Methodenartikel

Kombination von Laser Capture Microdissection und Microfluidic qPCR zur Analyse von Transkriptionsprofilen einzelner Zellen: Ein systembiologischer Ansatz zur Opioidabhängigkeit

DOI:

10.3791/60612

⸱

8. März 2020

 ,  ,  ,  , 
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll erklärt, wie einzelne Neuronen, Mikroglia und Astrozyten aus dem zentralen Kern der Amygdala mit hoher Genauigkeit und anatomischer Spezifität mit Laser-Capture-Mikrodissektion zu sammeln. Darüber hinaus erklären wir unsere Verwendung von mikrofluidischem RT-qPCR, um eine Teilmenge des Transkriptoms dieser Zellen zu messen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die tiefgreifende transkriptionelle Heterogenität in anatomisch angrenzenden Einzelzellen legt nahe, dass eine robuste Gewebefunktionalität durch zelluläre Phänotypvielfalt erreicht werden kann. Einzelzellige Experimente, die die Netzwerkdynamik biologischer Systeme untersuchen, zeigen zelluläre und Gewebereaktionen auf verschiedene Bedingungen bei biologisch sinnvoller Auflösung. Hierin erklären wir unsere Methoden zur Sammlung einzelner Zellen an anatomisch spezifischen Stellen und zur genauen Messung einer Teilmenge ihrer Genexpressionsprofile. Wir kombinieren Lasercapture Microdissection (LCM) mit mikrofluidischen Reverse Transkriptionsquantitativepolymerase-Kettenreaktionen (RT-qPCR). Wir verwenden diese mikrofluidische RT-qPCR-Plattform, um die mikrobielle Fülle von Darminhalten zu messen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Messung der Genexpressionsprofile einzelner Zellen hat eine umfassende phänotypische Heterogenität innerhalb eines Gewebes gezeigt. Diese Komplexität hat unser Verständnis der biologischen Netzwerke, die die Gewebefunktion steuern, erschwert. Unsere Gruppe und andere haben dieses Phänomen in vielen Geweben und Bedingungen1,2,3,4,5,6untersucht. Diese Experimente deuten nicht nur darauf hin, dass die Regulierung von Genexpressionsnetzwerken einer solchen Heterogenität zugrunde liegt, sondern auch, dass die einzellige Auflösung eine Komplexität in der Gewebefunktion offenbart, die die Gewebeauflösung nicht zu schätzen weiß. Tatsächlich kann nur eine kleine Minderheit von Zellen auf eine bestimmte Erkrankung oder Herausforderung reagieren, aber die Auswirkungen dieser Zellen auf die allgemeine Physiologie können erheblich sein. Darüber hinaus kann ein systembiologischer Ansatz, der multivariate Methoden auf hochdimensionale Datasets aus mehreren Zelltypen und Geweben anwendet, systemweite Behandlungseffekte aufklären.

Wir kombinieren LCM und mikrofluidische RT-qPCR, um solche Datensätze zu erhalten. Wir verfolgen diesen Ansatz hier im Gegensatz zur Erfassung einzelner Zellen über fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und der Verwendung von RNA-Sequenzierung (RNA-Seq), um ihr Transkriptom zu messen. Der Vorteil von LCM gegenüber FACS ist, dass die exakte anatomische Spezifität einzelner Zellen mit LCM relativ und absolut dokumentiert werden kann. Während RNA-seq mehr Funktionen messen kann, als RT-qPCR, ist der mikrofluidische RT-qPCR kostengünstiger und hat eine höhere Empfindlichkeit und Spezifität7.

