NF-B-abhängige Luziferase-Aktivierung und Quantifizierung der Genexpression in Salmonellen-infizierten Gewebekulturzellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen und einfachen Messung des Kernfaktors Kappa-Light-Chain-Enhancer der aktivierten B-Zellen(NF-B)-Aktivierung in Zelllinien vor, die NF-B::luciferase-Reporterkonstrukte über Messungen der Lumineszenz im Zelllysat exezieren. Zusätzlich wird die Genexpression über RT-qPCR bestimmt, isoliert aus Zellen, die mit Salmonella Typhimurium infiziert sind.

Zusammenfassung

Der dimerische Transkriptionsfaktor NF-B reguliert viele zelluläre Reaktionswege, einschließlich entzündungshemmender Bahnen, indem er die Expression verschiedener Zytokine und Chemokine induziert. NF-B wird konstitutiv exprimiert und im Zytosol durch den hemmenden Protein-Kernfaktor kappa light polypeptide gen enhancer in B-Zellen-Inhibitor, Alpha (I-B) sequestriert. Die Aktivierung von NF-B erfordert die Degradierung von I-B, das dann ein nukleares Lokalisierungssignal auf NF-B aussetzt und seinen Handel mit dem Kern fördert. Einmal im Kern, NF-B bindet an die promotorische Region von NF--B Zielgene wie Interleukin 6 (IL-6) und IL-23, um ihre Expression zu fördern.

Die Aktivierung von NF-B erfolgt unabhängig von Transkription oder Übersetzung. Daher muss der Aktivierungszustand von NF-B entweder durch Quantifizierung von NF-B speziell im Kern oder durch Quantifizierung der Expression von NF-B-Zielgenen gemessen werden. In diesem Protokoll werden Zellen, die mit einem NF-B::luciferase-Reporterkonstrukt stabil transfiziert wurden, für die NF-B-Aktivierung mit In-vitro-Gewebekulturtechniken untersucht. Diese Zellen sind mit Salmonella Typhimurium infiziert, um NF-B zu aktivieren, das an den Zellkern verkehrt und an die Standorte in der Promotorregion der Luziferase bindet, was seine Expression induzieren. Die Zellen werden lysiert und mit dem Luziferase-Assay-System analysiert. Die von den Zellen erzeugte Luziferasemenge korreliert mit der Intensität des Lumineszenzsignals, das von einem Plattenleser erkannt wird. Das durch dieses Verfahren erzeugte Lumineszenzsignal bietet eine schnelle und hochempfindliche Methode, um die NF-B-Aktivierung unter einer Reihe von Bedingungen zu bewerten. Dieses Protokoll verwendet auch quantitative Reverse-Transkription PCR (RT-qPCR), um relative mRNA-Spiegel zu erkennen, die auf die Genexpression hinweisen.

Einleitung

Die Proteinfamilie des Kernfaktors (NF-B) ist ein wichtiger Transkriptionsaktivatoren, der die Genexpression in verschiedenen biologischen Bahnen reguliert. Die Aktivierung von NF-B induziert die Transkription von Zielgenen, von denen viele wichtig für Immun- und Entzündungsreaktionen, Zellproliferation, Stressreaktionen und Krebsprogression^1,2sind. NF-B spielt eine wesentliche Rolle bei der Vermittlung von frühen entzündlichen Ergebnissen für die Errekung von Krankheitserregern. Angesichts der vielen biologischen Prozesse, die durch die NF-B-Aktivierung vermittelt werden, können Störungen in ihrer Signalisierung schwerwiegende Folgen für Gesundheit und Krankheit haben. Der Verlust von Funktionsmutationen in der NF-B-Signalisierung ist in mehreren Immunschwäche-Phänotypen verbunden, während die Verstärkung von Funktionsmutationen mit verschiedenen Krebsarten verbunden ist, einschließlich B-Zell-Lymphomen und Brustkrebs³. Darüber hinaus haben viele Krankheitserreger gezeigt, dass sie den Aktivierungszustand von NF-B direkt durch Expression von Virulenzfaktoren^4,5,6,7modulieren.

Die Aktivierung von NF-B ist bekanntlich eine Folge vieler variabler Reize, einschließlich bakterieller Produkte wie Lipopolysaccharide (LPS), Flagellin und Peptidoglykanen, die als pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) bekannt sind. Diese PAMPs werden von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) wie den Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und Nod-like Receptors (NLRs) detektiert, was zur Aktivierung von NF-B und der anschließenden Expression einer Reihe von NF-B-abhängigen Genen führt, die entzündlich⁸. Zusätzlich zur PRR-Aktivierung durch PAMPs können andere bakterielle Produkte, wie bakterielle Effektorproteine, die Aktivierung von NF-B induzieren. Interessanterweise drücken Bakterien auch Effektorproteine aus, die den NF-B-Signalweg aktiv dämpfen und ihre Pathogenität verbessern, was die Bedeutung von NF-B als wesentlicher Vermittler der Immunität⁹unterstreicht.

