Summary
Nedsat mitokondrielle transport og morfologi er involveret i forskellige neurodegenerative sygdomme. Den præsenterede protokol bruger inducerede pluripotente stamceller-afledte forhjernen neuroner til at vurdere mitokondrielle transport og morfologi i arvelig spastisk paraplegi. Denne protokol giver mulighed for karakterisering af mitokondriel handel langs axoner og analyse af deres morfologi, som vil lette studiet af neurodegenerative sygdomme.
Abstract
Neuroner har intense krav til høj energi for at støtte deres funktioner. Nedsat mitokondrielle transport langs axoner er blevet observeret i menneskelige neuroner, som kan bidrage til neurodegeneration i forskellige sygdomstilstande. Selv om det er udfordrende at undersøge mitokondrielle dynamik i levende menneskelige nerver, sådanne paradigmer er afgørende for at studere den rolle mitokondrier i neurodegeneration. Beskrevet her er en protokol til analyse af mitokondriel transport og mitokondriel morfologi i forhjernen neuron axoner stammer fra menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSCs). IPSCs er differentieret i telencephalic glutamatergic neuroner ved hjælp af veletablerede metoder. Mitokondrier af neuroner er plettet med MitoTracker CMXRos, og mitokondrielle bevægelse i axoner er fanget ved hjælp af en live-celle imaging mikroskop udstyret med en kuvøse for cellekultur. Time-lapse billeder analyseres ved hjælp af software med "MultiKymograph", "Bioformat importør", og "Makroer" plugins. Kymographs af mitokondriel transport genereres, og gennemsnitlig mitokondriel hastighed i anterograde og retrograd retninger læses fra kymografen. Med hensyn til mitokondriel morfologi analyse, mitokondriel længde, område, og billedformat opnås ved hjælp af ImageJ. Sammenfattende giver denne protokol mulighed for karakterisering af mitokondriel handel langs axoner og analyse af deres morfologi for at lette undersøgelser af neurodegenerative sygdomme.
Introduction
Mitokondriel motilitet og distribution spiller en afgørende rolle i opfyldelsen af variable og specialiserede energiske krav i polariserede neuroner. Neuroner kan udvide ekstremt lange axoner til at forbinde med mål gennem dannelsen af synapser, som kræver høje niveauer af energi til Ca2 + buffering og ion strømme. Transport af mitokondrier fra soma til axon er afgørende for at støtte axonal og synaptisk funktion af neuroner. Rumligt og tidsmæssigt dynamisk mitokondriel bevægelse udføres ved hurtig aksonal transport med hastigheder på flere mikrometer pr.sekund 1.
Specifikt, motor eller adapter proteiner, såsom kinesin og dynein, deltage i den hurtige organelle transport langs mikrotubuli til at kontrollere flytning af mitokondrier2,3. Normal neuronal aktivitet kræver korrekt transport af nyligt samlede mitokondrier fra neuronal soma til distale axon (anterograde axonal transport) og omvendt transport af mitokondrier fra den distale axon tilbage til cellekroppen (retrograd transport). Nylige undersøgelser har vist, at forkert mitokondriel tildeling er stærkt forbundet med neuronale defekter og motorneuron degenerative sygdomme4,5. Derfor, at dissekere rollen som mitokondrier i neurodegeneration, er det vigtigt at etablere metoder til at undersøge mitokondrielle bevægelse langs axoner i levende kulturer.
Der er to største udfordringer i at undersøge og analysere sporing af mitokondrier: (1) identificere mitokondrier fra baggrunden i hver ramme, og (2) analysere og generere forbindelserne mellem hver ramme. Ved løsningen af den første udfordring anvendes en fluorescensmærkningsmetode bredt til at skelne mitokondrier fra baggrunden, såsom MitoTracker farvestof eller omladning af fluorescens-smeltet mitokondrielt målretningsprotein (f.eks. mito-GFP)6,7,8. For at analysere sammenhængen mellem rammer, flere algoritmer og softwareværktøjer er blevet beskrevet i tidligere undersøgelser9. I et nyligt papir sammenlignede forskerne fire forskellige automatiserede værktøjer (f.eks. volocity, Imaris, wrMTrck og Difference Tracker) for at kvantificere mitokondriel transport. Resultaterne viste, at på trods af uoverensstemmelser i sporlængde, mitokondriel forskydning, bevægelsesvarighed og hastighed er disse automatiserede værktøjer egnede til vurdering af transportforskellen efter behandling10. Ud over disse værktøjer, en integreret plugin "Makroer" for ImageJ (skrevet af Rietdorf og Seitz) har været meget anvendt til at analysere mitokondriel transport11. Denne metode genererer kymografer, der kan bruges til at analysere mitokondriel bevægelse, herunder hastighed i både anterograde og retrograd retninger.
