Methodenartikel

Quantifizierung der Tumorzelladhäsion in Lymphknoten-Kryosektionen

DOI:

10.3791/60531

⸱

9. Februar 2020

 ,  ,  , 
1Molecular Oncology Center, Hospital Sírio-Libanês

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Methode, die die Quantifizierung von klebenden Tumorzellen zu Lymphknoten (LN) Kryosektionen ermöglicht. LN-anhängliche Tumorzellen werden leicht durch Lichtmikroskopie identifiziert und durch eine fluoreszenzbasierte Methode bestätigt, die einen Haftindex ergibt, der die Tumorzellbindungsaffinität zu LN-Parenchym offenbart.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tumorabflussende Lymphknoten (LNs) sind nicht nur Filter von tumorerzeugten Abfällen. Sie sind einer der häufigsten regionalen Standorte des vorläufigen Wohnsitzes von disseminierten Tumorzellen bei Patienten mit verschiedenen Krebsarten. Der Nachweis dieser LN-lebenden Tumorzellen ist ein wichtiger Biomarker, der mit schlechten Prognose- und adjuvanten Therapieentscheidungen verbunden ist. Jüngste Mausmodelle haben gezeigt, dass LN-lebende Tumorzellen eine wesentliche Quelle bösartiger Zellen für entfernte Metastasen sein könnten. Die Fähigkeit, die Verklebung von Tumorzellen mit LN Parenchym zu quantifizieren, ist ein kritisches Maß in der experimentellen Forschung, das sich auf die Identifizierung von Genen oder Signalwegen konzentriert, die für die lymphatische/metastasierende Verbreitung relevant sind. Da LNs komplexe 3D-Strukturen mit einer Vielzahl von Erscheinungen und Zusammensetzungen in Gewebeabschnitten sind, abhängig von der Ebene des Abschnitts, sind ihre Matrizen schwierig, experimentell in vitro in einer vollständig kontrollierten Weise zu replizieren. Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Methode, die die Quantifizierung von klebenden Tumorzellen zu LN-Kryosektionen ermöglicht. Mit seriellen Abschnitten desselben LN passen wir die von Brodt entwickelte klassische Methode an nicht radioaktive Etiketten an und zählen direkt die Anzahl der haftenden Tumorzellen pro LN-Oberfläche. LN-anhängliche Tumorzellen werden leicht durch Lichtmikroskopie identifiziert und durch eine fluoreszenzbasierte Methode bestätigt, was einen Haftungsindex ergibt, der die zellbindende Affinität zu LN-Parenchym offenbart, was ein suggestiver Beweis für molekulare Veränderungen in der Affinitätsbindung von Integrinen an ihre korrelierten LN-Liganden ist.

Einleitung

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Krebsmetastasen sind der Hauptgrund für Behandlungsversagen und der vorherrschende lebensbedrohliche Aspekt von Krebs. Wie vor 130 Jahren postuliert, entsteht die metastasierende Ausbreitung, wenn eine Elite von verbreiteten Tumorzellen (DTCs, die "Samen") spezifische biologische Fähigkeitenerwerben, die es ihnen ermöglichen, primäre Standorte zu umgehen und bösartiges Wachstum an entfernten Stellen (dem "Boden") zu etablieren 1 . In jüngster Zeit sind mehrere neuartige Konzepte über die "Samen- und Bodenbeziehungen" entstanden, wie die Induktion prämetastatischer Nischen (konzeptioniert als "fruchtbarer Boden", der für "Samen" benötigt wird, um zu gedeihen), die Selbstaussaat von Primärtumoren durch DTCs, "Samen"-Ruhe an sekundären Organen und das parallele Progressionsmodell der Metastasierung2.

Bei den meisten soliden Malignitäten können DTCs in vielen mesenchymalen Organen, wie Knochenmark und Lymphknoten (LNs) bei Patienten mit oder ohne Nachweis klinischer Metastasierung, residieren und nachgewiesen werden. Da tumorabflussende LNs der erste Standort der regionalen Verbreitung von DTCs sind, ist der LN-Status ein wichtiger prognostischer Indikator und wird oft mit adjuvanten Therapieentscheidungen in Verbindung gebracht3. Bei einigen Tumortypen ist die Korrelation zwischen LN-Status und schlechteren Ergebnissen stark, einschließlich Kopf und Hals4,5, Brust6, Prostata7, Lunge8, Magen9, kolorektal10,11 und Schilddrüsenkrebs12.