Es gibt fünf verschiedene Untereinheiten, die die NF-B-Dimere bilden; p50, p52, RelA (p65), RelB und cRel. Die beiden Haupt-NF-B-Heterodimere sind die p50:RelA- und die p52:RelB-Dimere. Die aktivierten NF-B-Dimere binden an DNA-Sites, sogenannte B-Sites, in den Promotor- und Enhancer-Regionen verschiedener Zielgene. Unter normalen panostatischen Bedingungen interagiert NF-B mit einer Familie von Inhibitorproteinen, die als I-B-Proteine bekannt sind, um inaktiv zu bleiben. Bei der Stimulation wird I-B durch die I-B-Kinase (IKK) phosphoryliert, wodurch es möglich ist, sie für die Ubiquitination und anschließende Degradation gezielt zu machen. Die Degradation von I-B aktiviert NF-B, indem ein nukleares Lokalisierungssignal aufgedeckt wird. NF-B transloziert dann in den Kern, wo es die Standorte in der Promotorregion der Zielgene bindet und die Transkription¹⁰fördert. So reguliert die Aktivierung von NF-B die mRNA-Expression von NF-B-Zielgenen, und diese Veränderung kann durch RNA-Quantifizierungstests wie RT-qPCR¹¹gemessen werden.

Es gibt mehrere Methoden, die häufig für die Messung der NF-B-Aktivierung verwendet werden, einschließlich elektrophoretischer Mobilitätsverschiebungstests (EMSA), Nukleartranslokation und Genreporter-Assays. EMSA wird verwendet, um Proteinkomplexe mit Nukleinsäuren zu erkennen. Stimulierte Zellen werden fraktioniert, um Kernproteine zu isolieren, einschließlich der translozierten NF-B, die dann mit radioaktiv markierten Nukleotiden inkubiert wird, die die NF-B-Bindungsdomäne enthalten. Die Proben werden auf einem Gel ausgeführt und durch Autoradiographie von ³²P-markierter Nukleinsäure abgebildet. Wenn NF-B in der Proteinfraktion vorhanden ist, bindet es die Nukleotide, die langsamer durch das Gel wandern und als diskrete Bänder präsentieren. Kernfraktionen von Zellen ohne aktivierte NF-B (z. B. unstimulierte Kontrollzellen) erzeugen keine Bänder, da die Nukleotide schneller bis zum Ende des Gels wandern. Ein großer Nachteil dieser Methode ist, dass sie weitgehend quantitativ im binären Sinne (d. h. ein- oder ausgeschaltet) ist und keine signifikanten Unterschiede in der NF-B-Bindungskapazität ausreichend erfasst. Darüber hinaus berücksichtigt diese Methode keine Chromatinstrukturen, die für NF-B-Zielgene^12,13funktionell wichtig sind.

Ähnlich wie bei der vorherigen Methode gibt es einen "Nicht-Shift"-Assay, bei dem Multiwell-Platten mit Nukleotiden beschichtet sind, die die NF-B-Bindungssequenz enthalten. Nach der Behandlung von Zellen mit kernnuklearen Proteinfraktionen bindet NF-B an die an den Brunnen gebundenen Nukleotide. Anschließend werden Anti-NF--B-Antikörper hinzugefügt, die mit dem gebundenen NF-B interagieren und ein kolorimetrisches Signal erzeugen, das proportional zur NF-B-Menge ist, was den Grad der NF-B-Aktivierung angibt. Dieses Verfahren ist gegenüber der EMSA insofern vorteilhaft, als es keine radioaktiv markierten Nukleinsäuren benötigt und im Vergleich quantitativ ist. Ein Vorbehalt dieser Methode ist jedoch, dass sie wiederum nicht zwischen Chromatinzuständen von NF-B-Zielgenen¹⁴unterscheidet.

Eine weitere Methode, bei der die NF-B-Aktivierung nachgewiesen werden kann, ist die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), bei der DNA und interagierende Proteine mit Formaldehyd vernetzt und mit spezifischen Anti-NF-B-Antikörpern immunpräzipiert werden. Die spezifischen Nukleotidfragmente werden dann gereinigt und durch PCR-Verstärkung oder direkte Sequenzierung mit hohem Durchsatz identifiziert. Die ergebnissedieser Methode liefern semiquantitative Ergebnisse der NF-B-Bindungsaktivität mit Zielgenen. Die Ergebnisse sind jedoch in hohem Maße von den Fixierungsbedingungen und Reinigungsprozessen bei jedem Schritt¹⁵abhängig.

In nuklearen Translokationstests werden Zellen stimuliert, um die NF-B-Aktivierung zu induzieren, und dann fixiert. Anti-p65-Antikörper werden festen Zellen zugesetzt. Alternativ kann die unterkundliche Einheit p65 selbst mit einem fluoreszierenden Peptid wie grünem Fluoreszenzgrün (GFP) markiert werden. In beiden Fällen ermöglicht die Immunfluoreszenz die Abbildung der Lokalisation von p65, um die Zellverteilung zu bestimmen. Durch die Messung des Anteils des zytosolischen und nuklearen lokalisierten Proteins können die Forscher den relativen Aktivierungszustand von NF-B bestimmen. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass die Immunfluoreszenz vergleichsweise zeitaufwändig ist, teure Antikörper erfordert und relativ mehr technisches Know-how benötigt¹⁶.

