüten, wobei das Rohr alle 30 min sanft angezapft wird.
   HINWEIS: Bedecken Sie ein nasses Papier auf dem Rohrmund, um die Verdunstung von Mischungen zu verringern.
8. Fügen Sie 2 ml PBS, ergänzt mit 0,01% Triton-X 100, in die Röhre. Vortex und Zentrifuge bei 500 x g für 6 min bei 4 °C.
9. Waschen Sie als Schritt 5.8. Resuspend Zellen mit 400 l Färbepuffer. Halten Sie die Zellen auf Demeis dunkel, bis die Durchflusszytometrieanalyse durchgeführt wird.

6. Intrazelluläre Färbung von IL21

1. Stimulieren Sie Zellen mit PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetat) und Ionomycin.
   1. Nehmen Sie 2 x 10⁶ Zellen aus Milzzellsuspension und Zentrifuge bei 350 x g für 6 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit 500 l komplettem T-Zellmedium wieder auf. Übertragen Sie die Zellen in die 24-Well-Platte.
   2. Fügen Sie 20 nmol PMA und 2 Mol Ionomycin in 500 l des kompletten Mediums¹⁸ und mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten.
   3. Fügen Sie die in Schritt 6.2 zubereitete Lösung in die Zellsuspension in der 24-Well-Platte ein und mischen Sie sie durch Schütteln der Platte. Richten Sie die unstimulierte Steuerung ein, indem Sie den Zellen 500 l komplettes T-Zellmedium ohne Zugabe von PMA und Ionomycin hinzufügen. Inkubieren Sie in einem CO2-Inkubator bei 37°C für 4 h.
   4. Fügen Sie 10 mol BFA (Brefeldin A, mit Methanol gelöst) in jeden Brunnen, um den Golgi-Apparat vermittelten Proteintransport zu blockieren. Legen Sie die Platte zurück in den Zellinkubator und brüten Sie für 2 h.
2. Führen Sie die Färbung von Zelloberflächenmarkern durch.
   1. Resuspendzellen durch sanftes Pipetieren nach oben und unten und Übertragen der Zellen in ein FACS-Rohr. 1 ml Färbepuffer in das Rohr geben und zentrifugieren bei 350 x g für 6 min bei 4 °C.
   2. Führen Sie fc-receptor blocker Färbung als Schritt 3.1.4.
   3. Führen Sie Zelloberflächenmarkierungen aus(Tabelle 3), wie in den Schritten 3.2.1 bis 3.2.3 beschrieben, mit Ausnahme von Waschzellen mit 2 ml PBS.
   4. Zentrifuge bei 350 x g für 6 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie Zellen wieder auf, indem Sie auf den Rohrboden tippen.
3. Fügen Sie 0,2 l Reagenz aus dem Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell Färbeset hinzu und inkubieren Sie das Rohr in dunkel bei RT für 10 min, um die Färbung abgestorbener Zellen durchzuführen.
4. Fügen Sie 2 ml PBS in die Röhre und Wirbel auf dem Wirbel-Oszillationsgerät. Zentrifugieren Sie bei 350 x g für 6 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.
5. Führen Sie die Instandegung der Zellen gemäß den Schritten 5.3 und 5.4 durch.
6. Fügen Sie 300 l Färbepuffer hinzu, um Zellen wieder aufzuhängen und die Rohre über Nacht im 4 °C-Kühlschrank aufzubewahren. Zentrifuge bei 500 x g für 6 min bei 4 °C, um den Überstand zu entfernen.
   HINWEIS: Dieser Schritt könnte weggelassen werden und schritt 6.7 direkt nach Schritt 6.5 weiter.
7. Fügen Sie 1 ml Saponinpuffer (Färbepuffer ergänzt durch 0,2%/w/v) Saponin) in die Röhre und Wirbel auf der Wirbelschwingungsvorrichtung ein. 20 min auf Eis inkubieren, um eine Zellpermeabilisierung durchzuführen.
8. Zentrifugieren Bei 500 x g für 6 min bei 4 °C und Abwurf überstand.
9. Fügen Sie 0,5 l menschlichen Fc-IL21-Rezeptor in jede Röhre. Bereiten Sie Antikörpermischung für Multiple als Schritt 3.1.4 vor, mit Der Ausnahme, dass verdünnt Antikörper mit Saponin-Puffer anstelle von Färbung Puffer.
10. Inkubieren Sie bei RT für 1 h mit sanftem Tippen auf den Rohrboden, um Zellen bei 30 min wieder aufzusetzen.
11. Fügen Sie 2 ml Saponinpuffer zu Waschzellen und Zentrifuge bei 500 x g für 6 min. Überstand entsorgen und einmal waschen.
12. Fügen Sie 0,1 l APC-anti-human Ig(H+L) in jedes Rohr ein. Bereiten Sie die Mischung für mehrere Proben als Schritt 3.1.4 vor, mit der Ausnahme, dass verdünnter Antikörper mit Saponinpuffer anstelle von Färbepuffer.
13. Die Proben 30 Min. auf Eis bebrüten und als Schritt 6.11 waschen.
14. Resuspend Zellen mit 400 l Färbepuffer. Halten Sie die Probe auf Eis bis zur Durchflusszytometrieanalyse dunkel.

