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Methodenartikel

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

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DOI:

10.3791/60575

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29. Januar 2020

 , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zum fluoreszierenden Antikörper-vermittelten Nachweis von Proteinen in ganzen Präparaten von Zebrafischembryonen und Larven vor.

Zusammenfassung

Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Erforschung der Proteinexpression und Lokalisierung sowohl während der normalen Entwicklungs- als auch der Krankheitszustände. Obwohl viele Immunhistochemieprotokolle für Säugetiergewebe- und Gewebeabschnitte optimiert wurden, erfordern diese Protokolle häufig eine Modifikation und Optimierung für nicht-mammalianische Modellorganismen. Zebrafische werden zunehmend als Modellsystem in der Grundlagen-, Biomedizinischen und translationalen Forschung eingesetzt, um die molekularen, genetischen und zellbiologischen Mechanismen von Entwicklungsprozessen zu untersuchen. Zebrafische bieten viele Vorteile als Modellsystem, erfordern aber auch modifizierte Techniken für eine optimale Proteindetektion. Hier stellen wir unser Protokoll für die Fluoreszenzimmunhistochemie in Zebrafischembryonen und Larven zur Verfügung. Dieses Protokoll beschreibt zusätzlich verschiedene Montagestrategien, die eingesetzt werden können, und einen Überblick über die Vor- und Nachteile, die jede Strategie bietet. Wir beschreiben auch Änderungen an diesem Protokoll, um den Nachweis von chromogenen Substraten im gesamten Mountgewebe und Fluoreszenznachweis im geschnittenen Larvengewebe zu ermöglichen. Dieses Protokoll ist weitgehend auf die Untersuchung vieler Entwicklungsstadien und embryonaler Strukturen anwendbar.

Einleitung

Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich als ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung biologischer Prozesse aus mehreren Gründen, einschließlich kurzer Erzeugungszeit, schnelle Entwicklung, und Freundlichkeit zu genetischen Techniken. Als Ergebnis, Zebrafische werden häufig in hohen Durchsatz kleine Molekül-Screens für toxikologische Forschung und Arzneimittelforschung verwendet. Zebrafische sind auch ein attraktives Modell für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen, da ein einzelnes Weibchen routinemäßig 50-300 Eier gleichzeitig produzieren kann und die optisch klaren Embryonen extern entwickeln, was eine effiziente Visualisierung von Entwicklungsprozessen ermöglicht. Die frühe Forschung stützte sich jedoch hauptsächlich auf vorwärts gerichtete genetische Screens, die N-Ethyl-N-Nitrosourea (ENU) oder andere Mutagene nutzten, da es herausforderungen war, umgekehrte genetische Techniken zu etablieren. Vor etwa zwei Jahrzehnten wurden Morpholinos zum ersten Mal in Zebrafischen verwendet, um gezielte Gene1abzuschlagen. Morpholinos sind kleine Antisense-Oligonukleotide, die die Translation von Ziel-mRNA nach Mikroinjektion in einen Embryo in einem frühen Entwicklungsstadium hemmen. Eine große Schwäche von Morpholinos ist, dass sie verdünnt werden, wenn sich die Zellen teilen und in der Regel durch 72 Stunden Nachbefruchtung (hpf) an Wirksamkeit verlieren. Während Morpholinos ein leistungsfähiges Werkzeug für Zebrafisch-Genstörungen bleiben, werden Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs), Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und gruppierte, regelmäßig interspaced short palindromic Repeats (CRISPRs) in jüngerer Zeit verwendet, um direkt auf das Zebrafischgenom2,3zu zielen. Diese umgekehrten genetischen Strategien, in Kombination mit Vorwärtsgenetik und Bildschirmen mit hohem Durchsatz, haben den Zebrafisch als ein leistungsfähiges Modell zur Erforschung der Genexpression und -funktion etabliert.