Reportergene sind häufig verwendete Werkzeuge, um die Regulierungs- und Expressionsmuster eines Gens von Interesse zu untersuchen. Typischerweise werden Reportergene aus der Promotorsequenz eines Gens von Interesse konstruiert, das zu einem Gen verschmolzen wird, das für ein leicht nachweisbares Protein kodiert. Proteine mit enzymatischen Aktivitäten, Fluoreszenz- oder Lumineszenzeigenschaften werden häufig aufgrund ihrer Fähigkeit, untersucht und quantifiziert zu werden, ausgewählt. Somit dient das Auslesen (z.B. Lumineszenz, Fluoreszenz) als Signal zum Nachweis der Genexpression. Diese Reporterkonstrukte können dann in verschiedene Zelltypen eingeführt werden, z. B. Epithelzellen oder Makrophagen.

Beschrieben im Protokoll ist die Verwendung einer geklonten HeLa-Zelllinie (HeLa 57A), die mit einem Luziferase-Reporter, der drei Kopien des C-Konsens der Immunglobulin-Kette-Promotorregion enthält, stabil transfiziert wird¹⁷. Die Expression der Luziferase ist abhängig von der Aktivierung von NF-B, die nach der Zellstimulation erfolgt. Stimulierte Zellen lassen sich leicht mit dem Zelllysepuffer lysiert, der im Luziferase-Assay-Kit bereitgestellt wird. Ein Teil des Zelllysats wird dann mit luziferase Assay Puffer gemischt, die Luziferin enthält. Luziferin ist das Substrat der Luziferase und wird für die Erzeugung von Licht in Gegenwart von Luziferase erforderlich. Nach der Kombination des Assaypuffers mit dem Lysat wird die Lösung Licht in einem Prozess aussenden, der als Lumineszenz bekannt ist. Die in Lumen angegebene Lichtmenge ist proportional zur im Lysat vorhandenen Luziferasemenge und dient als Maß für die NF-B-Aktivierung. Die Lumenwerte werden im Vergleich zu einem nicht stimulierten Standard interpretiert, um die Basisaktivität von NF-B zu berücksichtigen, und das Signal selbst ist für mehrere Minuten stabil, um eine zuverlässige Messung zu ermöglichen. Darüber hinaus wird die HeLa 57A-Zelllinie stabil mit einem NF--unabhängigen -galactosidase-Reporter transfiziert. Der Reporter von '-galactosidase wird konstitutiv ausgedrückt, und die Aktivität von 'galactosidase kann gemessen werden, um die Zelllebensfähigkeit oder Variation der Zellzahlen¹⁷zu kontrollieren. Die Luziferase-Werte können dann an die Werte von '-galactosidase angepasst und als Faltenanstieg über die unstimulierten Kontrollzellen gemeldet werden.

Da NF-B ein Transkriptionsfaktor ist, der für die erhöhte Expression von NF-B-abhängigen Zielgenen verantwortlich ist, ist ein Folgeexperiment zur Kontrolle der NF-B-abhängigen erhöhten Genexpression die quantitative Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion ( RT-qPCR). RT-qPCR ist eine hochempfindliche Methode, mit der Veränderungen in der Genexpression über mehrere Größenordnungen quantifiziert werden können. Stimulierte und Kontrollzellen werden für RNA über die Phenol-Chlor-Extraktion geerntet. Nach der Phasentrennung wird RNA als Hauptbestandteil der wässrigen Schicht extrahiert. DIE RNA wird dann ausgefällt und gewaschen, um ein reines Pellet zu produzieren. Dieses Pellet wird dann rekonstituiert und durch DNase-Behandlung weiter von der Schadstoff-DNA gereinigt. Die reine RNA wird dann umgekehrt transkribiert, um komplementäre DNA (cDNA) zu erzeugen. Diese cDNA kann dann durch quantitative PCR-Techniken analysiert werden, bei denen die Häufigkeit einer bestimmten mRNA-Sequenz quantifiziert wird, um die Genexpression zu bestimmen. Diese Technik erhellt keine translationale Kontrolle, posttranslationale Modifikation, Proteinüberfluss oder Proteinaktivität. Viele Gene, insbesondere solche, die an entzündungshemmenden Prozessen beteiligt sind, werden jedoch über NF-B reguliert und ihre mRNA-Fülle ist bezeichnend für ihre Expression.

Die hier vorgeschlagene Methode nutzt eine schnelle und einfache Möglichkeit, mit der die NF-B-Aktivierung über Lumineszenz-Assays von zellulärem Lysat erkannt werden kann. RT-qPCR der NF-B-Zielgenexpression kann verwendet werden, um die Expression bestimmter Gene zu quantifizieren und die funktionelle Aktivität der NF-B-Aktivierung zu validieren. Die Hauptvorteile eines solchen Systems sind seine Einfachheit und Geschwindigkeit, die für eine hohe Durchsatz-Screening einer Reihe von Bedingungen ermöglicht, die NF-B-Aktivierung modulieren. Dieses Protokoll eignet sich für andere Zelllinien, die einen NF-B::luciferase-Reporter exdrücken, und wurde in stabil transfizierten RAW264.7-Zellen¹⁸nachgewiesen. Die Zeit, die für die Handhabung von Proben benötigt wird, angefangen bei der Zelllyse bis zur Erzeugung eines Lumineszenzsignals, ist minimal und dauert etwa eine Stunde. Die Messung von NF-B erfordert nur grundlegende Laborgeräte wie undurchsichtige Platten, einen Plattenleser, der in der Lage ist, Lumineszenz zu messen, und einfache Datenanalysesoftware wie ein Tabellenkalkulationsprogramm.