7. GC B und Plasmazellen Färbung

1. Nehmen Sie Zellen und führen Anti-Fc-Rezeptor-Antikörper-Färbung als Schritte von 3.1.1 bis 3.1.4.
2. Führen Sie Oberflächenmarkierungen färbung (Tabelle 4) als Schritte von 3.1.5 bis 3.1.7 aus, mit der Ausnahme, dass die Inkubationszeit 30 min statt 1 h beträgt.
3. Resuspend Zellen mit 400 l Färbepuffer. Halten Sie die Proben auf Eis bis zur Durchflusszytometrieanalyse dunkel.

8. Isolierung des Serums aus dem Blut

1. Am 14. Tag nach der Infektion (d.p.i 14) das Blut aus der Gesichtsvene zu sammeln und blutproben über Nacht in einem 4 °C Kühlschrank aufzubewahren.
   HINWEIS: Führen Sie die Blutentnahme bei ABSL2-Zustand durch und ab diesem Schritt konnten alle Eingriffe im regulären Labor durchgeführt werden.
2. Zentrifugieren Sie das Blut bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Isolieren Sie das Serum mit der 200-L-Pipette sorgfältig, um die Verschmutzung roter Zellen zu vermeiden. Aliquot in 3 Röhren für jede Probe und lagern Sie sie bei -80°C.

9. Test des HA-spezifischen Antikörpertiters mit ELISA

1. ELISA-Platten mit 50 l von 2 g/ml HA-Proteinlösung pro Brunnen beschichten und im 4 °C-Kühlschrank über Nacht inkubieren.
2. Waschen Sie dreimal mit 200 l PBS-verdünntem 0,05% Tween (PBST). Fügen Sie 100 l PBST-verdünnte 5% Magermilch in jeden Brunnen und inkubieren bei RT für 2 h, um die unspezifische Bindung zu blockieren.
3. Serumverdünnung und Inkubation: 3% BSA in PBS als Verdünnungspuffer vorbereiten. Verdünnen Sie das Serum im Verdünnungspuffer als 1:50, 1:150, 1:450, ...... 1:36450 (3-fache serielle Verdünnung wird empfohlen). Fügen Sie jedem Brunnen 50 l verdünntes Serum hinzu und in den 4°C-Kühlschrank über Nacht inkubieren.
4. Entsorgen Sie das Serum und waschen Sie die Brunnen schnell einmal, indem Sie 200 L PBST in jeden Brunnen hinzufügen (schütteln Sie es weich, dann entsorgen). Dann waschen Sie die Platten langsam auf Shaker mit 200 l PBST dreimal für 5 min jeder.
5. Fügen Sie 100 L HRP-markierte sekundäre Antikörper spezifisch für die gesamte IgG, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, verdünnt mit PBST) und inkubieren bei RT für 1 h. Waschen Sie die Platten mit PBST, wie in 9.4 beschrieben.
6. Nehmen Sie das gleiche Volumen von Puffer A und Puffer B (TMB) aus 4 °C Speicher und erwärmen Sie sich für mindestens 30 Minuten bei RT vor Gebrauch. Mischen Sie A und B und fügen Sie 100 L TMB in jeden Brunnen und inkubieren Sie sie für 10-30 Minuten bei RT durch sanftes Schütteln.
   HINWEIS: Dies ist eine kurze Beschreibung des TMB Substratreagenz-Sets (BD,555214).
7. Pipette 100 l von 2M H₂SO₄ in jeden Brunnen, um die Reaktion zu beenden. Lesen Sie den OD450-Wert über instrument.
8. Datenanalyse: Erhalten Sie den endgültigen OD450-Wert, indem Sie das Hintergrundsignal (OD450-Wert des leeren Brunnens) subtrahieren. Zeichnen Sie die Kurve, die einem Antikörper-Isotyp jeder Probe entspricht, mit dem Verdünnungsfaktor auf der X-Achse und dem OD450-Wert auf der Y-Achse.

