Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Fruchtwassermembran, um deren Heterogenität und funktionelle Eigenschaften für eine mögliche Anwendung in klinischen und physiopathologischen Modellen zu bestimmen.
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Methodenartikel
In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In der Literatur wurden mehrere Protokolle zur Isolierung und Kultur menschlicher Fruchtwasserepithelzellen (HAEC) berichtet. Diese gehen jedoch davon aus, dass es sich bei dem Fruchtioziumepithel um eine homogene Schicht handelt. Das menschliche Amnion kann in drei anatomische Regionen unterteilt werden: reflektiert, Plazenta und Nabel. Jede Region hat unterschiedliche physiologische Rollen, z. B. in pathologischen Bedingungen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um menschliches Amniongewebe in drei Abschnitten zu sezieren und in vitro zu pflegen. In der Kultur zeigten Zellen, die aus dem reflektierten Amnion abgeleitet wurden, eine quakodeale Morphologie, während Zellen aus Plazenta- und Nabelregionen plattenförmig waren. Nichtsdestotrotz haben alle erhaltenen Zellen einen epitheliale Phänotyp, der durch die Immundetektion von E-Cadherin nachgewiesen wird. Da sich die Plazenta- und reflektierten Regionen vor Ort in zellulären Komponenten und molekularen Funktionen unterscheiden, kann es daher für In-vitro-Studien notwendig sein, diese Unterschiede zu berücksichtigen, da sie physiologische Auswirkungen auf die Verwendung von HAEC in biomedizinische Forschung und die vielversprechende Anwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin.
Einleitung
Menschliche Fruchtiotische Epithelzellen (HAEC) entstehen in den frühen Stadien der embryonalen Entwicklung, etwa acht Tage nach der Befruchtung. Sie entstehen aus einer Population von Plattenepithelzellen des Epiblasts, die sich aus der innersten Schicht der Fruchtwassermembran1ableiten. So gelten HAEC als Reste pluripotenter Zellen aus dem Epiblast, die das Potenzial haben, sich in die drei Keimschichten desEmbryos 2zu differenzieren. In den letzten zehn Jahren haben verschiedene Forschungsgruppen Methoden entwickelt, um diese Zellen aus der Fruchtwassermembran zum Term der Trächtigkeit zu isolieren, um ihre mutmaßlichen pluripotenzbedingten Eigenschaften in einem Kulturmodell in vitro3,4zu charakterisieren.
Dementsprechend wurde festgestellt, dass HAEC-Merkmale, die für humane pluripotente Stammzellen (HPSC) charakteristisch sind, wie die Oberflächenantigene SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; der Kern der Pluripotenz-Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2 und NANOG; und der Proliferationsmarker KI67, was darauf hindeutet, dass sie sich selbsterneuern5,6,7. Darüber hinaus wurden diese Zellen mit Differenzierungsprotokollen herausgefordert, um Zellen positiv für linienspezifische Marker der drei Keimschichten (Ektoderm, Mesoderm und Endoderm)4,5,8, sowie in Tiermodellen menschlicher Krankheiten zu erhalten. Schließlich, HAEC Express E-Cadherin, die zeigen, dass sie eine epitheliale Natur ähnlich wie die HPSC5,9behalten.
Abgesehen von ihrem embryonalen Ursprung haben HAEC andere intrinsische Eigenschaften, die sie für verschiedene klinische Anwendungen geeignet machen, wie die Sekretion von entzündungshemmenden und antibakteriellen Molekülen10,11, Wachstumsfaktoren und Zytokinfreisetzung12, keine Bildung von Teratomen, wenn sie in immundefizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizide Mäuse im Gegensatz zu HPSC2transplantiert werden, und immunologische Toleranz, weil sie HLA-G ausdrücken, was das Risiko der Abstoßung nach Transplantation13.