Protokoll

1. Zellpassierung und Seeding

1. Bewahren Sie HeLa 57A-Zellen in einem 75 cm² Kolben, der 10 ml dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) enthält, ergänzt durch 5% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator.
2. Zellkulturmedien ansaugen und mit 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung waschen. Aspirieren Sie Trypsin und ersetzen Sie durch eine zusätzliche 1 ml. Legen Sie den Kolben in einen 37 °C-Inkubator für 4-5 min, damit sich die Zellen vom Kolben lösen können.
3. Fügen Sie 9 ml Zellkulturmedien hinzu und waschen Sie den Boden des Kolbens ein paar Mal, um Zellen zu entfernen und eine homogene Suspension zu bilden.
4. HeLa 57A-Zellen 1:6 oder 1:8 in frischen Medien verdünnen und in neue Kolben säen. Durchgangszellen, wenn sie zu 90 % konfluent sind oder alle drei Tage und halten Zellen mit einem Minimum von 25% Konfluenz.
5. Einen Tag vor der Zellstimulation versuchen Sie HeLa 57A-Zellen und suspendieren in 10 ml Wachstumsmedien. Zählen Sie Zellen in Suspension mit einem Hämozytometer und verwenden Sie Wachstumsmedien, um Zellen auf eine Endkonzentration von 2,5 x 10⁵ Zellen/ml in einem 50 ml konischen Rohr zu verdünnen.
6. Übertragen Sie 250 l Zellsuspension (ca. 6,25 x 10⁴ Zellen) auf jeden Brunnen einer 48-Well-Platte. In regelmäßigen Abständen das konische Rohr kappen und umdrehen, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte auf der Seite, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gleichmäßig in den Brunnen verteilen.
7. Übertragen Sie die Platte in einem 5%_{CO2-Inkubator} auf 37 °C und lassen Sie die Zellen über Nacht anhaften und wachsen.

2. Herstellung von Bakterien

1. Zwei Tage vor der Infektion, Streifen gefroreneBestände von Salmonellen auf LB Agar Platten, um einzelne Kolonien zu produzieren. Übertragen Sie Platten auf einen Inkubator, der auf 37 °C eingestellt ist, und ermöglichen Sie über Nacht Wachstum.
2. Einen Tag vor der Infektion, fügen Sie 3 ml Lysogeny Brühe (LB) zu sterilen bakteriellen Kulturröhren, Hinzufügen der entsprechenden Antibiotika zu den Medien.
3. Mit einer sterilen Impfschleife wählen Sie eine einzelne Kolonie aus gestreiften Bakterienkulturen und berühren Sie die Schleife zu den LB-Medien. Kappen Sie die Rohre nach dem Impfen und entsorgen Sie die Schleife.
4. Die Rohre in einen Schüttelinkubator auf 37 °C, 180 U/min stellen und über Nacht wachsen lassen.
5. Am Tag der Infektion, holen Sie über Nacht Bakterienkulturen aus dem Brutkasten.
6. Bereiten Sie Tuben für die Subkultur vor, indem Sie 3 ml frischeLB hinzufügen, die gegebenenfalls Antibiotika enthalten.
7. Übertragen Sie 30 l der über Nacht bakteriellen Kultur (1 in 100 Verdünnung) auf die frisch zubereiteten Medien. Legen Sie die Rohre in einen Schüttelinkubator, der 3stunden lang bei 37 °C eingestellt ist.
8. Nach der 3 h Inkubation 1 ml sterile LB-Brühe in eine Kunststoffküvette geben, um als Rohling zu dienen. Übertragen Sie 900 l LB in die anderen Küvetten, die für die Probenanalyse verwendet werden sollen.
9. Übertragen Sie 100 l bakterielle Subkultur in eine Küvette, die 900 l LB und Pipette mehrmals nach oben und unten enthält, um sie zu mischen. Wiederholen Sie dies für jede bakterielle Suspension.
10. Schalten Sie das Spektralphotometer ein, um die optische Dichte (OD) der Bakterienkulturen bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD₆₀₀₎zu messen.
11. Legen Sie den Rohling in das Spektralphotometer. Beachten Sie die Ausrichtung, da es eine Markierung nach oben geben sollte, die darauf hinweist.
12. Schließen Sie den Deckel und drücken Sie die Blank-Taste auf dem Spektralphotometer, um die Hintergrundabsorption zu erhalten.
13. Ersetzen Sie die leere Küvette durch eine Musterküvette in der gleichen Ausrichtung und drücken Sie Read.
14. Zeichnen Sie die OD_600-Werte dieser Beispiele auf. Multiplizieren Sie den Wert mit 10, um den Verdünnungsfaktor zu berücksichtigen.
15. Verdünnen Sie die bakterielle Subkultur mit frischem LB, um einen Absorptionswert von ca. 1,0 zu erreichen, was in etwa 1 x 10⁹ cfu/ml entspricht. Verdünnen Sie diese Suspension 1:10 in einer Küvette und messen Sie die Absorption — die einen Wert von 0,1 ergeben sollte.
16. Fügen Sie in einer neuen Röhre ein geeignetes Volumen der verdünnten Subkultur zu frischem LB hinzu, um eine Suspension von 1 x 10⁸ cfu/ml zu erreichen, die als Inokulum verwendet werden soll.
17. Vorbereiten Sie die serielleverdünnung des Inokulums, indem Sie 50 l bakterielle Suspension in ein Rohr übertragen, das 450 l steriles PBS (10-fache Verdünnung) enthält, bis eine endgültige Verdünnung von ca. 10² cfu/ml erfolgt.
18. Übertragen Sie 100 l der beiden niedrigsten Verdünnungen (10² bzw. 10³ entsprechend 10 bzw. 100 Koloniebildende Einheiten) auf eine LB-Agarplatte und verteilen Sie die Suspension mit einem Zellstreuer, um einzelne Kolonien zu erhalten. Diese Platten in einen 37 °C-Inkubator geben und über Nacht inbrüten.
19. Am nächsten Tag zählen sie die Kolonien und berechnen die bakterielle Konzentration des ursprünglichen Inokulums, um die tatsächliche Inokulumkonzentration zu bestimmen.