Die Fähigkeit, die Genfunktion zu untersuchen, erfordert in der Regel eine Bewertung der räumlich-zeitlichen Verteilung der Gen- oder Genproduktexpression. Die beiden am häufigsten verwendeten Techniken zur Visualisierung solcher Expressionsmuster während der frühen Entwicklung sind die In-situ-Hybridisierung (ISH) und die gesamte Mount-Immunhistochemie (IHC). Die In-situ-Hybridisierung wurde erstmals 1969 entwickelt und stützt sich auf die Verwendung von markierten Antisense-RNA-Sonden zum Nachweis der mRNA-Expression in einem Organismus4. Im Gegensatz dazu werden markierte Antikörper in der Immunhistochemie verwendet, um die Proteinexpression zu visualisieren. Die Idee, Proteine für den Nachweis zu kennzeichnen, geht auf die5. Jahre der 1930er Jahre zurück und das erste IHC-Experiment wurde 1941 veröffentlicht, als FITC-markierte Antikörper verwendet wurden, um pathogene Bakterien in infizierten Geweben zu erkennen6. ISH und IHC haben sich in den folgenden Jahrzehnten deutlich weiterentwickelt und verbessert und werden nun sowohl routinemäßig im molekularen als auch im diagnostischen Forschungslabor7,8,9,10,11eingesetzt. Während beide Techniken Vor- und Nachteile haben, bietet IHC mehrere Vorteile gegenüber der ISH. Praktisch ist IHC viel weniger zeitaufwändig als ISH und ist in der Regel weniger teuer, abhängig von den Kosten des primären Antikörpers. Darüber hinaus ist die mRNA-Expression nicht immer eine zuverlässige Metrik der Proteinexpression, da bei Mäusen und Menschen nachgewiesen wurde, dass nur etwa ein Drittel der Proteinüberflussvariation durch mRNA-Überfluss12erklärt werden kann. Aus diesem Grund ist IHC eine wichtige Ergänzung, um ISH-Daten zu bestätigen, wenn möglich. Schließlich kann IHC subzelluläre und Co-Lokalisierungsdaten bereitstellen, die nicht von ISH13,14,15bestimmt werden können. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Methode zum zuverlässigen Nachweis von Proteinen durch Immunhistochemie in ganzen Zebrafischembryonen und Larven. Das Ziel dieser Technik ist es, die räumliche und zeitliche Expression eines Proteins von Interesse im gesamten Embryo zu bestimmen. Diese Technologie verwendet antigenspezifische primäre Antikörper und fluoreszierend markierte sekundäre Antikörper. Das Protokoll ist leicht anpassbar für den Einsatz auf gleitmontierten Gewebeabschnitten und für die Verwendung mit chromogenen Substraten anstelle der Fluoreszenz. Mit diesem Protokoll, Wir zeigen, dass die Entwicklung Zebrafisch Skelettmuskel drückt ionotrope Glutamat-Rezeptoren, zusätzlich zu Acetylcholin-Rezeptoren. NMDA-Typ Glutamat-Rezeptor-Subunits sind auf dem Längsmuskel bei 23 hpf nachweisbar.

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Protokoll

Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren für die Arbeit mit Zebrafischen, die Erwachsene und Embryonen züchten, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Murray State University genehmigt.