10. Histologie

1. Isolieren Sie die Milz bei d.p.i 10. Fixieren Sie sie in 3,7% Formaldehydlösung für 1 h bei RT. Entsorgen Sie den Fixierungspuffer und waschen Sie ihn mit PBS für 5 min auf dem Shaker für dreimal.
2. Die Milz in PBS (10% Saccharose) bei 4°C für 1 h dehydrieren und dann in PBS (30% Saccharose) bei 4°C dehydrieren und sanft schütteln, bis die Milz auf den Boden des 15 ml-Rohres sinkt.
3. Nehmen Sie die getrockneten Milz heraus, betten Sie sie in eine optimale Schnitttemperaturverbindung ein und kryosectioniert.
4. Den Aceton bei -20°C vorkühlen. Die Gewebeabschnitte mit vorgekühltem Aceton 10 min inkubieren. Waschen Sie das Gewebe mit PBS für dreimal.
5. Permeabilisieren Sie die Gewebeabschnitte mit PBS, die 0,2% Triton X-100 für 20 min enthalten, und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
6. Blockieren Sie die unspezifische Bindung mit PBS, die 10% normales Ziegenserum (Sperrpuffer) für 1 h bei RT enthält, und waschen Sie die Gewebeabschnitte einmal mit PBS.
7. Blockieren Sie die unspezifische Bindung mit dem STREPTAVIDIN/BIOTIN-Blockierungskit.
   HINWEIS: Lassen Sie die Proben von diesem Schritt an nicht trocknen.
8. Färbung mit primärem Antikörper: Blockierenpufferverdünnte Biotin-PNA (25 g/ml) und Rattenanti-Maus-IgD (2,5 g/ml) vorsichtig auf die Gewebeabschnitte geben. Die Gewebeabschnitte in der Nasskammer im 4 °C-Gefrierschrank über Nacht inkubieren.
9. Waschen Sie die Gewebeabschnitte schnell mit PBST einmal. Waschen Sie die Gewebeabschnitte im PBST schnell mit langsamem Schütteln für 5 min. Dreimal waschen.
10. Verdünnen Alexa Fluor 488-streptavidin (1:500) und Alexa Fluor 555-Ziegen-Antiratte IgG (1:500) Antikörper mit Sperrpuffer und fügen Sie sie sorgfältig in die Gewebeabschnitte
11. Bei RT für 1 h inkubieren.
12. Waschen Sie die Gewebeabschnitte als Schritt 10.8 und montieren Sie vorsichtig mit der Verlängertlösung. Das Gewebe sorgfältig mit Abdeckungen bedecken und bei 4°C bis zur konfokalen Analyse dunkel halten.
13. Analysieren Sie die Größe der GC-Reaktion, indem Sie die GC-Zahlen pro Flächengröße zählen.