In diesem repräsentativen Experiment untersuchten wir die Auswirkungen von Opioidabhängigkeit und Naltrexon-gefälltem Opioidentzug auf die neuronale, mikroglia und astrozyte Genexpression der Ratte im zentralen Kern der Amygdala (CeA) und Darmmikroflora Fülle4. Vier Behandlungsgruppen wurden analysiert: 1) Placebo, 2) Morphin, 3) Naltrexon und 4) Entzug (Abbildung 1). Wir fanden heraus, dass die Opioidabhängigkeit die Genexpression nicht wesentlich verändert, sondern dass der Opioid-Entzug die Expression entzündlicher Gene, insbesondere Tnf, induzierte. Astrozyten waren der am stärksten betroffene Zelltyp. Das Darmmikrobiom wurde durch Opioid-Entzug stark beeinflusst, wie durch eineAbnahme des Firmicutes-Zu-Bacteroides-Verhältnisses angezeigt wird, das ein etablierter Marker für Darmdysbiose8,9 ist.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Animal Care and Use Committee (IACUC) der Thomas Jefferson University und des Drexel University College of Medicine durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Thomas Jefferson University und dem Drexel University College of Medicine IACUC genehmigt.

1. Tiermodell

  1. Fügen Sie zwei 75 mg langsam freisetzende Morphinsulfat-Pellets oder zwei Placebo-Pellets subkutan bei erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten ein.
    1. Verwenden Sie ein Kleid und Handschuhe entsprechend für kleinere sterile Operationen. Rasieren Sie die Ratte dorsum mit Clippers, wenn nötig.
    2. Tragen Sie die Tierarztsalbe auf die Augen des Tieres auf. Anästhetisieren Sie die Ratte mit etwa 20 s Isofluran-Inhalation. Anästhesie wird durch Bewusstseinsverlust bestätigt.
    3. Machen Sie einen Mittellinienschnitt im Rattendorsum mit perlensterilisierter stumpfer Schere und trennen Sie die Dermis mit einer perlensterilisierten Sonde von der Körperwand. Legen Sie die Pellets unter die Dermis mit Perlensterilisierten Zangen. Den Schnitt mit einer sterilen Nadel schließen.
      HINWEIS: Das gesamte Verfahren dauert ca. 5 min pro Ratte. Für jede Ratte werden frische sterile Handschuhe verwendet.
    4. Legen Sie die Ratte in einen Isolationskäfig für die postoperative Genesung. Überprüfen Sie einen Herzschlag und einen regelmäßigen Atemrhythmus. Beobachten Sie die Ratte, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. Bewerten Sie postchirurgische Schmerzen.
    5. Bewerten Sie die Ratten 8 h Postchirurgie und alle 12 h nach für die Genesung und Infektion. Legen Sie Ratten in einen Käfig mit dem Rest der Kohorte, wenn sie vollständig von der Operation erholt sind, etwa 24 h Postchirurgie.
  2. Geben Sie eine intraperitoneale Naltrexon-Injektion (75 mg/kg) an die G- und die Entzugskohorten nach 6 Tagen Morphin-Exposition.
    ANMERKUNG: In diesem repräsentativen Experiment gab es vier Rattenkohorten (siehe Abbildung 1).

2. Probenernte

  1. Ernten Sie das Gehirn 6 Tage nach dem Einsetzen der Pellet oder 24 h nach der Naltrexon-Injektion.
    1. Legen Sie das Tier in einer Isofluran-Kammer für ca. 30 s oder bis Bewusstseinsverlust auftritt, angezeigt durch Bewegungsmangel und verminderte Atemfrequenz.
    2. Verwenden Sie eine scharfe Guillotine, um das Tier schnell zu enthaupten.
    3. Sezieren Sie das Gehirn aus dem Schädel des Tieres.
    4. Verwenden Sie einen scharfen Handrasierer, um die folgenden groben Einschnitte auf das entfernte Gehirn zu machen: Schneiden Sie zuerst das Kleinhirn ab und entsorgen Sie es. Zweitens, trennen Sie das Hirnstamm vom Vorderhirn mit einem Querschnitt. Drittens, hemisect das Vorderhirn und/oder Hirnstamm mit einem Mittellinien-Sagittal-Inzission.
    5. Legen Sie das Vorderhirn und das Hirnstamm in eine Kunststoff-Gewebeeinbettungsform mit 3-4 cm optimaler Schnitttemperaturverbindung (OCT) im Boden der Form. Bedecken Sie den Rest der Probe mit OCT.
    6. Legen Sie die Kunststoff-Gewebeeinbettungsform mit der mit OCT bedeckten Probe sofort in ein Bad mit Trockeneis und Methanol. Lassen Sie das Methanol nicht in die gewebeeinbettende Form austreten. Halten Sie die Einbettungsform mit der Hirnprobe im Methanol-Eisbad, bis die Gewebesammlung abgeschlossen ist (maximal 10-15 min).
    7. Legen Sie die Hirnprobe so schnell wie möglich in einen -80 °C-Gefrierschrank.
  2. Ernten Sie die Darmproben gleichzeitig.
    1. Nach einer schnellen Enthauptung, machen Sie einen Mittellinienschnitt in den Bauch des Tieres mit einem Skalpell.
    2. Finde das Cecum und trenne seine Verbindung zum aufsteigenden Dickdarm.
    3. Drücken Sie den Cecal-Inhalt in ein 15 ml konisches Rohr.
    4. Das konische Rohr sofort auf Trockeneis legen und so schnell wie möglich in einen -80 °C-Gefrierschrank geben.
      HINWEIS: Der Dünndarmgehalt kann auch mit den gleichen Methoden wie eine negative Kontrolle gesammelt werden.