LNs sind kleine eiförmige Organe des Lymphsystems, die mit Netzzellen bedeckt und mit Lymphgefäßen umschlossen sind. Diese Organe sind absolut notwendig für die Funktion des Immunsystems13. LNs fungieren als Anziehungsmittel plattformen für immun zirkulierende Zellen und bringen die Lymphozyten und Antigen-präsentierenden Zellen zusammen14. Jedoch, LNs ziehen auch zirkulierende Tumorzellen. Über Jahrzehnte wurden LNs als passive Transportwege für metastasierende Tumorzellen dargestellt. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass Tumorzellen auch durch chemotaktische (Chemokine) und/oder haptotaktische (extrazelluläre Matrixelemente) vom lymphatischen Endothel15sezernierte Cues zu LNs geführt werden können. Als Beispiele erleichtert die Überexpression des CCR7-Rezeptors in Tumorzellen die Führung metastasierender Melanomzellen hin zu tumorableitenden LNs16. Darüber hinaus bieten extrazelluläre LN-Proteine ein Klebegerüst für die Rekrutierung und das Überleben zirkulierender Tumorzellen17. Tatsächlich liefern tumorableitende LNs fruchtbaren Boden für die Aussaat von DTCs, die in proliferativen oder ruhenden Zuständen durch spezifische LN-Mikroumweltsignale gehalten werden können18. Das endgültige Schicksal dieser LN-wohnhaften DTCs ist umstritten; Einige Arbeiten deuten darauf hin, dass diese Zellen passive Indikatoren für die metastasierende Progressionsind 19, während andere vorschlagen, dass sie eher Gründer von Resistenzen sind (durch selbstsäende primäre Standorte) und/oder als zelluläre Reservoirs für Metastasen fungieren (Verbreitung von "Samen" für tertiäres Krebswachstum)20,21. Kürzlich wurde mit präklinischen Modellen nachgewiesen, dass ein Bruchteil dieser LN-wohnhaften DTCs aktiv in Blutgefäße eingedrungen ist, in den Blutkreislauf gelangt eist und die Lunge kolonisiert hat21.

In Anbetracht der Tatsache, dass das Vorhandensein von Krebszellen in LNs ein Marker für Krebsaggressivität und Invasivität ist, haben wir in dieser Studie eine klassische Methode optimiert, die von Brodt22 entwickelt wurde, um die Adhäsion von Tumorzellen an LNs in vitro quantitativ zu messen. Die Verwendung eines fluoreszenzbasierten Assays ermöglichte es uns, ein kostengünstiges, schnelles, empfindliches und umweltfreundliches (nicht radioaktives) Protokoll zum Nachweis von Klebstoffveränderungen zwischen Tumorzellen und LN-Kryosektionen zu entwickeln. Mit den MCF-7 Brustkrebszellen, die verschiedene Niveaus der NDRG4-Genexpression und Ratten-LN-Frozen-Abschnitte exdrücken, um die Methode zu veranschaulichen, zeigten wir, dass dieses Protokoll eine gute Korrelation zwischen der Adhäsion von Tumorzellen zu LNs in vitro und LN-Metastasen, die bei Brustkrebspatientinnen beobachtet wurden, ermöglichte24.

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Protokoll

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LNs wurden von frischen Kadavern gesunder erwachsener Wistar-Ratten geborgen, die durch Zervixverrenz geopfert wurden. Wir folgten den NIH-Richtlinien für Schmerzen und Leiden bei Labortieren und alle Verfahren wurden von der Ethikkommission und Tierforschung des Forschungs- und Bildungsinstituts des Krankenhauses von Sério-Libans (CEUA P 2016-04) genehmigt.

HINWEIS: Alle frisch gefrorenen Gewebe gelten als biogefährlich und sollten unter geeigneten Biosicherheitsvorkehrungen behandelt werden.