1. Embryo-Sammlung und -Fixierung

  1. Bereiten Sie Laichbecken vor, indem Sie erwachsene Zebrafische gemischte Sexpaare oder -gruppen in Tanks mit einem Netz oder einem geschlitzten Liner platzieren, der über Nacht mit Systemwasser gefüllt ist.
  2. Wechseln Sie bei eingeschaltetem Licht das Laichbeckenwasser in frisches Systemwasser, um Kot zu entfernen. Verwenden Sie einen 14 h/10 h hellen dunklen Zyklus mit Lichtern, die um 9 Uhr eintreffen.
  3. Sobald die Eier gelegt sind, kehren Sie die Erwachsenen in die Tanks zurück.
  4. Sammeln Sie Eier, indem Sie sie mit einer Transferpipette aufziehen oder in ein Netzsieb gießen.
  5. Übertragen Sie die Eier auf Petrischalen, die auf halbem Weg mit Embryomedium (wie 30% Danieau oder E2 Embryomedium mit 0,5 mg/L Methylenblau) gefüllt wurden, wodurch die Anzahl der Embryonen pro Schale auf 50 begrenzt wird.
  6. Entfernen Sie alle Eier, die tot sind oder nicht teilen.
    HINWEIS: Tote Embryonen können leicht identifiziert werden, da sie undurchsichtig werden und oft "trüb" erscheinen. Wenn Methylenblau dem Embryomedium zugesetzt wird, nehmen die toten Embryonen ein dunkelblaues Aussehen an.
  7. Eiergerichte bei 28,5 °C bebrüten, bis sie das gewünschte Stadium erreichen. Für dieses Experiment die Embryonen auf 23 hpf erhöhen.
  8. Optional) Übertragen Sie die Embryonen bei 24 hpf auf 200 'M 1-phenyl 2-thiourea (PTU) in embryonales Medium, um Melanogenese zu verhindern16,17. Alternativ können Bleichembryonen nach der Fixierung bleichen (siehe optionaler Abschnitt 5).
  9. Ändern Sie embryomedium oder PTU medium täglich.
  10. Dechorionate ungeschlüpfte Embryonen mit ultrafeinen Spitzenzangen unter einem Stereomikroskop. Alternativ können Embryonen chemisch dechororieren, indem sie in 1 mg/ml Pronase in Embryomedium für mehrere Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Embryonen aus Pronase und waschen Sie dreimal mit Embryo-Medium.
  11. Dechorionierte Embryonen bleiben an Plastik. Bewahren Sie sie in Glas- oder Kunststoff-Petrischalen auf, die mit 1-2% Agarose in Embryomedium gelöst sind. Bewegen Sie dechorionierte Embryonen mit feuerpolierten Pasteurpipetten, um Schäden zu minimieren.
  12. Übertragen Sie die Embryonen mit einer Kunststoff- oder feuerpolierten Pipt in 1,5 ml Zentrifugenrohre.
  13. Embryomedium mit einer Mikropipette entfernen. Lassen Sie nur genügend Flüssigkeit, um die Embryonen nach jedem Flüssigkeitswechsel zu bedecken.
  14. 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x phosphatgepufferter Saline (PBS) in einer chemischen Rauchhaube vorbereiten.
    VORSICHT: PFA ist ein gefährliches Material. Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie kontaminierte Flüssigkeiten und Feststoffe in ausgewiesenen Bereichen.
  15. Fixieren Sie die Embryonen in 4% PFA für 1-2 h mit sanftem Schaukeln bei Raumtemperatur. Alternativ können Sie die Embryonen 4 h auf über Nacht bei 4 °C fixieren.
  16. Dreimal in 1x PBS + 1% Triton-X (PBTriton) 5 min waschen.
  17. Verwenden Sie die Embryonen sofort oder lagern Sie bei 4 °C bis zu 1 Woche.
  18. Zur Langzeitlagerung die Embryonen in 100% Methanol (MeOH) 2 h oder über Nacht bei -20 °C dehydrieren. Lagern Sie die Embryonen bei -20 °C in MeOH für mehrere Monate.
    VORSICHT: MeOH ist ein gefährliches Material. Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie kontaminierte Flüssigkeiten und Feststoffe in ausgewiesenen Bereichen.

2. Embryonenzubereitung

  1. Rehydrieren Sie die Embryonen durch serielle Inkubationen bei Raumtemperatur.
    1. Inkubieren In 75% MeOH/25% 1x PBS für 5 min, Schaukeln.
    2. Inkubieren Sie in 50% MeOH/50% 1x PBS für 5 min, Schaukeln.
    3. Inkubieren In 25% MeOH/75% 1x PBS für 5 min, Schaukeln.
    4. Inkubieren in 100% PBTriton für 5 min, Schaukeln.
  2. (Optional) Bereiten Sie eine frische Proteinase-K-Arbeitslösung (10 g/ml in PBTriton) auf Eis vor, indem Sie 10 l frisch aufgetauten Proteinase-K-Bestand (10 mg/ml) hinzufügen.
    1. Permeabilisieren Sie die Embryonen, indem Sie bis zu 30 min in Proteinase K verdauen.
      HINWEIS: Vorgeschlagenes Timing ist <24 hpf: keine Verdauung; 24 hpf: 15 min Verdauung; und 7 Tage alt: 30 min Verdauung.
    2. Durchmeseperabilisierte Embryonen in PBTriton abspülen und in 4% PFA für 20 min bei Raumtemperatur refixieren.
    3. Waschen Sie die Embryonen dreimal in PBTriton für 5 min bei Raumtemperatur mit sanftem Schaukeln.