3. Infektion von Zellen

HINWEIS: An diesem Punkt sollten die Zellen bei etwa 90% Konfluenz sein. Bei HeLa 57A Zellen in einer 48-Well-Platte sind dies ca. 1 x 10⁵ Zellen pro Brunnen. Zellen werden mit einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10 oder 10⁶ cfu/well infiziert.

1. Beschriften Sie den Deckel der Platte entsprechend den Infektionsbedingungen, die für jeden Brunnen verwendet werden, wobei jede Bedingung in Dreifacharbeit durchgeführt wird.
2. Fügen Sie 10 L des Inokulums zu den entsprechenden Brunnen hinzu. Fügen Sie 10 l steriles LB zu nicht infizierten Kontrollbrunnen hinzu.
3. Um die Zeit der Infektion zu synchronisieren, legen Sie die Platte in eine Tischzentrifuge und drehen Sie bei 500 x g für 5 min, um sicherzustellen, dass die Platte gegenbalanciert ist.
4. Übertragen Sie infizierte Zellen bei 37 °C für 1 h in einen 5% CO2-Inkubator.
5. Legen Sie ein Aliquot von Zellkulturmedien in ein 37 °C-Wasserbad für den nächsten Schritt.
6. Eine Stunde nach der Infektion, entfernen Sie Zellkulturmedien aus dem Wasserbad und wischen Sie das Äußere mit 70% Ethanol ab. Übertragen Sie Gewebekulturplatte in Biosicherheitsschrank.
7. Mit steriler Technik, aspirieren Medien aus Brunnen und ersetzen mit 250 l frische, warme Zellkultur Medien.
8. Rücklagen zum 5% CO2-Inkubator bei 37 °C für weitere 4 h.
9. Entfernen Sie Platten aus dem CO2-Inkubator und aspirieren Sie die Medien aus den Brunnen. Für die Luziferase-Analyse setzen Sie Schritt 4.1 fort. Für die RNA-Isolierung fahren Sie mit Schritt 5.1 fort.

4. Luziferase-Analyse

1. Fügen Sie den Brunnen 100 L 1x Zelllysepuffer hinzu. Der Puffer muss je nach Reagenz möglicherweise zunächst auf eine Arbeitskonzentration verdünnt werden.
2. Übertragen Sie die Platte in einen -80 °C Gefrierschrank und brüten Sie mindestens 30 min, um eine effiziente Zelllyse zu gewährleisten.
3. Legen Sie die Platte mit gefrorenem Zelllysat auf eine Bank, um aufzutauen und Luziferase-Substratreagenzien gemäß den Empfehlungen des Herstellers vorzubereiten.
4. Lassen Sie luziferase Substratreagenzien auf Raumtemperatur ausdemieren.
5. Schalten Sie den Plattenleser ein und öffnen Sie das entsprechende Reader-Programm. Stellen Sie die Maschine so ein, dass die Lumineszenz gemessen wird.
6. Übertragen Sie 10 l jeder Probe in einen Brunnen einer undurchsichtigen 96-Well-Platte.
7. Fügen Sie 50 L des Luciferase Assay Reagenz mit einer Mehrkanalpipette zu jedem Brunnen der opaken Platte hinzu.
8. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte an der Seite, um Brunnen zu mischen und sicherzustellen, dass die untere Oberfläche mit Flüssigkeit bedeckt ist. Legen Sie die Platte in einen Plattenleser und initiieren Sie das Lesen.
9. Kopieren Sie die Lumineszenzwerte in ein Tabellenkalkulationsprogramm und zeichnen Sie die Ergebnisse.