Charakterisierung der Morbidität der Maus bei Influenza-Virusinfektionen
Nach einer Influenza-Virusinfektion sind Mäuse aufgrund einer Krankheit weniger aktiv und anorexisch, was sich in einem schweren Gewichtsverlust widerspiegelt, einem häufig verwendeten Symptom zur Überwachung der Morbidität der Maus19. Wie in Abbildung 1agezeigt, begannen PR8-Virus-infizierte Mäuse an Tag 6 abzunehmen, erreichten am 8. Tag die höchste Verluststufe und kehrten am 10. Tag auf das ursprüngliche Niveau zurück. Wie erwartet, Gewichtsverlust wurde nicht während der gesamten Zeit in PBS-behandelten Kontrollmäusebeobachteten beobachtet. Bei In-vivo-Symptomen führt eine Virusinfektion zu einer robusten Lymphozytenexpansion im entwässernden Lymphknoten, in diesem Fall mLN. Daher wurden bei PR8-virusinfizierten Mäusen signifikant größere mLNs beobachtet als bei Kontrollmäusen (Abbildung 1b). Zusammengenommen zeigten diese Mäuse alle erwartete Symptome und waren für die anschließende Tfh-assoziierte Immunantwortstudie qualifiziert.

Nachweis von Tfh-Differenzierung und funktionsassoziierten Molekülen
Zur Analyse der Tfh-Differenzierung wurden Mäuse an Tag 5, 7, 10 und 14 geopfert, nachdem eine Infektion aufgetreten war, und mLNs oder Milz wurden für die Strömungszytometrie-Analyse isoliert. Abbildung 2a und Abbildung 2b zeigen die Tfh-Populations-Gating-Strategie, wobei Tfh als PD-1hi CXCR5-Hi-Zellen und nicht-Tfh als PD-1-niedrige CXCR5-Niedrige Zellen abgegrenzt ist. Mit dieser Gating-Strategie wurde die Kinetik der Tfh-Differenzierung während der Influenza-Virusinfektion assayed. Wie in Abbildung 2cdargestellt, initialisierte sich die Tfh-Differenzierung an Tag 5 und erreichte ihren Höhepunkt am 10. Tag. Also nahmen wir Proben von Tag 10 für weitere Analysen. Wie in Abbildung 3adargestellt, wurde eine robuste Tfh-Zelldifferenzierung bei Influenza-Virus-infizierten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen induziert. Zur Analyse von Influenza-virusspezifischen Tfh-Zellen wurden in der polyklonalen Tfh-Zellen-Färbeplatte(Tabelle 1) fluorchrome-markierte IAbNP311–325 MHC-Klasse II-Tetramere (NP311-325) zugesetzt. Sowohl in mlNs als auch in Milz von Influenza-Virus-infizierten Mäusen wurden NP311-325-spezifischeCD4+ T-Zellen signifikant induziert und NP311-325-spezifische Tfh-Zellen konnten durch Addition von PD-1 und CXCR5 in die Analyse analysiert werden (Abbildung 3e). Aufgrund wesentlicher Rollen von Bcl6 bei der Tfh-Differenzierung können Bcl6+CXCR5+ Zellen auch die Tfh-Population darstellen. Konsequenterweise wurden auch tfh-Zellen, die mit dieser Strategie identifiziert wurden, robust induziert (Abbildung 3b). Wir analysierten die Expression von Bcl6 in Tfh- und Nicht-Tfh-Zellen. Wie in Abbildung 3cdargestellt, weist eine höhere Expression von Bcl6 in Tfh-Zellen als in Nicht-Tfh-Zellen auf eine erfolgreiche Bcl6-Färbung hin. Mit ähnlicher Strategie, ICOS, wurde auch ein weiteres Tfh-assoziiertes Molekül analysiert (Abbildung 3d). Aufgrund der spezialisierten Rolle der Tfh-Zellen bei der Bereitstellung von Hilfe für B-Zellen, Assay der Expression von IL21, die hauptsächlich von Tfh-Zellen abgesondert wird und gezeigt, dass direkt regulieren B-Zellen Überleben und Proliferation, könnte Tfh-Zellen Funktion zu einem gewissen Grad zeigen. Wie in Abbildung 3fdargestellt, zeigte die intrazelluläre Färbung von IL21, dass die PR8-Infektion eine signifikant höhere Produktion dieses Zytokins induzierte, mit nicht stimulierten Zellen als Gating-Kontrolle. Zusammengenommen könnten diese Assays grundlegende Informationen der Tfh-Differenzierung widerspiegeln und Einblicke in die B-Zell-Hilfe-Fähigkeit geben.