3. Primäre Antikörper-Inkubation

  1. Wählen Sie eine kommerzielle Blockierlösung oder ein Serum passend zur sekundären Antikörper-Wirtsart (z. B. 10% Ziegenserum in PBTriton) mit oder ohne 2 mg/ml Rinderserum Albumin (BSA).
  2. Blockieren Sie die Embryonen in Blockierlösung für 1-3 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C beim Schaukeln.
  3. Inkubieren Sie in primärer Antikörper in Blockierlösung oder 1% Serum in PBTriton über Nacht bei 4 °C beim Schaukeln. In diesem Experiment wurden die primären Antikörper verwendet, Anti-NMDAR1, Anti-Pan-AMPA-Rezeptor, und Anti-Phospho-Histon H3, jeweils auf eine endgültige Konzentration von 1:500 in 1% Ziegenserum in PBTriton verdünnt.
  4. Waschen Sie fünfmal in PBTriton für 10 min bei Raumtemperatur beim Schaukeln.

4. Sekundäre Antikörper-Inkubation

  1. Wählen Sie einen sekundären Antikörper basierend auf der Wirtsart des primären Antikörpers und der gewünschten Wellenlänge aus.
  2. Inkubieren Sie in sekundärem Antikörper in Blockierlösung oder 1% Serum für 2 h bei Raumtemperatur (oder über Nacht bei 4 °C) beim Schaukeln.
    HINWEIS: Fluoreszierende Sekundärantikörper sind lichtempfindlich. Wir verwendeten 1:500 Ziege-Anti-Maus Alexa488 verdünnt in 1% Ziegenserum in PBTriton.
  3. Bedecken Sie die Rohre mit Aluminiumfolie oder Abdeckung mit einer Lichtblockdose für diese und alle nachfolgenden Schritte.
  4. Waschen Sie dreimal in PBTriton für 10 min bei Raumtemperatur beim Schaukeln.
  5. Übertragen Sie die Embryonen in eine 50%ige Glycerinlösung in PBS über ein Bett von 2% Agarose im Embryomedium und führen Sie die Dokumentation fort oder gehen Sie zu weiteren Verarbeitungsschritten weiter.

Optionale Schritte

5. Bleichen

  1. Bereiten Sie Bleichlösung in einem 1,5 ml Rohr vor, indem Sie 810,7 l ddH2O, 89,3 l mit 2 M KOH und 100 l 30 % H2O2hinzufügen.
  2. Invertieren Sie das Rohr dreimal zu mischen.
  3. Pipette 1 ml Bleichlösung Richtung zu den Embryonen.
  4. Öffnen Sie die Embryorohrkappe, damit Gas entweichen kann. Tippen Sie vorsichtig auf das Rohr auf der Bank, um Blasen zu lösen.
  5. Überwachen Sie den Bleichprozess (ggf. mikroskopisch verwenden) und stoppen Sie die Reaktion, wenn das Pigment ausreichend entfernt wird (ca. 5 min für 24 hpf oder 10 min für 72 hpf).
  6. Entfernen Sie die Bleichlösung vorsichtig mit einer Mikropipette und spülen Sie Embryonen dreimal in 1 ml PBTriton aus.
    HINWEIS: Embryonen sind in diesem Schritt klebrig.
  7. Fahren Sie mit der Dokumentation oder weiteren Bearbeitungsschritten weiter.

6. Embryo-Sektion und Deyolking

  1. Um das Eigelb zu entfernen, übertragen Sie eine kleine Menge (200 L oder genug, um den Embryo vollständig abzudecken, aber restriktiv genug, um zu begrenzen, wo es schwimmen kann) von 1x PBS auf eine Vertiefungsfolie oder eine schlichte Glasrutsche.
  2. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um 1 oder mehr Embryonen zum PBS-Tröpfchen zu bewegen.
  3. Verwenden Sie ultrafeine Zangen und 00 Insektenstifte, um das Dotter auseinander zu brechen und sehr sanft das Dottergranulat von der ventralen Oberfläche des Embryos zu kratzen (siehe auch Cheng et al., 2014)18.
  4. Entfernen Sie das Dottergranulat, und füllen Sie PBS nach Bedarf auf.
  5. Wiederholen Sie dies, bis der Embryo ausreichend frei von Eigelb ist.

7. Flache Montage auf Rutschen

  1. Übertragen Sie entyolkierte Embryonen auf eine aufgeladene Glasrutsche mit einer Kunststoffpipette oder einer 1 ml Mikropipette mit einer getrimmten Spitze (zur Verringerung der Scherspannung). Orientieren Sie sich nach Belieben mit einer 200-L-Mikropipette-Spitze oder einem Insektenstift.
  2. Wick weg überschüssige PBS mit einem Kim-Wisch oder Papiertuch.
  3. Fügen Sie 2-3 Tropfen Montagemedien auf den Schiebe- und Deckschein ein.
  4. Lufttrocken ca. 5 bis 10 min.
  5. Versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack auf der Rutsche.
    HINWEIS: Die Ränder des Deckglases müssen vollständig mit einer dünnen, kontinuierlichen Schicht aus Nagellack bedeckt sein.
  6. Ca. 10 min vor der Bildgebung trocknen lassen.