3. Schneiden

  1. Schneiden Sie den halbveränderten Rattenvorhirn mit einem Kryostat.
    1. Entfernen Sie die Kunststoff-Einbettform mit dem Vorderhirn aus dem Gefrierschrank von -80 °C und legen Sie sie in einen -20 °C-Kryostat.
    2. Entfernen Sie die OCT-eingebettete, hemisekte Vorhirnprobe aus der Einbettform. Verwenden Sie ein Rasiermesser, um die Ecken der Kunststoffeinbettform bei Bedarf vertikal zu schneiden. Montieren Sie das Vorderhirn für rostrales bis kaudales koronales Schneiden auf einem Kryostatfutter mit OCT.
      HINWEIS: Anatomische Sehenswürdigkeiten zur Identifizierung des CeA umfassen den Optiktrakt und die Stria terminalis (Abbildung 2B). Der Optiktrakt verzweigt sich vom optischen Chiasm und verfolgt dorsal-lateral, da das Gehirn rostral bis kaudal geschnitten wird. Wenn der Optiktrakt eine Morphologie hat, die dem ähnelt, was in einem Rattenhirnatlas -2,12 mm10zu sehen ist, können Testscheiben unter dem Mikroskop betrachtet werden. Der Optiktrakt und die Stria terminalis Morphologie können in einem Rattenhirnatlas10 überprüft werden, um das Bregmäat zu identifizieren und festzustellen, ob das CeA die Stria-Terminals umgibt.
    3. Schneiden Sie 10 'm dicke koronale Abschnitte von der halbherzigen Vorhirnrostral bis kaudal, bis Abschnitte, die das CeA enthalten erreicht sind.
      HINWEIS: Die Breite und Höhe der Abschnitte beträgt ca. 200 mm.
    4. Sammeln Sie 10 m Abschnitte, die den CeA oder die bevorzugte Hirnregion enthalten, indem Sie 10 m Abschnitte auf glatten Glasgletten auftauen. Legen Sie die Glasgleitet sofort auf eine Metallpfanne, die auf Trockeneis ruht. Legen Sie die Dias mit Hirnprofilen so schnell wie möglich in einen -80 °C-Gefrierschrank.
      HINWEIS: Mehrere Slices können auf derselben Folie platziert werden. Wenn Sie einen anderen Zelltyp-Fleck für Scheiben auf demselben Dia verwenden, lassen Sie etwa 100 mm zwischen den Scheiben, sodass ein hydrophober Stift verwendet werden kann, um zelltypspezifische Antikörperlösungen auf dem Dia zu trennen. Lassen Sie etwa 20 mm vom Rand der Rutsche auf jeder Seite der Scheibe.