Nachweis von GC B- und Plasmazellenentwicklung und Influenza-Virus-spezifischen Antikörpern im Serum
Die Hauptfunktion von Tfh-Zellen besteht darin, B-Zellhilfe in GCs bereitzustellen, in denen Antikörperklassenwechsel und Affinitätsreifung auftreten. So könnte die GC B-Entwicklung indirekt die Differenzierung und Funktion von Tfh-Zellen widerspiegeln. GC B-Zellen könnten als B220+PNA+Fas+ Zellen(Abbildung 2d) abgegrenzt werden. Durch diese Gating-Strategie haben wir die Kinetik der GC B-Zellreaktion ermittelt und festgestellt, dass die GC B-Antwort an Tag 10 begann und an Tag 14 weiter zunahm (Abbildung 2e). Der Vergleich zwischen PR8-Virus-infizierten und Kontrollmäusen zeigte, dass robuste GC B sowohl in mLN als auch in Milz nach einer Influenza-Virusinfektion induziert wurden(Abbildung 4a), was mit der induzierten Tfh-Differenzierung bei PRB-virusinfizierten Mäusen übereinstimmt. Darüber hinaus liefert die Immunfluoreszenzfärbung mit IgD und PNA visualisierte Bilder, die auf eine induzierte GC-Reaktion (grüne Bereiche) bei PR8-virusinfizierten Mäusen hinweisen (Abbildung 4d). Plasmazellen, die als IgDlowCD138+ Cells identifiziert wurden (Abbildung 2d), wurden auch in PR8-virusinfizierten Mäusen erzeugt (Abbildung 4b). Frühere Studien haben gezeigt, dass IFNƳ und IL21 sowohl von Th1- als auch von Tfh-Zellen bei Virusinfektionen abgesondert werden könnten und IgG2- und IgG1-Klassenwechsel bzw.20induzieren könnten. Abbildung 4c zeigt die Erzeugung von influenzavirusspezifischen Antikörpern durch ELISA-Assay von HA-spezifischem IgM, IgG, IgG1, IgG2b und IgG2C. Zusammen spiegeln alle diese Assays die Tfh-assoziierten B-Zellreaktionen bei Influenza-Virusinfektionen wider.