5. RNA-Isolation

1. Fügen Sie 500 l Guanidiumthiocyanat zu jedem Brunnen und Pipette auf und ab mehrmals, um eine vollständige Lyse zu gewährleisten.
2. Übertragen Sie den Inhalt in ein beschriftetes Mikrozentrifugenrohr. Halten Sie Proben so weit wie möglich auf Eis, um die RNA-Qualität zu erhalten.
3. Legen Sie eine Tischzentrifuge auf 4 °C und halten Sie die Zentrifuge bei dieser Temperatur für den Rest des Protokolls.
4. Zu jedem Probenröhrchen 100 l Chloroform hinzufügen, dicht kappen und 15 s schütteln. Bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.
5. Zentrifuge bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C. Bereiten Sie sich während dieser Zeit auf den nächsten Schritt der RNA-Reinigung vor, indem Sie neue Röhren beschriften.
6. Übertragen Sie die obere wässrige Phase auf das neue Rohr, das 250 l Isopropanol enthält, wobei Darauf geachtet wird, die mittleren oder unteren Schichten nicht zu stören.
7. Unbenutztes Produkt in einem -80 °C Gefrierschrank aufbewahren, der auch für die Proteinanalyse verwendet werden kann. Die verbleibende wässrige Schicht kann auch als Backup dienen, wenn später RNA benötigt wird.
8. Wirbel die Mischung aus wässriger Schicht und Isopropanol und lassen Proben bei Raumtemperatur für 10 min sitzen.
9. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C.
10. Entfernen Sie Die Rohre aus der Zentrifuge. RNA-Ausscheide bildet ein weißes Pellet an der Seite und am Boden des Rohres. Öffnen Sie die Rohre und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, indem Sie in einen Abfallbehälter gießen.
11. Waschen Sie das RNA-Pellet, indem Sie 500 l 75% Ethanol und Wirbel hinzufügen.
12. Zentrifuge bei 8.000 x g für 5 min bei 4 °C.
13. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie das Pellet mit 75% Ethanol ausgießen und erneut waschen.
14. Zentrifuge bei 8.000 x g für 5 min bei 4 °C.
15. Mit einer kleinen Volumenpipette (z. B. 10-200 L Volumen) aspirieren Sie so viel vom Überstand wie möglich, wobei Sie darauf achten, keine Flüssigkeit zurück in das Rohr zu schieben oder das Pellet mit der Pipettenspitze zu lösen. Wenn das Pellet entfernt wird, zentrifugieren Sie kurz und wieder, um Überstand zu entfernen.
    1. Die RNA-Pellets lufttrocknen. Wenn die Pellets für eine Probe sichtbar sind, überprüfen Sie sie regelmäßig (alle 5 Minuten), um zu sehen, ob sie von weiß zu klar wechseln, was darauf hinweist, dass sie trocken sind. Sobald die Pellets beginnen, sich zu drehen, fügen Sie 20 l ultrareines, rNase freies Wasser hinzu, um die RNA aufzulösen.
    2. Wenn Pellets ursprünglich für keine Proben sichtbar waren, fügen Sie einfach Ultrareinstwasser 5 min nach dem Entfernen überstand.
16. Um die Löslichkeit zu erhöhen, geben Sie die Lösung ein paar Mal durch eine Pipettenspitze und inkubieren Sie für 10 min bei 55-60 °C.

6. DNase Behandlung von RNA

1. Um die RNA-Integrität aufrechtzuerhalten, lagern Sie RNA-Proben auf Eis, sofern nicht anders angegeben. Zu diesem Zeitpunkt kann der 10x DNase Puffer aus dem Gefrierschrank entfernt werden und auf Eis auftauen.
2. Bereiten Sie das Spektralphotometer für die Probenanalyse vor, indem Sie alle Probenanalyseoberflächen mit einem fusselfreien Tuch reinigen.
3. Nehmen Sie vor der Analyse eine Hintergrundmessung vor. Laden Sie dazu den Sensor mit 1,5 l des gleichen Reinstwassers, das zum Auflösen der RNA-Pellets verwendet wird. Drücken Sie die Schaltfläche Leer lesen, um eine Hintergrundlesung zu generieren.
4. Verwenden Sie das fusselfreie Tuch, um die Probenladefläche des Geräts abzuwischen. Wiederholen Sie diesen Schritt nach jedem Beispiellesen.
5. Laden Sie 1,5 l resuspendierte RNA auf den Probenhalter und wählen Sie Probe lesen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Beispiele gelesen wurden.
6. Bereiten Sie den DNase-Master-Mix vor, indem Sie 2,4 l 10x DNase-Puffer und 1 l DNase pro Probe in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr kombinieren. Bereiten Sie den Master-Mix für zwei zusätzliche Volumes vor.
7. Mischen Sie den Master-Mix, indem Sie das Rohr mehrmals streichen. Kurz zentrifugieren Sie das Rohr, um Denkinhalt an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Fügen Sie 3,4 L Mastermix zu 20 L RNA-Probe hinzu. Mischen Sie den Inhalt durch Streichen und Zentrifugen kurz, wie zuvor.
8. Übertragen Sie die Proben in einen Wärmeblock, der 20 min auf 37 °C eingestellt ist. Entfernen Sie das Inaktivierungsreagenz dNase aus dem Gefrierschrank und tauen Sie bei Raumtemperatur auf.
9. 20 min nach dem Platzieren von Proben auf dem Wärmeblock, übertragen Sie die Proben auf ein Rohrrack auf dem Arbeitstisch platziert.
10. Mischen Sie den Inhalt des Inaktivierungsreagenzes der DNase vorsichtig. Übertragen Sie 2,6 l DNase-Inaktivierungsreagenz auf die RNA-haltigen Röhren und flicken Sie dann die Rohre, um eine homogene Mischung zu erzeugen.
11. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 1 min.
12. Pipette den Überstand vorsichtig zu einem neuen, beschrifteten Rohr.

7. Reverse Transkription von mRNA zu cDNA

1. Bereiten Sie eine Master-Mischung in Abhängigkeit von der Menge der Proben plus zwei zusätzliche, um Verlust durch Pipettiern zu berücksichtigen (Tabelle 1). Verwenden Sie 1 g RNA und fügen Sie H₂O zu einem Volumen von insgesamt 50 l hinzu.