8. Montage in Agarose

  1. Bereiten Sie 1% Agarose im Embryomedium vor, indem Mantis zu 50 ml Embryomedium in einem Mikrowellen-sicheren Kolben oder Becher mit mindestens 3x größerem Volumen als gewünscht hinzugeben.
  2. In einer Mikrowelle erhitzen, alle 30 s wirbeln, bis Agarose vollständig aufgelöst ist.
  3. Machen Sie 1 ml Aliquots in 1,5 ml Zentrifugenrohren. Bewahren Sie die Aliquots bei Raumtemperatur auf.
  4. Abdeckung Rohrkappen mit Kappenschlössern vor dem Erhitzen.
  5. Legen Sie Agaroserohre in einen schwimmenden Rohrhalter in einen Becher, der halb mit Wasser gefüllt ist.
  6. Mikrowelle der Becher mit schwimmenden Rohren für 2-3 min, oder bis Agarose vollständig geschmolzen ist.
  7. Übertragen Sie einen Embryo mit einer Kunststoffpipette oder einer 200-L-Mikropipette mit einer getrimmten Spitze auf den überbrückten Schlitten (zur Reduzierung der Scherspannung).
  8. Positionieren Sie den Embryo mit Insektenstiften auf einem rechteckigen Deckelund und fügen Sie dem Embryo etwa 20 l geschmolzene Agarose direkt hinzu.
  9. Richten Sie den Interessenbereich, der dem Deckzettel am nächsten liegt, schnell mit 00 Insektenstiften aus.
    HINWEIS: Dies ist eine umgedrehte Halterung.
  10. Bringen Sie das Agaroserohr nach Bedarf in den Wasserschlauch zwischen jedem Gebrauch und der Mikrowelle zurück.
  11. Bild mit einem Mikroskop, wenn die Agarose aushärtet. Halten Sie den montierten Embryo auf dem Kopf, um ihn auf einem invertierten Mikroskop zu verwenden. Drehen Sie den Deckelschlupf um (so ist die Agarose unter dem Coverslip) für den Einsatz auf aufrechten Mikroskopen.

9. Montage auf überbrückten Dias

  1. Um überbrückte Dias zu machen, kleben Sie quadratische Abdeckungen mit einem kleinen Punkt Superkleber an die Glasrutsche.
    HINWEIS: Zwischen den Abdeckungen sollte ein Trog von mindestens 5 mm breite Trog vorhanden sein. Zwei #1 Abdeckungen hoch ist in der Regel geeignet für 24-48 hpf Embryonen, während drei Abdeckungen hoch kann für 72 hpf notwendig sein.
  2. Übertragen Sie 1-2 entyolkierte Embryonen mit einer Kunststoffpipette oder einer 200-L-Mikropipette mit einer getrimmten Spitze auf den überbrückten Schlitten (zur Verringerung der Scherspannung).
  3. Wick weg überschüssige Flüssigkeit mit einem Kim-Wisch oder Papiertuch.
  4. Fügen Sie dem Embryo einen Tropfen von 80 % Glycerin direkt hinzu.
  5. Abdeckung mit einem rechteckigen Deckglas. Das Tröpfchen Glycerin sollte das Deckglas berühren.
  6. Fügen Sie mehr Glycerin in den Raum zwischen dem Deckglas und gleiten Sie nach Bedarf, um den Embryo vollständig mit einem Rand von Glycerin an den Seiten des Embryos zu bedecken.
  7. Schieben Sie das rechteckige Abdeckglas vorsichtig, um den Embryo zur Bildgebung in Position zu bringen.

10. DAB Färbung

HINWEIS: Dieser Abschnitt beginnt nach Schritt 4.2 oben und ersetzt den Rest von Schritt 4.