Mitokondrier er meget dynamiske organeller, der konstant ændrer sig i antal og morfologi som reaktion på både fysiologiske og patologiske tilstande. Mitokondriel fission og fusion stramt regulere mitokondriel morfologi og homøostase. Ubalancen mellem mitokondriel fission og fusion kan fremkalde ekstremt korte eller lange mitokondrielle netværk, som kan forringe mitokondriel funktion og resultere i unormale neuronale aktiviteter og neurodegeneration. Nedsat mitokondrielle transport og morfologi er involveret i forskellige neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, Huntingtons Sygdom, og arvelig spastisk paraplegi (HSP)12,13,14,15. HSP er en heterogen gruppe af arvelige neurologiske lidelser karakteriseret ved degeneration af korticospinaltarmkanalen og efterfølgende manglende kontrol af muskelmuskler i underekstremiteterne16,17. I denne undersøgelse, iPSC-afledte forhjernen neuroner bruges til at vurdere mitokondriel transport og morfologi i HSP. Denne metode giver et unikt paradigme for at undersøge mitokondriel dynamik neuronal axoner i levende kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generation af telencephalic glutamatergic neuroner fra iPSCs
BEMÆRK: Den detaljerede protokol for vedligeholdelse af iPSCs og deres differentiering i telencephalic glutamatergic neuroner svarer til dem, der er beskrevet tidligere18. Her introduceres og fremhæves den kritiske proces under differentieringen af humane pluripotente stamceller.
- Kultur iPSCs på mus embryonale fibroblast (MEF) foderautomater i menneskelige embryonale stamceller (hESC) medium suppleret med fibroblast vækstfaktor (bFGF, 4 ng / ml).
- Efter inkubation med dispase (1 mg/ml) i 3 min. adskilles iPSC'erne i små klumper. Derefter kultur iPSC aggregater i suspension i hESC medium i 4 dage. Se dette tidspunkt, når iPSC'erne starter som suspensionskulturen, som dag 1 (D1). Skift mediet dagligt i 4 dage.
- På D5, indsamle iPSC aggregater efter centrifugering ved 200 x g i 2 min og kultur i neurale induktion medier (NIM) i 3 dage. Kultur cellen aggregater i suspension i 3 dage ved at ændre halvdelen af medierne hver 2 dage. Tilsæt DMH-1 (2 μM) og SB431542 (2 μM) til NIM medium for at øge neuralinduktionseffektiviteten.
- Ved D8 indsamleiPSC aggregater efter centrifugering ved 200 x g i 2 min og lad dem overholde 6 godt plader (ca. 20-30 aggregater per brønd af pladen) ved at posere i NIM med 10% FBS (eller med laminin-belagtplader) natten over. Den følgende dag skal du fjerne det gamle medie og skifte til NIM hver 2.
BEMÆRK: Generationen af neuroepitelceller, som er angivet ved dannelsen af søjleceller med rosetstrukturer, observeres i denne periode. - Ved D17 isoleres de neuroepitelceller i koloniernes centrum mekanisk (løft direkte ved at påføre et lille tryk til koloniernes centrum) eller enzymatisk (behandlet med dispase). De isolerede neuroepitelceller overføres til ikke-behandlet vævskultur T25 kolbe indeholdende 8 ml NIM med tilsætning af B27 (1x), cAMP (1 μM) og IGF (10 ng/ml).
BEMÆRK: Suspensionen kultur gør det muligt for celler at danne neurosfærer, der er beriget med kortikale projektion neurale sår. - Efter D35, plade neurosfærerne på poly-ornithin og LDEV-fri reduceret vækstfaktor kælder membran matrix (Tabel over materialer)-belagt35 mm glas bundretter til at generere telencephalic glutamatergic neuroner (kortikale projektion neuroner). Før plating adskilles neurosfærerne med små klynger ved at inkubere med 1 mg/ml celleløsrivelsesopløsning i 2 min ved 37 °C.