Reagenz	Volumen (L)	Endgültige Konzentration
MgCl2 (25mM)	3.5	1,75 mM
Umgekehrter Transkriptionspuffer (10x)	5	1x
dNTP-Mischung (je 10 M)	2.5	500 nm
zufälliger Hexamer (100 'M)	1.25	2,5 m
Multiscribe-Reverse-Transkriptase (50 U/L)	1	1 U/L
RNase-Inhibitor (20 U/L)	1.25	1,25 U/L
RNA (1 g)		20 ng/uL
H2O	aufladen bis zu 50

Tabelle 1: Komponenten und Rezept für Reverse Transkriptionsmaster-Mix.

2. Verschließen Sie die Proben fest und beschriften Sie die PCR-Rohre an der Seite, da etiketten auf dem Deckel später aus dem beheizten Deckel des Thermocyclers entfernt werden können. Mix durch Wirbel.
3. Zentrifugieren Sie kurz die PCR-Rohre, um Proben an der Unterseite des Rohres zu sammeln.
4. Legen Sie die PCR-Röhren in einen Thermocycler und führen Sie die Proben unter den folgenden Einstellungen aus:
   25 °C für 10 min, 48 °C für 30 min, 95 °C für 5 min und dann bei 10 °C halten.
5. Röhrchen mit neu synthetisierter cDNA in einen -20 °C Gefrierschrank übertragen oder sofort in der qPCR-Analyse verwenden.

8. Vorbereitungs- und Ladeplatte für RT-qPCR-Analyse

1. Planen Sie vor dem Start die Einrichtung der 384-Well-qPCR-Platte für die Probenanalyse.
2. Tauen Primer und cDNA auf Eis.
3. Bereiten Sie einen Master-Mix vor (siehe Tabelle 2),plus ca. 10 % mehr, um Den Verlust durch Pipettiern zu berücksichtigen.

Reagenz	Volumen (L)
10 'M F-Grundierung	1
10 M R-Grundierung	1
Ultrapure H2O	4
2x SYBR grün	10

Tabelle 2: Komponenten und Rezept für qPCR Master Mix.

4. Vortex die Master-Mischung und geben Sie 8 l in die Brunnen der 384-Well-Platte mit einer Repeater Pipette. Die Proben werden für jede Primer- und cDNA-Probenkombination doppelt analysiert.
5. Übertragen Sie mit einer P10 (oder kleineren) Pipette 2 l cDNA in doppelte Bohrungen für jeden zu analysierenden Primersatz. Ersetzen Sie die Spitzen nach jedem Brunnen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
6. Versiegeln Sie die Platte, indem Sie den Klebefilm sorgfältig auf die Oberfläche auftragen, um sicherzustellen, dass alle Brunnen abgedeckt sind. Drücken Sie die Folie mit einem Dichtpaddel oder einer Dichtungswalze, um sie fest zu versiegeln.
7. Legen Sie die Platte in eine Zentrifuge, mit einer leeren Platte als Gegengewicht. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 5 min.

9. Ausführen des Thermocyclers für die qPCR-Analyse

1. Schalten Sie den Computer und das Echtzeit-PCR-Instrument ein.
2. Öffnen Sie die RT-qPCR-Software und wählen Sie Neues Experimentaus.
3. Wählen Sie auf der Registerkarte Setup Experimenteigenschaftenaus, in denen die Parameter für die Ausführung festgelegt werden können.
4. Definieren Sie den Experimentnamen, mit dem der Dateiname und die Einstellungen zum Speichern von Ergebnissen festgelegt werden.
5. Wählen Sie für die Instrumentenauswahldas aktuell verbundene Instrument aus, das die Analyse ausführen soll. Wählen Sie die Methode der Vergleichenden CT-Ausführung (Ct) aus.
6. Wählen Sie SYBR Green Reagents als fluoreszierenden DNA-Farbstoff und Standard als Rampengeschwindigkeit.
7. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen neben Schmelzkurve einschließen aktiviert ist.
8. Weisen Sie unter der Registerkarte Definieren Ziele (d. h. gene, die verstärkt werden sollen) und Proben (d. h. experimentelle Bedingungen) zu.
9. Wählen Sie die Registerkarte Zuweisen. Beschriften Sie die Brunnen mit den entsprechenden Zielen und Proben, da sie dem Ladeschema der 384-Well-Platte entsprechen.
10. Wählen Sie Ausführungsmethodeaus. Verwenden Sie die in Tabelle3aufgeführten Parameter für die Analyse .

	Hold Stage		PCR-Stufe		Schmelzkurvenstufe
	Schritt 1	Schritt 2	Schritt 1	Schritt 2	Schritt 1	Schritt 2	Schritt 3
Temp	50 °C	95 °C	95 °C	60 °C	95 °C	60 °C	95 °C
Zeit	2:00	10:00	0:15	1:00	0:15	1:00	0:15
Datenerfassung				Ja			Ja
Anzahl der Zyklen	1x		40x		1x

Tabelle 3: Zyklusparameter für Thermocycler.