  1. Die Embryonen in einer blockierenden Lösung mit einem peroxidasekonjugierten Sekundärantikörper für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C beim Schaukeln inkubieren.
  2. Dreimal in PBTriton 10 min bei Raumtemperatur waschen.
  3. Übertragen Sie die Embryonen auf eine Kulturplatte oder Depressionsrutsche mit einer Transferpipette.
  4. 50 l DAB (3,3'-Diaminobenzidin) in ddH2O und 50 l mit 0,3 % Wasserstoffperoxid lösen und mit PBS auf 1 ml bringen.
    VORSICHT: DAB ist ein gefährliches Material. Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie DAB-verunreinigte Flüssigkeiten und Feststoffe in ausgewiesenen Bereichen.
  5. Bedecken Sie HRP-gefärbte Embryonen mit der oben vorbereiteten DAB-Lösung und überwachen Sie die Farbentwicklung (typischerweise 1-5 min) unter dem Mikroskop.
  6. Nach Erreichen des gewünschten Farbentwicklungsniveaus spülen Sie die Embryonen kurz in PBS ab.
  7. Übertragen Sie die Embryonen vor der Fixierung wieder in ein 1,5 ml-Rohr.
  8. Fixieren Sie die Embryonen für 15-20 min in 4% PFA bei Raumtemperatur.
  9. Waschen Sie die Embryonen dreimal in PBTriton für 5 min.
  10. Fahren Sie mit der Dokumentation fort.

11. Geändertes Protokoll für die Färbung von Schnittgewebe, das auf Folien montiert ist

  1. Umschließen Sie Gewebe, das mit einem Pap-Stift gefärbt werden soll.
  2. Übertragen Sie die Dias in eine feuchte Kammer.
  3. Fügen Sie 1 ml PBS direkt zur Folie hinzu.
  4. 7 min bei Raumtemperatur inkubieren, um ein einbettendes Medium zu entfernen.
  5. Gießen Sie PBS durch Invertieren des Dias.
  6. Rehydratisieren Sie 1 min in bis zu 1 ml TNT-Puffer (100 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20).
  7. Block in bis zu 1 ml Blockierlösung (kommerziell oder 10% Serum + 2% BSA) für 1 h bei Raumtemperatur.
  8. Über Nacht in Primärantikörper in 1% Serum oder Blockierlösung bei 4 °C verdünnt.
  9. Fünfmal in bis zu 1 ml TNT-Puffer bei Raumtemperatur waschen.
  10. In sekundären Antikörpern für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren. Bedecken Sie die Kammer mit Folie oder verwenden Sie einen dunklen Deckel.
  11. Fünfmal in TNT bei Raumtemperatur waschen. Gießen Sie die letzte Wäsche ab.
  12. Montieren Sie mit 2-3 Tropfen Montagemedium und Deckelrutsch. Lassen Sie 5-10 min sitzen.
  13. Versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack auf die Rutsche. Vor der Bildgebung vollständig trocknen lassen.

12. Dokumentation

  1. Zeichnen Sie den vollständigen Ablauf und alle Abweichungen in einem Lab-Notizbuch auf.
  2. Zeichnen Sie die Konzentration, den Namen, die Katalognummer, den Hersteller und die Chargennummer des primären Antikörpers auf.
  3. Entsprechend montierte Probe auf die Mikroskopbühne stellen. Suchen Sie die Region von Interesse.
  4. Wählen Sie ein relativ helles Beispiel aus. Stellen Sie die Kamerabelichtung und -verstärkung so ein, dass das Signal ausreichend hell ist, ohne zu sättieren.
  5. Vergleichen Sie die Färbeintensität desselben Interessenbereichs mit den gleichen Expositionseinstellungen, wenn Sie zwischen experimentellen Antikörper-markierten Embryonen und Kontrollantikörpern (z. B. IgG)-Embryonen vergleichen.

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Ergebnisse

Die Immunhistochemie der ganzen Halterung verwendet Antikörper, um das räumliche Muster der Proteinexpression im intakten Tier zu detektieren. Der grundlegende Arbeitsablauf der Immunhistochemie (dargestellt in Abbildung 1) besteht darin, Zebrafische zu züchten, Embryonen zu züchten und zu präzisieren, unspezifische Antigene zu blockieren, einen antigenspezifischen Primärantikörper zu verwenden, um das Protein von Interesse zu zielen, diesen primären Antikörp...

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Diskussion

Die Immunhistochemie ist ein vielseitiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die räumlich-zeitliche Expression praktisch jedes Proteins zu charakterisieren, das für einen Organismus von Interesse ist. Immunhistochemie wird bei einer Vielzahl von Geweben und Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll wurde für den Einsatz in Zebrafischen optimiert. Die Immunhistochemie bei verschiedenen Arten kann unterschiedliche Befestigungs- und Handhabungstechniken erfordern, die je nach Art und Dementogen von Endogenen Peroxi...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Informationen offenzulegen.