Frühere Berichte gingen jedoch davon aus, dass das menschliche Amnion eine homogene Membran ist, ohne zu berücksichtigen, dass es anatomisch und physiologisch in drei Regionen unterteilt werden kann: Plazenta (das Amnion, das die Decidua basalisbedeckt), Nabel (der Teil, der die Nabelschnur umschließt) und reflektiert (der Rest der Membran nicht an der Plazenta befestigt)14. Es wurde gezeigt, dass die Plazenta- und reflektierten Regionen des Amnion Unterschiede in der Morphologie, mitochondrialen Aktivität, Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies15, miRNA-Expression16und Aktivierung von Signalwegen17zeigen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das menschliche Amnion von einer heterogenen Population mit unterschiedlicher Funktionalität integriert wird, die für weitere Studien in In-situ- oder In-vitro-Modellen in Betracht gezogen werden sollte. Während andere Laboratorien Protokolle für die Isolierung von HAEC von der gesamten Membran entwickelt haben, hat unser Labor ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und Charakterisierung von Zellen aus verschiedenen anatomischen Regionen erstellt.
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Protokoll
Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission des Instituto Nacional de Perinatologa in Mexiko-Stadt (Registernummer 212250-21041) gebilligt. Alle in diesen Studien durchgeführten Verfahren entsprachen den ethischen Standards des Instituto Nacional de Perinatologa, der Erklärung von Helsinki und den Leitlinien des offiziellen mexikanischen Standards des Gesundheitsministeriums.
1. Vorbereitung
- Bereiten Sie eine Lösung von 1x PBS mit EDTA vor. Fügen Sie dazu 500 l 0,5 M EDTA-Bestand in 500 ml 1x PBS für eine Endkonzentration von 0,5 mM EDTA hinzu.
- Bereiten Sie das Kulturmedium für HAEC vor. Nehmen Sie 450 ml hochglucose-DMEM, ergänzen Sie es mit 5 ml Natriumpyruvat (100 mM), 50 ml hitzeinaktivem fetalem Rinderserum, das für Stammzellen qualifiziert ist, 5 ml nicht essentieller Aminosäuren (100x), 5 ml Antibiotikum (100x), 5 ml L-Glutamin (200 mM) und 500 l Mercaptoethanol (1.000x).
- Sterilisieren Sie die Behälter für den Transport und die Verarbeitung des Gewebes: ein Edelstahlbehälter mit Deckel, um die gesamte Plazenta vom Operationssaal zum Labor zu transportieren, ein Tablett (20 cm x 30 cm x 8 cm), um Blut vor der ganzen Plazenta zu waschen und zu entfernen die Zerlegung der Fruchtwassermembran und ein Kunststoff-Schneidebrett, um die Fruchtwassermembran in die drei Regionen zu trennen.
- Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente (Skalpelle, Scheren, Zangen und Klemmen), 500 ml Becher, Baumwoll-Gauzunden und Eine Saline-Lösung.
2. Erhalt von Plazentagewebe
HINWEIS: Die Fruchtwassermembranen wurden von Frauen bei vollwertiger Trächtigkeit (37 bis 40 Wochen) unter Angabe der Kaiserschnitt-Entbindung ohne Anzeichen einer aktiven Arbeit und ohne mikrobiologische Infektionsmerkmale gewonnen. Die vollständigen Isolations- und Kulturverfahren wurden in einem Biosicherheitskabinett unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
- Klemmen Sie im Operationssaal die Nabelschnur, um den Blutfluss zum Rest des Gewebes zu verhindern. Sammeln Sie die gesamte Plazenta mit der Nabelschnur, die im sterilen Behälter eingeklemmt ist.
- Fügen Sie 500 ml Salinelösung in den Behälter, um die Plazenta zu hydratisieren.
- Schließen Sie den Behälter und transportieren Sie das Gewebe bei Raumtemperatur ins Labor.
- Legen Sie den Behälter mit der Plazenta in den Biosicherheitsschrank.
HINWEIS: Falls die Zerlegung nicht innerhalb von 15 min nach dem Sammeln der Plazenta durchgeführt wird, lagern Sie den Behälter mit der Plazenta auf Eis bis zur Verarbeitung. Vermeiden Sie mehr als 1 h verstrichene Zeit zwischen dem Erhalt der Plazenta und dem Beginn der Zerlegung.