11. Legen Sie die 384-Well-Platte in den Thermocycler und starten Sie die Analyse.

10. Analyse der qPCR-Ergebnisse mit der Delta-Delta-Ct-Methode (2^{- Ct})

1. Analysieren Sie die ergebnisse, die aus der qPCR-Reaktion generiert wurden, auf Fehler, die die nachgelagerte Analyse beeinträchtigen können. Viele Fehler werden automatisch vom System gekennzeichnet.
2. Bei richtig konstruierten Primern sollten die Schmelzkurven nur einen Peak haben. Schließen Sie alle Brunnen, die eine Schmelzekurve mit mehr als einem Peak enthalten, von der weiteren Analyse aus.
3. Exportieren Sie die Ct-Werte in ein Tabellenkalkulationsprogramm, um die Daten mit der Methode "Ct" zu analysieren. Ein vorgeschlagenes Format wird bereitgestellt (Tabelle 4). Die letzte Spalte ist die Änderung des Faltenausdrucks der Probe relativ zu den Kontrollbeispielen.

	Housekeeping-Gen (GAPDH)			Gen von Interesse (IL6)
	Ct1	Ct2	Ave Ct	Ct1	Ct2	Ave Ct	€Ct	Ave -Ct-Ctrls	•Ct	2-(Ct)	Geomean
Steuerung 1	15.33	15.37	15.35	26.81	26.91	26.86	11.51	10.51	1.00	0.50	1.00
Steuerung 2	16.83	16.77	16.80	26.89	26.92	26.91	10.11	10.51	-0.41	1.33
Steuerung 3	17.56	17.53	17.54	27.38	27.56	27.47	9.93	10.51	-0.59	1.50
Sl1344 1	15.50	15.41	15.45	22.15	22.13	22.14	6.69	10.51	-3.83	14.21	13.23
SL1344 2	16.02	15.98	16.00	23.01	22.96	22.98	6.98	10.51	-3.53	11.57
SL1344 3	17.27	17.30	17.28	23.99	23.98	23.98	6.70	10.51	-3.82	14.09
sipA sopB sopE2 1	15.38	15.41	15.39	23.31	23.09	23.20	7.80	10.51	-2.71	6.56	7.29
sipA sopB sopE2 2	16.01	16.05	16.03	23.89	23.92	23.91	7.88	10.51	-2.64	6.23
sipA sopB sopE2 3	16.78	16.78	16.78	24.02	24.06	24.04	7.27	10.51	-3.25	9.49
sipA sopB sopE2 sopE 1	15.52	15.60	15.56	27.04	27.03	27.03	11.47	10.51	0.96	0.51	0.79
sipA sopB sopE2 sopE 2	15.56	15.59	15.57	26.37	26.42	26.39	10.82	10.51	0.31	0.81
sipA sopB sopE2 sopE 3	15.91	15.92	15.91	26.24	26.12	26.18	10.27	10.51	-0.25	1.19

Tabelle 4: Format für die Analyse von qPCR-Daten.

Ergebnisse

Der hier beschriebene Assay konzentriert sich auf die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-B mit einem NF-B-abhängigen Luziferase-Reporter, der stabil in eine Linie von HeLa-Zellen transfiziert wird. Aktiviertes NF-B translokalisiert sich in den Kern, wo es Die Bindungsstellen von Zielgenen bindet, einschließlich der pro-inflammatorischen Zytokine IL6 und IL23. Eine allgemeine Übersicht über die NF-B-Aktivierung ist in Abbildung 1dargest...

Diskussion

Der wichtigste Beitrag des beschriebenen Protokolls ist, dass es eine schnelle und einfache Methode bietet, um die NF-B-Aktivierung in Zellen zu erkennen, was eine Analyse mehrerer Stimulierender oder Medikamente mit hohem Durchsatz ermöglicht, die die NF-B-Aktivierung beeinflussen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur NF-B-Aktivierung in Salmonellen-infiziertenHeLa-Zellen. Diese Zellen können für Infektionen mit anderen Krankheitserregern sowie verwendet werden, um die Auswirkungen der bakteriellen Infektion ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Klebefolie	VWR International	60941-070
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse Treatment Kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
Ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A-Zellen			Ref # 15
Reverse-Transkriptionskit für cDNA mit hoher Kapazität	Angewandte Biosysteme	4368814
Isopropanol	Fisher Bioreagenzien	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagenzien	BP906-5
LB Agar	Fisher Bioreagenzien	BP1425-500
Lysogenese-Bouillon	Fisher Bioreagenzien	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		Spektralphotometer
Promega Luciferase Assay-System	Promega	E1501	Zelllysepuffer & Luciferin-Substrat
	Thermo Scientific	SO142
Echtzeit-GAPDH-Primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'Echtzeit-GAPDH-Reverse-Primer
			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'Echtzeit-IL-23-Forward-Primer
			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'Echtzeit
IL-23 reverse Primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'Echtzeit-IL-6
Vorwärtsprimer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'Echtzeit-IL-6
reverse Primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transkriptase	Angewandte Biosysteme	4308228
RNAse Inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT Puffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 Δ sipA sopB:MudJ sopE2::p SB1039			Ref # 18
SL1344 Δ sopE & Delta; sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039			Ref # 18
SYBR grün	Applied Biosystems	4309155	2x Mastermix
Tri-Reagenz	Molecular Research Center	TR 118	Guanidinthiocyanat
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0,05% Trypsin-EDTA
Reinstwasser	Fisher Bioreagenzien
BP248450-Well-Platte für PCR	VWR International	89218-294	384-Well-Platte