- Fjern celleløsrivelsesopløsningen ved centrifugering og genophæng i 1 ml neuraldifferentieringsmedium (NDM). Pladeceller på glasbundsskålen (ca. fem klynger i 100 μL medium pr. skål) for at lade dem fastgøre. Derefter tilsættes NDM (1 ml pr. skål) og kultur cellerne i NDM, der indeholder B27 (1x), cAMP (1 μM), IGF (10 ng/ml), hBDNF (10 ng/ml) og GDNF (10 ng/ml).
BEMÆRK: Små klynger er belagt, fordi de overlever godt og give anledning til lange projektion neuroner. Alternativt kan celler adskilles og forgyldt ved en tæthed omkring 20.000 celler pr. skål for bedre adskillelse. - Karakterisere telencephalic glutamatergic neuroner ved immunfarvning af Tbr1 og βIII-tubulin markører.
2. Undersøgelse af mitokondriel transport langs axoner af telencephalic glutamatergic neuroner
- Varm NM op, og tænd for rugemaskinen for fluorescensmikroskopet, der er sat til 37 °C og 5% CO2.
- At visualisere mitokondrier langs axoner af forhjernen neuroner, inkubere neuroner med 50 nM rød fluorescerende farvestof til plet mitokondrier i levende celler (f.eks MitoTracker CMXRos) i NDM i 3 min ved 37 °C. Dernæst vaske celler 2x med opvarmet NDM. Neuronerne er inkuberet i NDM.
- For at registrere mitokondrielle transport langs axoner, tage time-lapse billeder af mitokondriel bevægelse ved hjælp af 40x mål med en fluorescens mikroskop.
BEMÆRK: For at stabilisere kulturen skal du udføre levende cellebilleddannelse, når cellerne inkuberes i rugemaskinen i 20 minutter efter mitokondriel farvning. - Under fase felt, identificere axoner baseret på morfologiske egenskaber (direkte komme ud af neuronal celle krop, konstant tynde lange neurites uden forgrening). Mitokondrier bevæger sig i anterograd (fra cellekrop til distale axon) og retrograd retninger (fra axonal terminal til celle krop). For at skelne retningen af mitokondriel bevægelse langs axoner, klart identificere celleorganer af neuroner. I dette trin skal du fokusere axoner under fasefelt for at reducere fotoblegning.
- Efter at have skelnet cellekroppen og øksen justeres eksponeringstiden og fokus for mitokondrier i axoner. Derefter fange transport af mitokondrier i axoner hver 5 s i alt varighed af 5 min, giver 60 billeder. Tilfældigt fange mindst fem steder for hver skål og gentag 3x for hver gruppe.
3. Dataanalyse af mitokondriel transport og morfologi i kortikale neuroner
BEMÆRK: Analysér de indsamlede data om mitokondriel transport ved hjælp af en billedanalysesoftware (f.eks. ImageJ eller MetaMorph19). Da ImageJ er let tilgængelige, udføre analysen af mitokondriel transport og morfologi ved hjælp af ImageJ med MultiKymograph, Makroer,og Analysere partikler plugins.
- Analyse af mitokondriel transport ved hjælp af ImageJ
- Efter at have taget time-lapse billeder af mitokondriel motilitet, analysere hastigheden og bevægelsen af mitokondrier ved hjælp af MultiKymograph plugin. Billederne gemmes som .tiff-formatfiler, som analyseres af Fiji-software efter en tidligere rapporteret metode20.
- Download Fiji-softwaren. Download plugins, der vil være nødvendige for at analysere mitokondriel bevægelse hastighed fra kymographs. Download Bio-formater Pakke og Kymograph Plugin sammen med disse fire .class plugins, herunder: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class, og WalkingAverage.class (Tabel over materialer). Flyt disse filer til Mappen Fiji-plugins. Download "tsp050706.txt" plugins til plugins mappe. Genstart Fiji-softwaren, når filerne flyttes til plugins-mappen.
- Åbn Fiji software. Vælg plugins, og importer derefter billeder af .tiff-serien via Bio-Formats Importør under Bio-Formater. Sørg for at vælge Standard ImageJ i stakvisning, vælg Åbn alle serier, markér Autoskaler, og klik derefter på OK. Vær opmærksom på billedtallet og størrelsen på billeder i pixel, som vises øverst på billedet.