1. Lymphadenektomie und Kryosektion

  1. Legen Sie frische Kadaver von erwachsenen Wistar-Ratten (180-220 g) in dorsaler Rektumbenität auf einem sauberen Sezierbrett bei Raumtemperatur liegen.
    HINWEIS: LNs müssen bis zu 30 min nach der Euthanasie gesammelt werden.
  2. Sprühen Sie den Karkörper der Ratte mit 70% Isopropylalkohol und verwenden Sie sterilisierte Instrumente für die LN-Ernte.
  3. Heben Sie die Bauchhaut mit Hilfe einer Pinzette an und öffnen Sie einen Hohlraum mit einem medialen Schnitt, ohne das darunter liegende Gewebe zu beschädigen, wobei die Bauchviszera freigelegt wird. Ziehen Sie den Darm heraus und die Brust- und Bauch-LNs werden sichtbar (Abbildung 1).
  4. Verbrauchen Sie vorsichtig die LNs von jeder Ratte mit der Verwendung von stumpfen Spitzenscheren, um zu vermeiden, dass die überlegene mesenterische Arterie dahinter liegt.
    HINWEIS: Je nach Position des resezierten Lymphknotens ist es notwendig, andere gewebe zu reinigen, die daran haften, wie z. B. mesenterisches Gewebe.
  5. Ernte LNs in 15 ml konische Rohre mit 5 ml steriler Phosphatgepufferte Saline (PBS).
  6. Entsorgen Sie die Karkassen der Ratte richtig.
  7. Entfernen Sie frische LNs aus dem PBS, rollen und trocknen Sie den Knoten auf einem trockenen Filterpapier. Legen Sie es in eine kleine Petrischale und fügen Sie einbettende Lösung für gefrorene Gewebeproben (O.C.T.) für 2 min.
  8. Übertragen und orientieren Sie die LN nach unten in einer gewünschten Position in der Basis eines Kryomolds, mit gerade genug O.C.T, um es zu bedecken. Vermeiden Sie Blasen in der Nähe des Gewebes. Die Schnittfläche ist der Boden des Kryomolds.
  9. Sofort den Kryomold in einem Styroporkühler mit Trockeneis einfrieren. Wenn es noch einen kleinen Teil des nicht gefrorenen O.C.T. (20-35 s) gibt, übertragen Sie die Probe auf Aluminiumfolie und legen Sie sie in einen Kühler mit Trockeneis, während Sie weiterhin andere Proben einfrieren. Am Ende alle Proben bei -80 °C bis zum Schnitt lagern.
  10. Schneiden Sie die LN mit einem Kryostat,-Anpassungsabschnitt dicke auf 5-8 m. Übertragen Sie Kryptsektionen auf Mikroskop-Dias.
    HINWEIS: Entfernen Sie vor dem Schnitt die gefrorenen Proben aus dem Gefrierschrank -80 °C und lassen Sie sie bis zu einem Monat bei -80 °C bei -22 °C auf die Temperatur in der Kryostat-Mikrotomekammer ausgrenzen. LN-haltige Dias können bis zu einem Monat bei -80 °C gelagert werden.

2. Zelluläre Kennzeichnung mit fluoreszierenden Farbstoffen

HINWEIS: Fluoreszierende Farbstoffe sind in der Zellbiologie weit verbreitet. Wir bevorzugen die langkettige Dialkylcarbocyanine-Etikettierung (DiI(C18), Anregung 549 nm, Emission 565 nm), weil sie hell, stabil sind und direkt zu Kulturmedien hinzugefügt werden können, keine Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit oder Zellklebstoffeigenschaften25,26.

  1. Dissoziatzellen, die unter idealen Bedingungen (d. h. in vollständigem Medium) wachsen und in serumfreiem Medium mit einer Dichte von 106 Zellen/ml wieder aufsetzen.
  2. 1 ml Zellsuspension (106 Zellen) zu einem 15 ml konischen Rohr geben und mit Dil(C18) (2 g/ml) für 10 min bei 37 °C beschriften.
    HINWEIS: Nach 5 min rühren Sie die Rohre sanft auf, um Zellsedimentation und Unterfärbung von Sedimentzellen zu vermeiden. Größere Dichten erfordern längere Inkubationszeiten für eine gleichmäßige Färbung. Eine optimale Inkubationszeit für die Zellfärbung variiert je nach Zelllinie. Sie kann mit dem herkömmlichen FL2-Flow-Zytometrie-Erkennungskanal besser quantifiziert werden (Abbildung 2A).
  3. Zentrifugieren Sie die beschrifteten Suspensionsrohre bei 300 x g für 4 min.
  4. Den Überstand entfernen und zweimal in 10 ml serumfreiem Medium waschen. Stellen Sie die Zellen als rote Pellets wieder her. Setzen Sie die Zellen bei 106 Zellen/ml in serumfreiem Medium mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) aus.

3. Vorbeschichtung von Geschirr mit Poly-L-Lysin-Lösung oder BSA als Seeding Control (Optional)

HINWEIS: Wir verwendeten zellkulturbeschichtete, mit PLL vorbeschichtete Zellkultur-Oberflächen als positive Ladekontrollflächen, um sicherzustellen, dass verschiedene experimentelle Gruppen von Tumorzellen in der gleichen Anzahl gesät wurden, sowie BSA-beschichtete Oberflächen als Negativkontrollen.