4. Immunfluoreszenzfärbung

  1. Färben Sie die Vorderhirnabschnitte für die Gehirnzelle Ihrer Wahl (z. B. Neuron, Mikroglia, Astrozyten usw.) mit Immunfluoreszenz.
    1. Entfernen Sie eine oder mehrere Dias mit 10 m Abschnitten des CeA aus dem Gefrierschrank -80 °C.
    2. Befestigen Sie die Dias mit 75% Ethanol für 30 s. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit.
    3. Blockieren Sie die Scheiben für 30 s mit 2% Rinderserumantigen (BSA) in 1x Phosphatpufferkochin (PBS). 1x mit PBS waschen.
    4. Fügen Sie dem Dia eine primäre Antikörperlösung für 2 min hinzu. 1x mit 2% BSA-Lösung waschen.
      HINWEIS: Die primäre Antikörperlösung besteht aus 2% primärem Antikörper, 1% RNase Out und 96% derselben BSA PBS-Lösung für den oben genannten Blockierungsschritt (Schritt 4.1.3). Das repräsentative Experiment verwendete einen Anti-NeuN-Antikörper, einen Anti-Cd11-Antikörper und einen Anti-GFAP-Antikörper in den folgenden Mengen: 3 l primär, 1,88 l RNA-Hemmer und 145,12 L BSA-Lösung.
    5. Fügen Sie die sekundäre Antikörperlösung auf die Folie für 3 min. Waschen Sie 1x mit PBS.
      HINWEIS: Die sekundäre Antikörperlösung besteht aus 1 l Ziegenanti-Maus 488 nm Fluoreszenz-Tag (1:500), 2,5 l RNA-Hemmer, 1,3 l DAPI (1:10.000) und 196,5 l mit 2% BSA.

5. Ethanol- und Xylol-Dehydrierungsserie

  1. Tauchen Sie die Dias in 75% Ethanol für 30 s. Unmittelbar danach tauchen Sie die Dias in 95% Ethanol für 30 s. Unmittelbar danach tauchen Sie die Dias in 100% Ethanol für 30 s. Unmittelbar danach tauchen Sie die Dias in einen zweiten Behälter mit 100% Ethanol für 30 s.
  2. Nach der Ethanol-Dehydrierungsserie tauchen Sie die Dias für 1 min in frisch gegossenes Xylol. Tauchen Sie die Dias unmittelbar danach für 4 min in einen zweiten Behälter mit Xylol.
  3. Entfernen Sie die Dias aus dem Xylolbad und lassen Sie die Luft im Dunkeln für 5 min trocknen.
  4. Legen Sie die Dias in einem Trockenbau für 5 min weiter trocknen.

