Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Summary

In vivo Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die zellulären Mechanismen zugrunde liegenden Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren.

Abstract

Die Entwicklung des Wirbeltiernervensystems erfordert eine präzise Koordination komplexer zellulärer Verhaltensweisen und Wechselwirkungen. Der Einsatz hochauflösender in vivo-Bildgebungstechniken kann ein klares Fenster in diese Prozesse im lebenden Organismus geben. Zum Beispiel können zellteilungsmittelteilungende Zellen und ihre Nachkommen in Echtzeit verfolgt werden, wenn sich das Nervensystem bildet. In den letzten Jahren haben technische Fortschritte in multicolor-Techniken die Arten von Fragen erweitert, die untersucht werden können. Der mehrfarbige Brainbow-Ansatz kann nicht nur verwendet werden, um zwischen gleichartigen Zellen zu unterscheiden, sondern auch mehrere verschiedene Klone verwandter Zellen, die jeweils aus einer Vorläuferzelle stammen, zu kodieren. Dies ermöglicht eine Multiplex-Linienanalyse vieler verschiedener Klone und deren Verhalten gleichzeitig während der Entwicklung. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren. Dies ist besonders nützlich für die Verfolgung zellulärer Wechselwirkungen zwischen ähnlichen Zellen, die mit traditionellen, von Einem Promoter angetriebenen Farben nur schwer differenziell zu kennzeichnen sind. Unser Ansatz kann verwendet werden, um Linienbeziehungen zwischen mehreren verschiedenen Klonen gleichzeitig zu verfolgen. Die großen Datensätze, die mit dieser Technik generiert werden, liefern umfangreiche Informationen, die quantitativ über genetische oder pharmakologische Manipulationen hinweg verglichen werden können. Letztlich können die generierten Ergebnisse helfen, systematische Fragen zu beantworten, wie sich das Nervensystem entwickelt.

Introduction

In den frühen Entwicklungsphasen teilen sich Pools spezialisierter Vorläuferzellen wiederholt in proliferativeZonen und produzieren verschiedene Arrays von Tochterzellen. Die Zellen, die während dieser Entwicklungsperiode geboren werden, werden sich dann differenzieren und reisen, um die entstehenden Organe zu bilden. Im Nervensystem führen Vorläufer wie radiale Glia zu unreifen Neuronen in ventrikulären Zonen. Wenn Neuronen von Ventrikeln wegwandern und reifen, bildet das expandierende Gewebe schließlich die hochkomplexen Strukturen des Gehirns^1,2,3,

Protocol

Verfahren, an denen tiertierische Personen beteiligt sind, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Lewis & Clark College genehmigt.

1. Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen

1. Richten Sie wilde Art, erwachsene Zebrafische in sex-getrennten Paarungtanks am Nachmittag vor der Durchführung von Mikroinjektionen^39,40.
2. Bereiten Sie die DNA-Lösung am Morgen der Mikroinjektionen vor. Verdünnung hsp:Zebrabow¹¹ Plasmid-DNA in einer Konzentration von 10 ng/l in 0,1 mM KCl, zusammen mit 2,5% Phenolrot und 3,75U Cre Re....

Results

In diesem Abschnitt werden Beispiele für Ergebnisse veranschaulicht, die mit dem hier beschriebenen mehrfarbigen Zeitraffer-Bildgebungsansatz in vivo erzielt werden können. Wir zeigen, dass Brainbow farbcodierte Klone von Zellen in der proliferativen ventrikulären Zone des sich entwickelnden Zebrafisch-Hinterhirns¹⁴ (Abbildung 1).

Wenn Brainbow-markierte Zellen entlang einer bestimmten radialen Faser angeordnet waren, teilten sie in der Reg.......

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Visualisierung von Klonen von Vorläuferzellen und Neuronen im sich entwickelnden Zebrafisch-Hindbrain und folgt ihnen in vivo mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalmikroskopie¹¹. Der große Vorteil dieses Protokolls im Vergleich zu In-vitro- oder Ex-vivo-Studien ist die Fähigkeit, die proliferative Zone des Wirbeltierhirns in seinem natürlichen Milieu im Laufe der Zeit direkt zu beobachten. Diese Technik baut auf früheren Studien auf, die einen einzelnen K.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL Transferpipette (feine Spitze)	Globe Scientific, Inc.	134020
1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)	Alfa Aesar	L06690	Verdünnt auf 0,2 mM in E3, um die Pigmentierung des Embryos zu verhindern
50 mL konische Röhrchen	Corning	352070	Zum Hitzeschocken von Embryonen
6 lb Nylon-Angelschnur	SecureLine	NMT250	Zur Herstellung von Embryomanipulatoren
7,5 mL Transferpipette	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881	Für
	Puritan	867-WC KEIN KLEBER	Zur Herstellung von Embryomanipulatoren
Cre-Rekombinase	New England Biolabs	M0298M
Digitales Trockenbad	Genemate	490016-616	Wird zur Lagerung von LMA bei 42 & Grad verwendet; C
Epifluoreszenz-Dissektionsbereich
Kapillarröhrchen aus Glas	World Precision Instruments	TW100F-4
Inkubator	Forma Scientific	3158	Zur Erhaltung von Embryonen bei 28 & Grad; C
Spritzgussformen	Adaptive Science Tools	TU-1
Isotemp Wasserbad	Fisher Scientific	2320	Für Hitzeschock-Embryonen
KCl	AMRESCO	0395	Für E3 und für DNA-Lösung für Injektionen
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss	LSM710
LE Agarose	Genemate	E3120	Zur Herstellung Agarose-Injektionsplatten
Low-Melt-Agarose (LMA)	AMRESCO	J234
Gegenbehälter	Aquaneering, Inc.
Methylenblau	Sigma	M9140	Für E3
MgSO4	Sigma	9397	Für E3
Mikromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 Tricaine-S	Western Chemical, Inc.		Stammmaterial mit einer Dosis von 4 mg/ml in Umkehrosmosewasser (RO) hergestellt und dann tropfenweise zu E3 bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM gegeben, um Embryonen zu betäuben
NaCl	J.T. Baker	4058-01	Für E3
Petrischalen (90 mm, 60 mm)	Genesee Scientific	32-107G	Zur Unterbringung von Embryonen und zur Erstellung einer Bildgebungskammer (60 mm)
	Phenolrot Sigma	P0290
Ringmarker	mit weichen StichenClover Needlecraft, Inc.	354	Zur Erstellung einer Bildgebungskammer mit Petrischale
Sekundenkleber (Ultra-Gel-Kontrolle)	Loctite	1363589	Zur Herstellung von Embryomanipulatoren Spritzennadeln
	Beckton Dickinson	BD329412	Zur Dechorionierung von Embryonen