BEMÆRK: Tag 60 billeder pr. billede. - Overvej at gøre billederne klarere ved at justere lysstyrke/kontrast under menuen Billede for alle 60 billeder.
- Højreklik på linjeværktøjet for at vælge segmenteret streg og tegne en segmenteret linje startende fra cellekroppen og slutter ved terminalaxonen. Generer kymografen ved at vælge MultipleKymograph under Plugins. Valget af linjebredde bliver bedt om efter at have valgt multiplekymografen. Sørg for, at dette er et ulige tal. Vælg 1 for stregbredden. En kymograf genereres efter dette trin.
BEMÆRK: Flere vigtige oplysninger kan læses fra kymografen. Kymographs y-akse er varighedens varighed (5 min) for de 60 rammer. X-aksen repræsenterer placeringen af de valgte axoner. - Brug en diagonal linje i kymografen til at bestemme mitokondriernes bevægelsesretning (anterograde, retrograd eller stabil). For eksempel angiver en linje, der går ned til højre langs y-aksen anterograde bevægelse, og en linje, der går ned til venstre langs y-aksen angiver tilbageskridt. En lodret linje indikerer, at der ikke var nogen bevægelse i mitokondrionen.
- Mål afstanden, tidsværdierne og hastigheden for de bevægelige mitokondrier ved hjælp af Macros plugin i Fiji software. Gå til Plugins | Makroer | Installer | tsp050607.txt. Tegn en segmenteret linje over spor af mitokondriel bevægelse på kymografen, og træk altid linjen fra den overlegne til ringere region (y-akse).
- Når du har tegnet linjen, skal du gå til Plugins | Makroer | læse hastigheder fra tsk. Da en segmenteret linje langs sporingen er trukket, plugin læser segmenteret hastigheder svarende til linjen.
BEMÆRK: Enheden for alle data er pixel. dy sum er den tid, der forbruges fra udgangspunktet, og dx sum angiver afstanden af mitokondrion bevæger sig i x-aksen. dy nu og dx viser nu periodetid og bevægelsesafstand for hvert segment, henholdsvis. faktiske hastighed viser hastigheden for hvert segment (dx nu / dy nu). gennemsnitshastighed angiver gennemsnitshastigheden for mitokondriel flytning (dx sum/dy sum). - Skift enheden af dx nu fra pixel til μm som forholdet mellem pixel i μm ved at måle skalabjælken. Konverter enheden til afstand fra pixel til μm ved at måle skalastænger i billeder. Brug stregværktøjet til at tegne en streg langs skalalinjen og måle længden af linjen ved at vælge Målvis under "Analysér. Ændre tiden fra pixel til sekunder, som 1 pixel = 5 sekunder i dette eksperiment.
- I regnearksfilen beregnes den gennemsnitlige hastighed og tilsvarende bevægelse med en nøjagtighed på etiketten eller fortrinsvis. Gennemsnit anterograde eller retrograd bevægelse hastighed.
- Bestemme procentdelen af stationære og motile mitokondrier fra kymografen. Den anterograde eller retrograd bevægelige mitokondrier defineres som at bevæge 5 μm frem eller tilbage fra oprindelsen i hele perioden21. Mitokondrier betragtes som stationære, hvis de ikke bevægede sig mere end 5 μm i løbet af 5 min.
- Analyse af mitokondriel morfologi ved hjælp af ImageJ
BEMÆRK: Bestem mitokondriel morfologi ved at måle mitokondriel længde, område og billedformat ved hjælp af ImageJ. Det kan du gøre ved at følge nedenstående trin.- For at analysere mitokondriel længde og område inden axoner, downloade Straighten_.jar plugin fra ImageJ hjemmeside (se Tabel over materialer)og flytte den til mappen af plugins. Genstart ImageJ-software.
- Åbn billedet via den åbne funktion under Filer, og konverter 32-bitbilledet til 8 bit ved hjælp af Tekst under Billede.
- Tegn en segmenteret linje langs axonerne. Vælg Ret ud under Plugins, og angiv 50 pixel for Bredden af Filament/Wide Line. Dette vil generere en rettet axon.