Abbildung 1: Charakterisierung der Mausmorbidität. 8 Wochen alte männliche Mäuse wurden mit 40 PFU PR8-Influenzavirus durch intranasale Impfung infiziert. Mäuse wurden täglich für 10 Tage gewogen (a) und mLNs wurden auf d.p.i 10 (b) isoliert. Die Fehlerbalken in (a) stellen den Mittelwert ± SD. n = 4 Mäuse pro Gruppe dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Gating-Strategie von Tfh-Zellen und GC-B-Zellen. (a) Lymphozyten werden durch FSC-A und SSC-A definiert, und Zell-Singlets sind mit FSC-A, FSC-H und SSC-A, SSC-W gated. (b) Nach dem Gating in CD4+ T-Zellen werden die Oberflächenmarker CD62L und CD44 verwendet, um die naiven T-Zellen (CD44loCD62Lhi) und aktivierte T-Zellen (CD44hiCD62Llo) zu unterscheiden. Polyklonale Tfh-Zellen können aus aktivierten T-Zellen als PD-1hi CXCR5-Hi-Population abgegrenzt werden, umgekehrt nicht-Tfh-Zellen als PD-1lowCXCR5low. PR8-virusspezifische Tfh-Zellen sind definiert als CD4+CD44+ NP311-325 Tetramer+PD-1hi CXCR5hi-Zellen. (c,e) Kinetik der Tfh-Frequenz in aktivierten Zellen (c) und GC B-Frequenz in B220+ Zellen (e). (d) GC B-Zellen werden als B220+ PNA+FAS+ Zellen abgegrenzt, und Plasmazellen sind IgD-CD138+ Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Analyse der Tfh-Differenzierung bei PR8-virusinfizierten Mäusen. Mäuse wurden auf d.p.i 10 geopfert und mLNs und Milz wurden für die Tfh-Differenzierungsanalyse isoliert. (a) Tfh-Prozentsatz in mlNs und Milz bei PR8-virusinfizierten Mäusen und PBS-behandelten Mäusen (obere mänar). Die Statistiken der Tfh-Zellen (unteres Panel). (b) Die intrazelluläre Färbung von Bcl6 in CD4+CD44hi T-Zellen (oberes Panel). Die Statistiken von Bcl6+CXCR5+ Zellen (unteres Panel). (c) Bcl6 und (d) ICOS-Expression in Tfh-Zellen (linienrot) und Nicht-Tfh-Zellen (solid-grau). (e) Gating von NP311-325-spezifischen CD4+ T-Zellen in mlNs und Milz von PR8-virusinfizierten und PBS-behandelten Mäusen (linkes Panel). Der Prozentsatz der PR8-virusspezifischen Tfh-Zellen in mLNs und Milz (mittleres Panel). "Isotyp" zeigt Färbung mit irrelevanter Tetramerkontrolle an. Die Statistiken der NP311-325-spezifischen CD4+ T-Zellen (rechtes Panel). (f) Intrazelluläre Färbung von IL-21 in Milz-CD4+ T-Zellen von PR8-virusinfizierten und PBS-behandelten Mäusen, die nicht stimulationisch als Kontrolle dargestellt (links). Die Statistiken der IL-21 Färbung (rechts). **P < 0.01, ***P < 0.001 und **** P < 0.0001 (zweischwanz-Schüler-t-Test). Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD. n = 3 Mäuse pro Gruppe dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Analyse der GC B-Zell-assoziierten Reaktion bei PR8-virusinfizierten Mäusen. Mäuse wurden auf d.p.i 10 geopfert und die mLNs und Milz wurden zur Analyse isoliert. (a) Der Prozentsatz der GC B-Zellen (oberes Panel). Die Statistiken der GC B-Zellen (unteres Panel). (b) Der Prozentsatz der Plasmazellen (obere Platte). Die Statistiken der Plasmazellen (unteres Panel). (c) Quantifizierung des PR8-Virus HA-spezifischen IgG, IgM, IgG1, IgG2b und IgG2c im Serum (d.p.i 14) von PR8-virusinfizierten Mäusen und PBS-behandelten Mäusen. (d) Konfokale Mikroskopie von B-Zellfollikel (IgD+, Rot) und GCs (PNA+, Grün) in den Milzproben von PR8-virusinfizierten Mäusen und PBS-behandelten Mäusen (d.p.i 10). *P < 0.5, **P < 0.01 und ***P < 0.001 (zweischwanz-Schüler-T-Test). Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD. n = 3 Mäuse pro Gruppe dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Oberflächenmarker (mit Ausnahme von CXCR5) Antikörper-Panel zur Färbung von Tfh-Zellen (PD-1hiCXCR5hi).

Tabelle 2: Oberflächenmarker-Antikörper (mit Ausnahme von CXCR5) zur Färbung von Bcl6 in Tfh-Zellen.

Tabelle 3: Oberflächenmarker-Antikörper-Panel zur intrazellulären Färbung von IL21.

Tabelle 4: Oberflächenmarker-Antikörper-Panel zur Färbung von GC B- und Plasma-B-Zellen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.