3. Mechanische Trennung pro Bereich der Fruchtwassermembran
HINWEIS: Das Verfahren muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen und bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
- Entfernen Sie die gesamte Plazenta aus dem Behälter und legen Sie sie auf das Tablett mit der Nabelschnur nach oben.
- Reinigen Sie die Blutgerinnsel mit einer sterilen Baumwollgaze von der Oberfläche des Chorion-Amnions, das die Plazenta bedeckt.
- Identifizieren Sie die drei Regionen der Membran: das Nabelam, das die Nabelschnur umhüllt, die Plazenta-Amnion, die die Decidua basalis bedeckt, und die reflektierte Region, die der Rest des Amnions ist, das nicht an der Plazenta befestigt ist (Abbildung 1).
- Sezieren Sie die Nabelamnionregion (Abbildung 2A).
- Halten Sie mit Sezieren von Zangen den Teil der Amnionmembran, der die Kreuzung von Plazenta und Nabelschnur bedeckt.
- Mit einem Skalpell sezieren Sie die Region, die die Schnur umgibt, während Sie sich strecken, um sie vom Chorion zu trennen.
- Legen Sie das abgetrennte Gewebe in einem markierten Becher mit 100 ml Salinelösung ab.
- Sezieren Sie die Plazenta-Amnion-Region (Abbildung 2B).
- Mit einer sterilen Baumwollgaze, entfernen Sie die Blutgerinnsel von der Oberfläche des Chorion-Amnion, das die Plazenta bedeckt.
- Halten Sie die Membran an der Grenze zwischen der Plazenta und der reflektierten Region mit sezierenden Zangen.
- Schneiden Sie entlang des Umfangs der Plazenta mit dem Skalpell.
- Trennen Sie die Plazenta Amnion von der Chorion, achten Sie darauf, keine Gefäße aus der Plazenta zu schneiden.
- Legen Sie das abgetrennte Gewebe in einen anderen beschrifteten Becher mit 300 ml Salinelösung.
- Trennen Sie den Rest der Fruchtwassermembran, die nicht an der Plazenta (d. h. dem reflektierten Teil) befestigt ist, von der Choreographie (Abbildung 2C).
- Sammeln Sie die reflektierte Region in einem anderen beschrifteten Becher mit 300 ml Saline-Lösung.
HINWEIS: Fügen Sie während der Zerlegung kontinuierlich eine Salinelösung hinzu, um das Austrocknen des Gewebes zu verhindern.
- Sammeln Sie die reflektierte Region in einem anderen beschrifteten Becher mit 300 ml Saline-Lösung.
4. Waschen der Membranen
HINWEIS: Das Verfahren muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
- Entsorgen Sie die Salinelösung jedes Membranbereichs separat.
- Fügen Sie 100 ml frische Salinelösung in die Nabelregion.
- Fügen Sie 300 ml frische Salinelösung in die Plazenta- bzw. reflektierten Regionen ein.
- Rühren Sie die Membranen mit Hilfe von Sezieren Zangen, um Blutrückstände zu entfernen.
- Entsorgen Sie die Saline-Lösung.
- Wiederholen Sie die Wässer und die Rührung mindestens 3x, bis die Membranen durchscheinend sind.
- Legen sie die Membranen auf das Brett und verlängern Sie sie, um die Blutgerinnsel, die nicht mit den Wässen entfernt wurden, mit sterilem Gaze zu reinigen.
HINWEIS: Es ist sehr wichtig, so viele Erythrozyten wie möglich zu entfernen, da ihre Anwesenheit die Trypsin-Funktion und die Lebensfähigkeit nachfolgender Zellkulturen beeinflusst.
5. Enzymatische Verdauung der Membranen aus verschiedenen Regionen
HINWEIS: Das Verfahren muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
- Schneiden Sie die reflektierten und plazentten Bereiche in zwei oder drei Fragmente.
