Quantifizierung der Tumorzelladhäsion in Lymphknoten-Kryosektionen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Methode, die die Quantifizierung von klebenden Tumorzellen zu Lymphknoten (LN) Kryosektionen ermöglicht. LN-anhängliche Tumorzellen werden leicht durch Lichtmikroskopie identifiziert und durch eine fluoreszenzbasierte Methode bestätigt, die einen Haftindex ergibt, der die Tumorzellbindungsaffinität zu LN-Parenchym offenbart.

Zusammenfassung

Tumorabflussende Lymphknoten (LNs) sind nicht nur Filter von tumorerzeugten Abfällen. Sie sind einer der häufigsten regionalen Standorte des vorläufigen Wohnsitzes von disseminierten Tumorzellen bei Patienten mit verschiedenen Krebsarten. Der Nachweis dieser LN-lebenden Tumorzellen ist ein wichtiger Biomarker, der mit schlechten Prognose- und adjuvanten Therapieentscheidungen verbunden ist. Jüngste Mausmodelle haben gezeigt, dass LN-lebende Tumorzellen eine wesentliche Quelle bösartiger Zellen für entfernte Metastasen sein könnten. Die Fähigkeit, die Verklebung von Tumorzellen mit LN Parenchym zu quantifizieren, ist ein kritisches Maß in der experimentellen Forschung, das sich auf die Identifizierung von Genen oder Signalwegen konzentriert, die für die lymphatische/metastasierende Verbreitung relevant sind. Da LNs komplexe 3D-Strukturen mit einer Vielzahl von Erscheinungen und Zusammensetzungen in Gewebeabschnitten sind, abhängig von der Ebene des Abschnitts, sind ihre Matrizen schwierig, experimentell in vitro in einer vollständig kontrollierten Weise zu replizieren. Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Methode, die die Quantifizierung von klebenden Tumorzellen zu LN-Kryosektionen ermöglicht. Mit seriellen Abschnitten desselben LN passen wir die von Brodt entwickelte klassische Methode an nicht radioaktive Etiketten an und zählen direkt die Anzahl der haftenden Tumorzellen pro LN-Oberfläche. LN-anhängliche Tumorzellen werden leicht durch Lichtmikroskopie identifiziert und durch eine fluoreszenzbasierte Methode bestätigt, was einen Haftungsindex ergibt, der die zellbindende Affinität zu LN-Parenchym offenbart, was ein suggestiver Beweis für molekulare Veränderungen in der Affinitätsbindung von Integrinen an ihre korrelierten LN-Liganden ist.

Einleitung

Krebsmetastasen sind der Hauptgrund für Behandlungsversagen und der vorherrschende lebensbedrohliche Aspekt von Krebs. Wie vor 130 Jahren postuliert, entsteht die metastasierende Ausbreitung, wenn eine Elite von verbreiteten Tumorzellen (DTCs, die "Samen") spezifische biologische Fähigkeitenerwerben, die es ihnen ermöglichen, primäre Standorte zu umgehen und bösartiges Wachstum an entfernten Stellen (dem "Boden") zu etablieren 1 . In jüngster Zeit sind mehrere neuartige Konzepte über die "Samen- und Bodenbeziehungen" entstanden, wie die Induktion prämetastatischer Nischen (konzeptioniert als "fruchtbarer Boden", der für "Samen" benötigt wird, u....

Protokoll

LNs wurden von frischen Kadavern gesunder erwachsener Wistar-Ratten geborgen, die durch Zervixverrenz geopfert wurden. Wir folgten den NIH-Richtlinien für Schmerzen und Leiden bei Labortieren und alle Verfahren wurden von der Ethikkommission und Tierforschung des Forschungs- und Bildungsinstituts des Krankenhauses von Sério-Libans (CEUA P 2016-04) genehmigt.

HINWEIS: Alle frisch gefrorenen Gewebe gelten als biogefährlich und sollten unter geeigneten Biosicherheitsvorkehrungen behandelt werden.

1. Lymphadenektomie und Kryosektion

1. Legen Sie frische Kadaver von erwachsenen Wistar-Ratten (180-220 g) in dors....

Ergebnisse

Wir veranschaulichen den Test, indem wir das LN-Klebstoffpotenzial roter fluoreszierender MCF-7-Brustkrebszellen bewerten, die verschiedene Ebenen des NDRG4-Gens (als NDRG4-positive und NDRG4-negative Zellen bezeichnet) exmittieren, einen negativen Modulator der Beta1-Integrin-Clustering an der Zelloberfläche²⁴, indem wir die Fraktionen von Ratten-LN-anhaftenden Tumorzellen untersuchen. Beispiele für die Rohbilder dieses Protokolls sind in Abbi.......

Diskussion

Die Verbreitung von Krebszellen durch das Lymphsystem erfordert eine Vielzahl komplexer zellgesteuerter Ereignisse. Sie initiieren mit Zellablösung vom Primärtumor und der Umgestaltung der extrazellulären Matrixarchitektur (ECM) und werden durch anhaltende Chemotaxis und aktive Migration durch die affeligen Lymphatiken auf dem Weg zu den Sentinel-LNs unterstützt. Wenn Krebszellen in LNs haften und überleben, können sie sich leicht auf andere Sekundärorgane ausbreiten. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur schnel.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mL Konische Röhrchen	Corning	352096
2-Propanol	Merck	109634
Benchtop Laminar Flow	Esco Zellkulturbehälter
für Disc	Leica	14020139126
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A9647-100
Zellkulturflasche T-25 cm2	Corning	430372
Kryostat	Leica	CM1860 UV
Kryostat-Bürste mit Magnet	Leica	14018340426
DiIC18 Cell Traker Farbstoff	Molekulare Sonden	V-22885
Fötales Rinderserum (FBS)	Life Technologies	12657-029
Fluoreszenzmikroskop	Nikon Eclipse 80
Forma Serie II CO2 Inkubator	Thermo Scientific
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	252549
High Profile Einwegrasierer	Leica	14035838926
Inkubationswürfel (IHC)	KASVI	K560030
Inverses Mikroskop	Olympus	CKX31
Isofluran 100 mL	Cristá lia
Liquid Bloquer Super Pap Pen	Abcam, Life Science Reagenzien	ab2601
Optimale Schnitttemperatur "OCT" Verbindung	Sakura	4583
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Life Technologies	70011-044
Poly-L-Lysin	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	Gibco	31800-022
Serologische Pipetten 1 mL	Jet Biofil	GSP010001
Serologische Pipetten 10 mL	Jet Biofil	GSP010010
Serologische Pipetten 2 mL	Jet Biofil	GSP010002
Serologische Pipetten 5 mL	Jet Biofil	GSP010005
Serologische Pipetten 50 mL	Jet Biofil	GSP010050
Serologische Pipette Easypet 3	Eppendorf
Tissue-Tek Kryoform	Sakura	4557
Trypan Blau 0,4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Instituto Adolfo Lutz	ATV