6. Laser-Capture-Mikrodissektion

  1. Wenn sie gefärbt sind, legen Sie das Dia in das Mikroskop und finden Sie die Region von Interesse (CeA) mit anatomischen Landmarken (d. h. dem optischen Chiasm und Stria terminalis).
  2. Verwenden Sie Fluoreszenz, um den gefärbten Zelltyp und seinen Kern im Interessenbereich zu identifizieren. Wählen Sie eine Zelle oder mehrere Zellen aus, wenn Sie einzelzellgepoolte Stichproben verwenden. Markieren Sie die von Interesse sindden Zellen mit Der LCM-Software.
  3. Platzieren Sie die LCM-Kappe auf der Scheibe auf der Interessenregion.
  4. Verwenden Sie Testaufnahmen eines Infrarotlasers (IR), um die IR-Laserstärke, -größe und -dauer so einzustellen, dass der LCM-Kappenkleber nur über den Bereich der ausgewählten Einzelzelle schmilzt. Dadurch wird sichergestellt, dass keine anderen Zellen als die ausgewählten Zellen gesammelt werden.
    HINWEIS: In diesem repräsentativen Experiment wurden 10 Zellpools desselben Zelltyps als Einzelprobe verwendet, um die Zell-zu-Zell-Variabilität in der Genexpression zwischen Proben mit derselben Behandlung zu begrenzen. Diese Methode kann jedoch für echte Einzelzellexperimente verwendet werden1,3.
  5. Wählen Sie die einzelnen Zellen aus, die für die Analyse mit den LCM-Softwaretools gesammelt werden sollen (Abbildung 2C). Die ausgewählten Zellen müssen sich im anatomischen Bereich des CeA (oder der Gehirnregion der Wahl) befinden, die auf dem Hirnatlas der Ratte und dem Bregma10basiert. Die Zellen sollten mindestens 3 m von den angrenzenden gebeizten Kernen entfernt sein.
  6. Feuern Sie den IR-Laser ab, um die identifizierten Einzelzellen zu sammeln.
  7. Platzieren Sie die Kappe in der Qualitätskontrollstation (QC), und zeigen Sie sie an, um sicherzustellen, dass nur die gewünschten Zellen ausgewählt wurden. Wenn andere Zellen irrtümlich ausgewählt wurden, kann ein ultravioletter Laser verwendet werden, um die unerwünschten Zellen zu zerstören, während die Kappe in der QC-Station verbleibt.
  8. Nehmen Sie ein Foto des Gewebeabschnitts auf, von dem aus die Zelle gesammelt wurde, um ihre anatomische Spezifität zu dokumentieren. Zeichnen Sie ggf. den Abstand der Scheibe vom Bregma mit einem Rattenhirnatlas als Referenz10auf.
  9. Entfernen Sie die LCM-Kappe von der QC-Station, befestigen Sie die Probenextraktionsvorrichtung und die Pipette 5,5 l Lysepuffer an der Probe.
    ANMERKUNG: Die Lyse-Pufferlösung besteht aus 0,5 l Lyse-Enhancer und 5 l Resuspensionspuffer.
  10. Das ExtracSure-Gerät auf ein 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr aufstellen und 15 min bei 75 °C auf eine Kochplatte legen.
  11. Drehen Sie die Probe und den Lysepuffer für 30 s bei niedriger Geschwindigkeit (0,01-0,02 x g) und legen Sie die gesammelte Probe in einen -80 °C-Gefrierschrank.