- Juster tærsklen under Billede, og angiv målingen under Analysér ved at vælge "Område | Omkreds | Fit ellipse | Beskrivelse af figur.
- Mål skaleringslinjen ved hjælp af linjefunktionen, og angiv skalaen under Analysér ved at udfylde afstanden i pixel, den kendte afstandog længdens enhed. Vælg derefter Global for at angive denne skaleringsindstilling.
- Brug Analysér partikler under Analysér til at bestemme området. Promptparametrene er størrelse (pixel^2) = 0,20-uendeligt, cirkularitet = 0,00-1,00 og viser = ellipser. Vælg Vis resultater.
BEMÆRK: Målingen vil give resultaterne af flere mitokondriel morfologi parametre, herunder område, omkreds, længde (større), bredde (mindre), og højde-bredde (AR). Det tilsvarende mitokondrielt tal er også angivet. - Mitokondrielt tal pr. axon (μm) beregnes ved hjælp af mitokondrielle tal divideret med aksonal længde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her blev humane iPC'er differentieret i telencephalic glutamatergic neuroner, som var karakteriseret ved immunfarvning med Tbr1 og βIII tubulinmarkører (figur 1A). For at undersøge den axonale transport af mitokondrier, disse celler blev plettet med rød fluorescerende farvestof, og time-lapse imaging blev udført. Da ImageJ er let tilgængelige og lettere at opnå, mitokondriel transport blev yderligere analyseret med "MultiKymograph" og "Macros" ImageJ plugins, vist i figur 1.
Der er tre respektive tilstande af mitokondriel bevægelse, herunder statisk, anterograde, og retrograd bevægelse (Figur 1B,C). En enkelt mitokondrion kan forblive statisk eller bevæge sig i anterograde eller retrograd retning inden for en axon, og her blev der trukket en segmenteret streg langs sporet af mitokondriel bevægelse for at bestemme hastighed(figur 1D). Hastigheden af mitokondriel bevægelse langs axonerer er vist i figur 1E og svarer til de segmenterede linjer i figur 1D efter læsning af "Makroer" i ImageJ. Svarende til MetaMorph software, ImageJ kan bruges til at bestemme mitokondriel hastighed og procentdel af motile mitokondrier baseret på kymograf genereret af ImageJ (Figur 1F). Ved hjælp af kommercielt tilgængelig analyse software (f.eks MetaMorph), tidligere data viste, at procentdelen af motile mitokondrier blev væsentligt reduceret i SPG3A neuroner i forhold til normale neuroner, mens hastigheden ikke blev ændret19. For at evaluere ImageJ-softwaren blev procentdelen af motile mitokondrier undersøgt, og der blev observeret en tilsvarende reduktion i procentdelen af motile mitokondrier i SPG3A-neuroner sammenlignet med kontrol af vilde neuroner (WT) neuroner(figur 1G).
Med hensyn til analyse af mitokondriel morfologi, mitokondrielområde, længde, og AR blev analyseret ved hjælp af "analysere partikler" funktion i ImageJ. Axons blev rettet ved hjælp af "rette" plugin(Figur 2A,B). Mitokondrier blev klart valgt ved at justere tærsklen (figur 2C,D). Endelig mitokondrielområde, længde (større), bredde (mindre), billedformat, og omkreds blev opnået fra den rettede axon ved hjælp af "Analysér partikler" plugin(Figur 2E,F). Unormal mitokondriel morfologi blev (og har tidligere været) observeret i HSP iPSC-afledte telencephalic glutamatergic neuroner, herunder SPG15 celler (Figur 2G, H,I)13,22. Både mitokondriel længde og billedformat blev reduceret betydeligt i SPG15 neuron axoner i forhold til at kontrollere WT neuron axoner(Figur 2G, H, I).