  1. Unter sterilen Bedingungen, um PLL- oder BSA-beschichtete Brunnen vorzubereiten, 300 l PLL (0,1% w/v in H2O) oder BSA (verdünnt mit 2,5% w/v in H2O) direkt auf die 24-Well-Platte geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  2. Lösung durch Aspiration entfernen, die Oberfläche vorsichtig mit sterilem PBS abspülen und die Platte bei Raumtemperatur in der Gewebekulturhaube vor dem Zellsäen lufttrocknen.
    HINWEIS: Die Endvolumina von PLL oder BSA müssen entsprechend der Fläche verschiedener Brunnenplatten angepasst werden.

4. Saat fluoreszierend markierte Tumorzellen auf LN-Kryosektionen oder PLL/BSA-beschichteten Brunnen

ANMERKUNG: Als experimentelle Kontrollen verwendeten wir (1) Zellkulturschalen, die mit PLL oder BSA vorbeschichtet waren, und (2) aufeinander folgenden Abschnitte desselben LN pro Experiment (siehe dieses Detail in Abbildung 2D), wobei letztere regionale Variationen in der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix (ECM) jedes LN-Abschnitts minimieren, was wiederum die Zellhaftungsrate diktieren kann. Für den folgenden Tumorzelladhäsionstest wählen Sie hochwertige und sequenzielle LN-Kryosektionen aus.

  1. Waschen Sie die Kryosektionen zweimal mit PBS und rehydrieren Sie mit PBS 15 min bei Raumtemperatur.
  2. Blockieren Sie unspezifische Adhäsion zu Kryosektionen mit 2,5% BSA für 30 min bei 37 °C. Verwenden Sie immunhistochemische Waschkammern und Lamina-Wiegen, um sicherzustellen, dass das gesamte O.C.T während der Wäsche und Inkubationen entfernt wurde.
  3. Den überschüssigen BSA auf einem trockenen Papiertuch abtropfen lassen, den Umriss der LN-Abschnitte mit einem Wattestäbchen trocknen und die Abschnitte mit einem PAP-Stift umschließen.
  4. Für den Adhäsionstest der Tumorzelle 100 l Zellsuspension (ab Schritt 2.4) zu jedem eingekreisten LN-Abschnitt oder gut in die 24-well PLL-beschichteten Platten geben und im herkömmlichen Zellkultur-Inkubator 1-2 h bei 37 °C in ein befeuchtetes Kammergestell legen.
    HINWEIS: Das endgültige Volumen der Zellsuspension muss entsprechend der Fläche verschiedener eingekreisten LNs angepasst werden.
  5. Mit PBS müssen Sie nicht anhaftende Zellen viermal abwaschen. Fixieren Sie die verbleibenden haftenden Fluoreszenzzellen mit 3,7% Formaldehyd in PBS für 15 min bei Raumtemperatur.

5. Manuelle Quantifizierung des Klebstoffindex

HINWEIS: Der Klebstoffindex (d. h. Tumorzellen/LN mm2) wurde mit einem 10-fachen Objektiv und manueller Zählung der Anzahl der Tumorzellen erreicht, die durch Lichtmikroskopie leicht identifiziert und durch eine Fluoreszenzmikroskopie bestätigt wurden (Abbildung 2D), pro Lymphknotenbereiche mehrerer unabhängiger Felder (erhalten mit der ImageJ/FIJI-Software des National Institute of Health).