7. Einzelliges mikrofluidisches RT-qPCR

  1. Vorverstärkung der einzelzelligen mRNA für 96,96 Dynamic Array Chip
    1. Kombinieren Sie die vorwärts- und rückwärts mRNA qPCR-Genprimer für alle Gene, die in einem Primerpool zur Vorverstärkung untersucht werden (500 nM Konzentration pro Primer). Zum Beispiel 1 l von 100 -M Primern in 80 l plus 120 l DNA Suspension Buffer.
      HINWEIS: Die für das repräsentative Experiment verwendeten Primersequenzen finden Sie in O'Sullivan et al.4.
    2. In einer neuen 96 x 96 PCR-Platte, fügen Sie 1 l 5x VILO zu jedem Brunnen hinzu.
    3. LCM-Einzelzellproben aus den bei -80 °C gelagerten Proben entfernen, kurz auftauen lassen, bei niedriger Geschwindigkeit (0,01-0,02 x g)kurz zentrieren und 5,5 l der lysierten Einzelzellprobe zur PCR-Platte hinzufügen. Jedes Beispiel wird zu seinem eigenen Brunnen hinzugefügt.
    4. Die PCR-Platte mit den Proben und VILO in den Thermocycler geben und bei 65 °C 1,5 min erhitzen. Drehen Sie die Platte 1 min bei 1.300 x g bei 4 °C und legen Sie die Platte auf Eis.
    5. Fügen Sie 0,15 l 10x cDNA-Synthese-Master-Mix, 0,12 L T4 Gene 32-Protein und 0,73 l DNA-Suspensionspuffer zu jedem Brunnen hinzu.
    6. Legen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie folgendes Protokoll aus: 25 °C für 5 min, 50 °C für 30 min, 55 °C für 25 min, 60 °C für 5 min, 70 °C für 10 min, 4 °C bis Ende.
    7. Fügen Sie jedem Brunnen 7,5 l Taq-Polymerase-Master-Mix hinzu.
    8. Fügen Sie jedem Brunnen 1,5 L des Primerpools (siehe oben) hinzu.
    9. Legen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie das folgende Vorverstärkungsprotokoll aus: 95 °C für 10 min, gefolgt von 22 Zyklen von 96 °C für 5 Sek., 60 °C für 4 min.
    10. Fügen Sie jedem Bohrwert 0,6 l Exonuklease-I-Reaktionspuffer 10x, 1,2 l Exonuklease I und 4,2 l DNA-Suspensionspuffer hinzu.
    11. Legen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie folgendes Protokoll aus: 37 °C für 30 min, 80 °C für 15 min.
    12. Fügen Sie jedem Bohrwert 54 L TE-Puffer hinzu. Drehen Sie die PCR-Platte bei 1.300 x g bei 5 min. Bei 4 °C lagern, wenn Sie sofort weiter zum nächsten Schritt gehen. Bei -20 °C lagern, wenn Sie mehr als 12 h auf den nächsten Schritt warten.
  2. Bereiten Sie die Probenplatte für den 96.96 Dynamic Array Chip vor.
    1. In einer neuen 96-Well-PCR-Platte fügen Sie jedem Bohrgut 0,45 l 20x DNA-Bindungsfarbstoff und 4,55 l low ROX Mastermix hinzu.
    2. Fügen Sie jedem Bohrwert 3 l vorverstärkte Probe hinzu, drehen Sie die PCR-Platte bei 1.300 x g,und legen Sie die Platte dann auf Eis.
  3. Bereiten Sie die Assay-Platte für den 96.96 Dynamic Array Chip vor.
    1. In einer neuen 96-Well-PCR-Platte fügen Sie jedem Bohrgut 3,75 l 2x GE-Assay-Ladereagenz und 1,25 l DNA-Suspensionspuffer hinzu.
    2. Fügen Sie jedem entsprechenden Brunnen 2,5 l von 10 m qPCR-Grundierung hinzu. Drehen Sie die PCR-Platte bei 1.300 x g für 5 min.
  4. Laden und führen Sie den 96.96 Dynamic Array Chip aus.
    1. Prime den Chip mit Steuerleitung Flüssigkeit.
    2. Platzieren Sie den Chip in einem IFC Controller HX, und führen Sie das Prime (136X)-Skript aus.
    3. Fügen Sie 6 l der Probe von der PCR-Probenplatte in die entsprechenden Probenbohrungen im 96.96 Dynamic Array Chip ein.
    4. Fügen Sie 6 l der Probe von der PCR-Assayplatte in die entsprechenden Assay-Brunnen im 96.96 Dynamic Array Chip ein.
    5. Verwenden Sie Nadeln, um alle Luftblasen in den Brunnen des 96.96 Dynamic Array Chip zu knallen.
    6. Platzieren Sie den 96.96 Dynamic Array Chip im IFC Controller HX, und führen Sie das Load Mix (136x)-Skript aus.
    7. Entfernen Sie den Chip vom IFC Controller HX, ziehen Sie den Schutzaufkleber ab und legen Sie den 96.96 Dynamic Array Chip in eine mikrofluidische RT-qPCR-Plattform. Führen Sie das GE Fast 96 x 96 PCR-Protokoll (30 Zyklen) aus.
      HINWEIS: Die RNA-Qualität und Gültigkeit der Ergebnisse werden mit mehreren Methoden bewertet, einschließlich der Assay-Validierung über Gelelektrophorese, Schmelztemperaturkurven, Proben- und Assay-Replikationen und Standard-Verdünnungsseriendiagrammen. Zusätzlich können Transkriptionsergebnisse durch unabhängige Methoden zur Hirnhalbsektion validiert werden, einschließlich Western Blot und Immunfluoreszenz-Assays.