Figur 1: Analyse af mitokondrielle transport ved hjælp af ImageJ. (A) Immunfarvning viser dannelsen af telencephalic glutamatergic neuroner. Tbr1 (rød), βIII tubulin (grøn) og Hoechst (blå). Skalastænger = 50 μm. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere undersøgelse19. (B) Mitokondriel transport inden for axoner af neuroner. Anterograde mitokondriel bevægelse er defineret som mitokondrier bevæger sig fra cellekroppen til distale axon, og retrograd mitokondriel bevægelse stammer fra den distale axon og strækker sig til neuronal celle kroppen. Segmentlinjen trækkes langs axoner fra neuronal celle krop til distale axonal terminal for at generere kymografer. (C) Kymograph genereres ved hjælp af ImageJ; x-akse er den axonale position, og y-aksen er tid. En kontinuerlig hvid linje er mitokondrionbevæger sig i anterograde retning (pink pilespids), retrograd retning (blå pilespids), eller statisk tilstand (gul pilespids). (D) Den segmenterede linje er trukket til at læse hastigheden ved hjælp af Macros plugin. Tal 1-8 beskriver linjens segment. Anterograde bevægelse (1-4, 6, 8) og statisk tilstand (5, 7) kan skelnes fra denne forstørrede kymograf. (E) Tid og bevægelsesafstand for hvert segment, faktisk og gennemsnitlig hastighed (i pixel). F) Kymograf af mitokondriel transport til WT og SPG3A kortikale PN'er ved hjælp af ImageJ. Skalabjælke = 10 μm. (G) Motile mitokondrielt forhold i WT og SPG3A kortikale PN'er ved hjælp af ImageJ (*p < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse af mitokondriel morfologi ved hjælp af ImageJ. (A) Parametre for glatning af axon. B) Den repræsentative rettede axon. (C,D) Justering af tærskel for at vælge mitokondrier. (E,F) Det målte mitokondrielle område, omkreds, længde (større), bredde (mindre) og billedformat (AR), der svarer til de valgte mitokondrier i (E). (G) Repræsentative billeder af mitokondrier i WT og SPG15 telencephalic glutamatergic neuroner. Skalastænger = 20 μm. (H) Mitokondriel længde i WT og SPG15 neuroner. (I) Billedforhold af mitokondrier i WT og SPG15 neuroner. **p < 0,01 vs. WT. (G), (H) og (I) ændres fra en tidligere undersøgelse13. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Fluorescerende værktøjer | Fordele | Ulemper | Referencer |
| MitoTracker delte et år. | MitoTracker er mitokondriel potentielt-uafhængig og kan bruges til at analysere colokalisering af mitokondrier med autophagosome eller lysosom. | MitoTracker er ikke photostable nok til langsigtet forskning. | 35 |
| NPA-TPP DELTE ET | Dette farvestof er en ny photostable mitokondriel mærkning reagens. | Syntese og rensning proces af dette farvestof er tidskrævende og dyrt. | 23 |
| MitoBADY (MitoBADY) | Dette farvestof kan bruges til mitokondriel visualisering ved hjælp af Raman mikroskopi med høj følsomhed og specificitet. | Brug af dette farvestof kræver Raman mikroskop. | 25 |
| TMRE (TMRE) | Dette farvestof er et ikke-giftigt, specifikt mitokondrielt farvningsfarvestof med lav koncentration og ingen dæmpningseffekt. | TMRE mærkning mitokondrier afhænger af mitokondrielle membran potentiale. | 36, 37 |
| Mitokondrier-målrettede fluorescerende proteiner | Mitokondrier-målrettede fluorescerende proteiner er mere specifikke og stabile. | Denne metode skal omforgængelighed og transfektioneffektivitet er forskellig for forskellige celletyper. | 38, 39 |
Tabel 1: Fordele og ulemper ved nogle fluorescerende værktøjer til mitokondriel mærkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver en metode til at analysere mitokondriel transport og morfologi i neuronal axoner ved hjælp af rød fluorescerende farvestof og ImageJ software, som begge giver en unik platform til at studere axonal degeneration og mitokondriel morfologi i neurodegenerative sygdomme. Der er flere kritiske trin i protokollen, herunder farvning af mitokondrier, levende celle billeddannelse, og analysere billederne. I denne metode blev et fluorescerende farvestof brugt til at plette mitokondrier. Da menneskelige iPSC-afledte neuroner er let løsrevet fra fadet, er det vigtigt at efterlade nogle løsning i fadet og forsigtigt tilføje neurobasal medium. Vasken kan udføres tre eller fire gange for at fjerne farvestoffet. Desuden kan mitokondrier mærkes med andre journalister til at måle deres transport langs axoner, såsom fluorescerende protein smeltet mitokondrier rettet mod proteiner6. I langsigtet sporing, flere sonder (dvs. NPA-TPP, 2,1,3-benzothiadiazole [BTD] fluorescerende derivater, og en specifik Raman sonde) viste stort potentiale i langsigtet mitokondriel sporing og mitokondrielle dynamik analyse23,24,25. Fordele og ulemper ved forskellige sonder findes i tabel 1.