Danksagungen

Finanzierung aus dem NIH-Zuschuss 8P20GM103436 14.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseFisher ScientificBP160-100
Aluminiumfolie, strapazierfähigKirklandJede Marke kann substituiert werden
Anti-NMDA-AntikörperMillipore SigmaMAB363
Anti-Phospho-Histon H3 (Ser10), Klon RR002Millipore Sigma05-598
Anti-pan-AMPA-Rezeptor (GluR1-4)Millipore Sigma
Rinderserumalbumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
Calciumnitrat [Ca(NO3)2]Sigma AldrichC4955
Zentrifugenröhrchen, 1,5 mLAxygenMCT150C
Klarer NagellackSally HansonJeder Nagellack oder Härter kann ersetzt werden
Depression (Konkavität) ObjektträgerElektronenmiskroskopie Sciences71878-01
DiaminobenzidinThermo Scientific1855920
Embryomedium, Danieau, 30%17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgS04, 0,18 mM Ca(NO3)2, 1,5 mM HEPES in Reinstwasser.
Embryomedium, E27,5 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 75 μ M KH2PO4, 25 μM Na2HPO4, 0,5 mM CaCl2, 0,35 mM NaHCO3, 0,5 mg/L Methylenblau
SchwimmrohrhalterThermo Scientific59744015
Fluoreszenz-VerbindungsmikroskopLeica BiosystemsDMi8
Fluoreszenz-StereomikroskopLeica BiosystemsM165-FC
Deckgläser aus Glas 18 mm x 18 mmCorning284518
Deckgläser aus Glas 22 mm x 60 mmThermo Scientific22-050-222
Objektträger aus GlasFisher Scientific12-544-4
GlycerolFisher ScientificBP229-1
Anti-Maus-IgG Alexa 488InvitrogenA11001
HEPES-LösungSigma AldrichH0887
Feuchtkammer mit DeckelSimportM920-2
Wasserstoffperoxid, 30%Fisher ScientificH325-500
Immunedge Pap PenVector LabsH-4000
Insektenstifte, Größe 00Stoelting5213323
Magnesiumsulfat (MgSO4 & middot; 7H2O)Sigma Aldrich63138
SiebOneidaJede Marke kann ersetzt werden
MethanolSigma Aldrich34860
MethylenblauSigma AldrichM9140
Mikroröhrchen-KappenverschlussForschungsprodukte International145062
MikrowellenherdToastmaster
Mouse IgGSigma AldrichI8765
Normales ZiegenserumMillipore SigmaS02L1ML
NutatingMixer Fisher Scientific88-861-044
ParaformaldehydFisher Scientific04042-500
Pasteur-PipettenFisher Scientific13-678-20C
PBTriton1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount EindeckmediumFisher ChemicalSP15-500
Petrischale (Glas)Pyrex3160100
Petrischale (Kunststoff)Fisher ScientificFB0875713
1-Phenyl-2-thioharnstoffAcros Organics207250250
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10x, pH 7,4Gibco70011-044
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1x1x hergestellt aus 10x Stamm verdünnt in dH2O
Kaliumchlorid (KCl)Sigma AldrichP9333
Kaliumhydroxid (KOH)FisherP250-500
Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)Sigma AldrichP5655
PronaseSigma Aldrich10165921001
Proteinase KInvitrogenAM2544
Natriumchlorid (NaCl)Sigma AldrichS7653
Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)Sigma AldrichS7907
Laichbecken mit Deckel und EinsatzAquaneeringZHCT100
SuperBlock PBSThermo Scientific37515
Superfrost +Objektträger Fisher Scientific12-550-15
Sekundenkleber Gel3M Scotch
TNT100 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl; 0,1 % Tween20; hergestellt in dH2O
TransferpipetteFisher13-711-7M
Trichloressigsäure (Cl3CCOOH)Sigma AldrichT6399
Tris BaseFisher ScientificS374-500
TritonX-100Sigma AldrichT9284
Tween20Fisher ScientificBP337-500
Ultrafeine PinzetteFisher Scientific16-100-121
Wasser, ultrarein/doppelt destilliertFisher ScientificW2-20
MABN832

Referenzen

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  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  4. van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
  5. Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
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