- Schneiden Sie nicht die Nabelregion.
- Platzieren Sie die Fragmente jeder Region in Zentrifugenrohren. Fügen Sie 20 ml 0,5% Trypsin/EDTA zu den reflektierten und plazentaregionen und 5 ml mit 0,5% Trypsin/EDTA in die Nabelregion ein.
HINWEIS: Es ist wichtig, die reflektierten und plazentten Bereiche in kleinere Stücke zu schneiden, da sie vollständig in die Trypsin-Lösung eingetaucht werden müssen. - Die Zentrifugenrohre 30 s leicht schütteln. Trypsin entsorgen.
- Fügen Sie 30 ml neues 0,5% Trypsin/EDTA zu den reflektierten und plazentaregionen und 15 ml neuer 0,5% Trypsin/EDTA in die Nabelregion ein.
- Legen Sie die Rohre in einen Rotator im Inkubator.
- Inkubieren mit Drehung (20 Rpm) für 40 min bei 37 °C.
HINWEIS: Wenn kein Rohrrotator verfügbar ist, schütteln Sie die Rohre alle 10 min leicht manuell. - Übertragen Sie die Trypsin/Zelllösungen aus jeder Region in neue Zentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 2x das Volumen der HAEC-Medien bei 37 °C pro Tube vorgewärmt, um das Enzym zu inaktivieren.
- Die erste Verdauung auf Eis aufbewahren.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.6 x 5.8 für eine zweite Verdauungsphase.
- Halten Sie für jede Region ein Ende des Amnion-Anteils mit Sezieren von Zangen und mit einem anderen Paar, das entlang des Gewebes drückt, um Reihen von Epithelzellen zu entfernen, die sich während früherer Inkubationsperioden nicht vollständig abblätterten.
- Sammeln Sie die zweite Verdauung in einen anderen Satz zentrifugenröhren und inaktivieren Sie mit 2x dem Volumen von HAEC-Medien.
- Entsorgen Sie die verdauten Membranen in einen Biogefährdungsbehälter.
6. Isolierung des HAEC
HINWEIS: Das Verfahren muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
- Zentrifugieren Sie alle Rohre bei 200 x g für 10 min bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml vorgewärmte HAEC-Medien (bis 37 °C) pro Rohr und Pipette sanft hinzu, um jedes Pellet zu disaggregieren.
- Kombinieren Sie die zellulären Suspensionen der beiden Verdauungen in einer einzelnen Röhre für jede Membranregion.
- Filtern Sie die zellulären Suspensionen mit 100 m Zellsieben, um den extrazellulären Matrixmüll zu entfernen und einzelne Zellen zu erhalten.
- Bereiten Sie drei Aliquots mit 90 l Trypanblau in einem Mikrozentrifugenrohr vor.
- Fügen Sie 10 l jeder Zellsuspension pro Membranregion in die Mikrozentrifugenröhrchen ein und mischen Sie sie.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer unter einem Lichtfeldmikroskop.
7. Kultur der HAEC
- Säen Sie die HAEC aus den drei Regionen getrennt mit einer Dichte von 3 x 104 Zellen/cm2 mit vorgewärmten HAEC-Medien, ergänzt durch 10 ng/ml des humanen epidermalen Wachstumsfaktors (EGF).
- Säen Sie die Zellen in 100 mm Platten, um sie in vitro oder in 24 Brunnenplatten für die immunchemische Analyse zu halten.
- Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 °C unter normoxischen Bedingungen (5%CO2) in einem befeuchteten Inkubator.
- Fügen Sie eGF täglich hinzu und wechseln Sie das Medium jeden dritten Tag.
HINWEIS: Die Zellen werden nach 4 bis 6 Tagen konfluent. - Verwenden Sie die Zellen für die konventionelle Immunhistochemie, Zellsortierungsanalyse, Kryokonservierung, RNA- und Proteinextraktion oder um den Durchgang fortzusetzen.