  1. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit einem 10-fachen Objektiv, um separate TIFF-Bilder in zwei Kanälen aufzunehmen, die den hellen und rotfluoreszierenden Feldern entsprechen (Abbildung 2D). Benennen und speichern Sie diese Bilder systematisch.
  2. Starten Sie ImageJ/FIJI, öffnen Sie die Bilder und legen Sie den Maßstab fest. Es ist notwendig, eine Kalibrierskala (z. B. ein mikrometrisches Lineal 1 mm) zu verwenden (Abbildung 2C).
  3. Öffnen Sie das Foto des mikrometrischen Lineals (oder eines Bühnenmikrometers), wählen Sie das Werkzeug Gerade Linie aus und zeichnen Sie eine gerade Linie, die eine bekannte Entfernung definiert.
  4. Wählen Sie im Menü Analysieren die Option Skalierung festlegenaus. Die Entfernung in Pixeln wird basierend auf der Länge (in Pixel) der in Schritt 5.3 gezeichneten Linie ausgefüllt. Der bekannte Abstand wird mit dem realen Abstand (in diesem Fall in Millimetern) und der Längeneinheit im Längenfeldeinheit (in diesem Fall in Millimetern) gefüllt.
  5. Klicken Sie auf Global (diese Kalibrierung gilt für alle Bilder, die in dieser ImageJ/FIJI-Sitzung geöffnet wurden) und drücken Sie OK.
  6. Lymphknotenbereichsquantifizierung: Wählen Sie das Werkzeug Wand und öffnen Sie durch Doppelklick die Werkzeugeinstellungen des Wandwerkzeugs. Stellen Sie den Modus auf 8 angeschlossen ein. Klicken Sie auf das Foto und legen Sie die Toleranz fest, bis Sie alle Lymphknoten im Foto auswählen und OKdrücken. Um die Fläche zu messen, öffnen Sie Analysieren | Maßnahme (STRG + M). Der Bereich wird in den zuvor festgelegten Einheiten ausgedrückt.
  7. Tumorzellquantifizierung: Öffnen Sie die Lichtmikroskopie/Fluoreszenzbilder in der FIJI-Software. Plugins auswählen | Analysieren | Zelle Zähler | Zellenzähler. Klicken Sie auf das zu quantifizierende Foto und drücken Sie die Initialize-Taste im Zellenzählerfenster. Wählen Sie Denkzählertyp (1-8) und klicken Sie auf die Zellen im Foto. Um das nächste Foto zu initialisieren, drücken Sie die Reset-Taste im Zellenzählerfenster, öffnen Sie das neue Foto und wiederholen Sie alle Schritte.
    HINWEIS: Der LN-Haftindex wird als Anzahl der anhaftenden Tumorzellen pro LN-bedeckter Fläche (Zellen/mm2) ausgedrückt.

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Ergebnisse

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Wir veranschaulichen den Test, indem wir das LN-Klebstoffpotenzial roter fluoreszierender MCF-7-Brustkrebszellen bewerten, die verschiedene Ebenen des NDRG4-Gens (als NDRG4-positive und NDRG4-negative Zellen bezeichnet) exmittieren, einen negativen Modulator der Beta1-Integrin-Clustering an der Zelloberfläche24, indem wir die Fraktionen von Ratten-LN-anhaftenden Tumorzellen untersuchen. Beispiele für die Rohbilder dieses Protokolls sind in Abbi...

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Diskussion

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Die Verbreitung von Krebszellen durch das Lymphsystem erfordert eine Vielzahl komplexer zellgesteuerter Ereignisse. Sie initiieren mit Zellablösung vom Primärtumor und der Umgestaltung der extrazellulären Matrixarchitektur (ECM) und werden durch anhaltende Chemotaxis und aktive Migration durch die affeligen Lymphatiken auf dem Weg zu den Sentinel-LNs unterstützt. Wenn Krebszellen in LNs haften und überleben, können sie sich leicht auf andere Sekundärorgane ausbreiten. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur schnel...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Rosana De Lima Pagano und Ana Carolina Pinheiro Campos für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien von: FAPESP - Sao Paulo Research Foundation (2016/07463-4) und Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL Konische RöhrchenCorning352096
2-PropanolMerck109634
Benchtop Laminar FlowEsco Zellkulturbehälter
für DiscLeica14020139126
RinderserumalbuminSigma-AldrichA9647-100
Zellkulturflasche T-25 cm2Corning430372
KryostatLeicaCM1860 UV
Kryostat-Bürste mit MagnetLeica14018340426
DiIC18 Cell Traker FarbstoffMolekulare SondenV-22885
Fötales Rinderserum (FBS)Life Technologies12657-029
FluoreszenzmikroskopNikon Eclipse 80
Forma Serie II CO2 InkubatorThermo Scientific
FormaldehydSigma-Aldrich252549
High Profile EinwegrasiererLeica14035838926
Inkubationswürfel (IHC)KASVIK560030
Inverses MikroskopOlympusCKX31
Isofluran 100 mLCristá lia
Liquid Bloquer Super Pap PenAbcam, Life Science Reagenzienab2601
Optimale Schnitttemperatur "OCT" VerbindungSakura4583
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Life Technologies70011-044
Poly-L-LysinSigma-AldrichP8920
RPMIGibco31800-022
Serologische Pipetten 1 mLJet BiofilGSP010001
Serologische Pipetten 10 mLJet BiofilGSP010010
Serologische Pipetten 2 mLJet BiofilGSP010002
Serologische Pipetten 5 mLJet BiofilGSP010005
Serologische Pipetten 50 mLJet BiofilGSP010050
Serologische Pipette Easypet 3Eppendorf
Tissue-Tek KryoformSakura4557
Trypan Blau 0,4%InvitrogenT10282
TrypsinInstituto Adolfo LutzATV

Referenzen

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