Efter mitokondriel farvning udføres levende cellebilleddannelse ved hjælp af et mikroskop udstyret med en inkubator. For effektivt at fokusere neuronerne under billeddannelse, neurale prøver bør opbevares i 37 °C inkubator med 5% CO2 og i et fugtigt miljø i mindst 15 min. For at minimere de out-of-fokus effekter, billeder på forskellige Z-positioner kan tages for at gøre en Z-stack, eller auto-fokus funktion kan udnyttes. Vigtigt, at identificere retningen af mitokondriel transport (anterograde eller retrograd), fase billeder er taget for at skelne neuronal celle krop og axoner. Et andet kritisk spørgsmål er fotoblegning af fluorescerende prøver, som skal forhindres for at opnå effektive mitokondrielle transport time-lapse billeder. En effektiv metode til at minimere fotoblegning er at fokusere prøver gennem okularet og indstille alle billeddannelse parametre under fase kanalen, bortset fra eksponering tid. Desuden kan det automatiske skaleringsmønster mindske fotoblegning af fluorescens.
Mitokondrier er meget dynamiske organeller og kan bevæge sig i både anterograde og retrograd retninger. I neuroner, et par mitokondrier i axoner holde stille under optagelsen. Blandt de bevægelige mitokondrier, bevægelse status kan variere over tid. Dette fænomen rejser det vigtige spørgsmål, som mitokondrier type betragtes stationær eller bevægende. Dette kan løses ved at fastsætte tærsklen under mitokondriel axonal transportanalyse. For at skelne mellem de statiske mitokondrier brugte Neumann et al. mitokondrielle sporcenter, som defineres som gennemsnitet af dets positionskoordinater over tid, og sæt derefter tærsklen til 350 nm/s, således at den maksimale afvigelsesafstand for mitokondrionen fra sporcentret er i den første ramme26. I en anden undersøgelse, forfatterne sat 50 nm / s som tærsklen for at skelne stationære status fra den bevægelige status27. Der blev anvendt en tærskel på 300 nm/s til at skelne mellem den mikrotubulebaserede transport som i tidligere rapporter28,29. Selv om tærsklen for stationære og bevægelige mitokondrier er anderledes, kan fastsættelsen af tærsklen give vigtige relative oplysninger om mitokondriel bevægelse inden for axoner mellem vilde og degenerative neuroner.
De fleste protokoller, der involverer mitokondrielle transportanalyse har brugt kymograms, som er to-dimensionelle repræsentation af positioner versus tid. Der er udviklet flere automatiserede værktøjer til analyse af partikelsporing26,30,31,32,33,34. Disse kan præcist adskille hver ramme. Ud over den hastighed og motile procent, imagej kan måle, kan denne metode måle motile begivenheder præcist. Men disse er ikke gratis at bruge. Her blev analysen af mitokondriel transport udført ved hjælp af ImageJ med "Multikymograph" og "Macros" plugins. Disse plugins kan effektivt måle mitokondriel bevægelse. Fordelen ved disse plugins er deres brugervenlighed og evne til at angive ændringer i mitokondriel axonal transport i form af kymographs og hastighed over tid.
Motile mitokondrier blev analyseret i SPG3A og kontrollere neuroner. En lignende reduktion i procentdelen af motile mitokondrier blev observeret ved hjælp af to forskellige analysemetoder, der bekræfter nytten af ImageJ til at analysere axonal transport. Desuden kan mitokondriel morfologi analyseres ved hjælp af det samme sæt af billeder, som giver vigtige udlæsninger til at studere mitokondriel dysfunktion i forskellige neurologiske sygdomme. Da axonal degeneration og mitokondriel dysfunktion normalt opstår i tidligere faser, før neuroner dør, denne metode kan bruges til at undersøge tidlige patologiske ændringer for at hjælpe med at identificere molekylære veje og skærm terapi til at redde neurodegeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Spastic Paraplegia Foundation, Blazer Foundation og NIH (R21NS109837).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L.
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L.
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H.
