Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Abstract

Die In-vitro-Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) hat die Fähigkeit verändert, die menschliche Entwicklung sowohl auf biologischer als auch auf molekularer Ebene zu untersuchen, und Zellen für den Einsatz in regenerativen Anwendungen bereitgestellt. Standardansätze für die hESC-Kultur, die Koloniekultur verwendet, um undifferenzierte hESCs und embryoiden Körper (EB) und Rosettenbildung zur Differenzierung in verschiedene Keimschichten aufrechtzuerhalten, sind ineffizient und zeitaufwändig. Hier wird eine Einzelzellkulturmethode vorgestellt, die hESCs anstelle einer Koloniekultur verwendet. Diese Methode ermöglicht die Aufrechterhaltung der charakteristischen Merkmale undifferenzierter hESCs, einschließlich der Expression von hESC-Markern auf Ebenen, die mit Kolonietyp-hESCs vergleichbar sind. Darüber hinaus stellt das Protokoll eine effiziente Methode für die Generierung von neuronalen Vorläuferzellen (NPC) aus einzelligen hESCs dar, die NPCs innerhalb einer Woche produziert. Diese Zellen exprimieren in hohem Maße mehrere NPC-Markergene und können sich in verschiedene neuronale Zelltypen differenzieren, einschließlich dopaminergen Neuronen und Astrozyten. Dieses einzellige Kultursystem für hESCs wird nützlich sein, um die molekularen Mechanismen dieser Prozesse, Studien zu bestimmten Krankheiten und Drogenentdeckungs-Screens zu untersuchen.

Introduction

Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) haben das Potenzial, sich in die drei primären Keimschichten zu differenzieren, die sich dann in verschiedene multipotente Vorläuferzelllinien differenzieren. Diese Abstammungen führen in der Folge zu allen Zelltypen im menschlichen Körper. In-vitro-hESC-Kultursysteme haben die Fähigkeit, die menschliche embryonale Entwicklung zu untersuchen, verändert und als wertvolles Instrument gedient, um neue Erkenntnisse darüber zu erhalten, wie diese Prozesse auf biologischer und molekularer Ebene reguliert werden. In ähnlicher Weise liefern Studien mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die aus der Reprogrammierung sammat....

Protocol

1. Herstellung von hESC-qualifizierten Basement Membrane Matrix-beschichteten Platten

1. Langsam die hESC-qualifizierte Kellermembranmatrix (siehe Materialtabelle)bei 4 °C mindestens 2–3 h oder über Nacht auftauen, um die Bildung eines Gels zu vermeiden.
2. Zur Herstellung von Kellermembran-Matrix-beschichteten Platten die Matrix in kalter DMEM/F12 auf eine Endkonzentration von 2% verdünnen. Gut mischen und jeden Brunnen einer 6-Well-Platte mit 1 ml der verdünnten Matrixlösung beschichten.
3. Die mit der Kellermembran beschichteten Platten bei Raumtemperatur (RT) mindestens 3 h oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Plat....

Results

Hier wird ein verbessertes Protokoll zur Erhaltung und Erweiterung der einzelligen Typkultur von hESCs und deren effizienter Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt, die sich anschließend in verschiedene nachgeschaltete neuronale Linien differenzieren. einschließlich dopaminergen Neuronen und Astrozyten.

Repräsentative Phasenkontrastbilder zeigen die Zellmorphologie in verschiedenen Schritten während der Anpassung von Kolonietyp hESCs an die einzellige Typkultur (

Discussion

Skalierbare und effiziente Methoden zur Differenzierung von hESCs in verschiedene Linien und die Erzeugung einer ausreichenden Anzahl differenzierter Zellen sind wichtige Kriterien für das Arzneimittelscreening und die Stammzelltherapie. Verschiedene einzellige Passmethoden wurden veröffentlicht, bei denen Zellen in Gegenwart von ROCK-Hemmern oder anderen kleinen Molekülen kultiviert werden, um das Überleben zu verbessern, aber die Endprodukte dieser Kulturmethoden sind Kolonietyp hESCs^17,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm M-Schüsseln	ibidi	81156	Zellkulturschale
6-Well-Platten	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104-500	Lösung zur Zellablösung
Activin A	R& D-System	338-AC-050
Ascorbinsäure	Sigma Aldrich	A4403
B27 Ergänzung	Thermo	Fisher 17504044
B27 Ergänzung (-Vit A)	Thermo Fisher	12587010
BDNF	Angewandte biologische Materialien	Z100065
bFGF	Peprotech	100-18C
Zentrifuge	DAMON/ICE	428-6759
CO2-Inkubator	Thermo Fisher	4110
Corning hESC-qulifizierte Matrix (Magrigel)	Corning	354277	Basalmembran-Matrix (wird für den größten Teil des Protokolls hier verwendet)
Cryostor CS 10	Stemcell Technologies	7930	Lösung zum Einfrieren von Zellen
Dispase	Stemcell Technologies	7923
DMEM	Thermo Fisher	10569-010
DMEM/F12	Thermo Fisher	10565-018
Dorsomorphin	Tocris	3093
EGF	Peprotech	AF-100-16A
Fötales Rinderserum	Fisher Scientific	SH3007003HI
FGF8	Angewandte biologische Materialien	Z101705
GDNF	Applied Biological Materials	Z101057
Geltrex	Matrix Thermo Fisher	A1569601	Basalmembranmatrix
GlutaMax	Thermo Fisher	35050061	Glutamin Supplement, 100X
H9 (WA09) humane embryonale Stammzelllinie	WiCell	WA09
Heregulin b-1	Peprotech	100-3
IGF	Peprotech	100-11
Knockout DMEM	Thermo Fisher	10829018
Knockout Serum Ersatz	Thermo Fisher	10828028
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850	hESC Kulturmedium
N2 Ergänzung	Thermo Fisher	17502001
NEAA	Thermo Fisher	11140050
Neurobasal	Thermo Fisher	21103049
Poly-L-Ornithin	Sigma Aldrich	P3655
ROCK-Inhibitor	Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614
SHH	Angewandte biologische Materialien	Z200617
Stemdiff Neuronales Vorläufermedium	Stemcell Technologies	5833	NPC-Expansionsmedium