8. Passage von HAEC
- Entfernen Sie das HAEC-Medium und waschen Sie 2x mit PBS/EDTA 0.01M Lösung.
- Inkubieren Sie mit einer PBS/EDTA 0,01M Lösung für 15 min bei 37 °C.
- Entfernen Sie die PBS/EDTA und fügen Sie 1,5 ml 0,5% Trypsin/EDTA hinzu.
- 5 x 8 min bei 37 °C inkubieren.
- Inaktivieren Sie das Enzym mit zwei Bänden HAEC-Medien.
- Sammeln Sie die gemischte Lösung und Zentrifuge für 5 min bei 200 x g.
- Zählen Sie die Zellen und fahren Sie mit folgenden Passagen fort oder verwenden Sie die Zellen für die weitere Analyse.
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Ergebnisse
HAEC wurden aus jedem der drei anatomischen Regionen der Fruchtwassermembran isoliert und in vitro einzeln kultiviert. Nach 48 h Kultur hafteten Zellen mit einem epithelialen Phänotyp an der Oberfläche der Platte, obwohl die Medien auch Zellablagerungen und schwimmende Zellen enthielten, die nach der Änderung des Mediums entfernt wurden(Abbildung 3).
Während der Verarbeitung der Primärkultur (Durchgang Null, P0) können einige Komplikationen auftreten, die die expe...
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Diskussion
Wir haben ein neues Protokoll implementiert, um HAEC von Termmembranen zu isolieren. Es unterscheidet sich von früheren Berichten dadurch, dass jede Membran vor der Isolierung in ihre drei anatomischen Bereiche unterteilt wurde, um Zellen von jedem zu analysieren.
Einer der kritischsten Schritte im Protokoll ist das Waschen der Membran, um alle Blutgerinnsel zu entfernen, da sie die Aktivität von Trypsin bei der Trennung der Epithelzellen stören können. Wenn dieser Schritt nicht ordnungsgemäß ...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Unsere Forschung wurde durch Stipendien des Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 und 21081) und CONACYT (A1-S-8450 und 252756) unterstützt. Wir danken Jessica Gonzalez Norris und Lidia Yuriria Paredes Vivas für die technische Unterstützung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Culture Reagenzien | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| tierversuchsfrei rekombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotikum-Antimykotikum | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Ergänzt mit hohem Glukose- und HEPESGEHALT |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0,5 M |
| embryonale Stammzellen FBS, qualifiziert | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| nicht-essentielle Aminosäuren | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyd | jede Marke | ||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Kochsalzlösung (Natriumchlorid 0,9%) | jede Marke | ||
| Natriumpyruvat | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0,05 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Einwegmaterial | |||
| 100 & Mikro; m Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-behandelte Kulturschale | Corning | 430167 | |
| 24-Well-Clear-TC-behandelte Multi-Well-Platten | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-Well-Clear-TC-behandelte Multi-Well-Platten | Corning/Costar | 3516 | |
| Nicht-pyrogenes steriles Zentrifugenröhrchen | jeder Marke | mit konischen unten | |
| Pyrogenfreie sterile Spitzen von 1.000 &; Mikro; L, 200 &Mikro; l und 10 µl. | |||
| Sterile Baumwollgaze | |||
| Sterile serologische Pipetten von 5, 10 und 25 ml | jeder Marke | ||
| Sterile OP-Handschuhe | jeder Marke | ||
| Ausrüstung | |||
| Biologische Sicherheitswerkbank | |||
| Zentrifuge | |||
| Mikropipetten | |||
| Motorisierter Pipettenfüller/-spender | |||
| Sterile Becher von 500 mL | |||
| Steriles Schneidebrett | |||
| Sterile Skalpelle, Scheren, Pinzetten, Klemmen | |||
| Steriler Behälter | |||
| Steriles Tablett | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antikörper und Kits | Antikörper-ID | ||
| Anti-E-Cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | AB19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Zellsignalisierung | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Zellsignalisierung | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
Referenzen
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