8. Messung der bakteriellen Fülle mit mikrofluidischem RT-qPCR

  1. Extrahieren Sie die bakterielle DNA nach den Anweisungen des Stuhl-DNA-Extraktionskits.
  2. Schätzen Sie die bakterielle DNA-Konzentration mit qPCR.
  3. Fügen Sie die extrahierte bakterielle DNA zu einer neuen PCR-Platte hinzu. Fügen Sie 1 l extrahierte bakterielle DNA und 9 L DNA Suspension Puffer hinzu.
  4. Vorbereiten der Assay-Platte für den 48.48 Dynamic Array Chip (siehe Schritte 7.2.1-7.2.2)
  5. Vorbereitung der Probenplatte für den 48.48 Dynamic Array Chip (siehe Schritte 7.3.1-7.3.2)
    1. In einer neuen 96-Well-PCR-Platte fügen Sie 48 Bohrungen 0,45 l 20x DNA-Bindungsfarbstoff und 4,55 l low ROX Mastermix hinzu.
    2. Fügen Sie 3 l der Probe von der PCR-Platte, die die bakterielle DNA enthält, in die 48 Brunnen und drehen Sie die PCR-Platte bei 1.300 x g für 5 min. Bei 4 °C lagern.
  6. Laden und ausführen Sie den 48.48 Dynamic Array Chip (siehe Schritte 7.4.1-7.4.7).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Auswahl der einzelnen Zellen wurde sowohl visuell als auch molekular validiert. Optisch wurde die zelluläre Morphologie vor der Zellsammlung betrachtet. Die gesammelten Zellen wurden dann an der QC-Station betrachtet und der Zellkernfleck (DAPI) überlappte sich mit der einzelligen Selektionsmarkerfluoreszenz. Abbildung 2A zeigt repräsentative Bilder einer Folie mit einem halbherektierten Rattenvorhirn, das das CeA enthält. Nachfolgende Bi...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Einzelzellbiologie hat die Heterogenität zellulärer Phänotypen und die Robustheit der Gewebefunktion nachgewiesen. Diese Ergebnisse haben Einblicke in die Organisation biologischer Systeme sowohl auf Makro- als auch auf Mikroserskala gegeben. Hier beschreiben wir die Kombination von zwei Methoden, LCM und mikrofluidische qPCR, um einzellige Transkriptom-Maßnahmen zu erhalten, die anatomische Spezifität und Transkriptionsgenauigkeit zu relativ niedrigen Kosten bieten (Abbildung 1). Unsere...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier vorgestellten Arbeiten wurden durch die NIH HLB U01 HL133360 an JS und RV, NIDA R21 DA036372 an JS und EVB und T32 AA-007463 an Jan Hoek zur Unterstützung von SJO'S verliehen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
20X DNA-BindungsfarbstoffFluidigm100-7609NA
2x GE Assay Loading ReagenzFluidigm85000802-RNA
48.48 Dynamic Array IFC für GenexpressionFluidigmBMK-M-48.48NA
96.96 Dynamic Array IFC für GenexpressionFluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-CD11β AntikörperGenway BiotechCCEC48Mikroglia-Färbung
Anti-NeuN Antikörper, Klon A60EMD MilliporeMAB377Neuronale Färbung
ArcturusXT Laser Capture MikrodissektionssystemArcturusNA
NA Biomark HDFluidigmNART-qPCR-Plattform
Rinderserum-AntigenSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher ScientificLCM0211NA
CellDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher Scientific11753500Komponenten der Lysepufferlösung
DAPIThermoFisher Scientific62248Nucleus Stain
DNA Suspension BufferTEKnovaT0221
Exonuclease INeu Englnad BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure ProbenextraktionsgerätThermoFisher ScientificLCM0208NA
Fisherbrand Superfrost Plus ObjektträgerThermoFisher Scientific22-037-246Objektträger aus Normalglas
GeneAmp Dünnwandiges ReaktionsröhrchenThermoFisherScientific N8010611
GFAP Monoklonaler AntikörperThermoFisher ScientificA-21294Astrozyten-Fleck
Ziege Anti-Maus IgG (H+L), superklonal™ Rekombinanter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA28175Seconadry Antikörper
IFC ControllerFluidigmNA
NA RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix mit Low RoxBio-RadPN 172-5211Rox Master
Mix SuperScript VILO cDNA Synthese KitThermoFisher Wissenschaftliches11754250enthält VILO und SuperScript
T4-Gen-32-ProteinNew Englnad BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp MasterMix ThermoFisher Scientific4391128NA
TE PufferTEKnovaT0225NA

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
  2. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
  3. Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).
  4. O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).
  5. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
  6. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
  7. SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
  8. Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
  9. Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
  10. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Einzelzellanalysetranskriptionelle Profilierungzentraler Kern der AmygdalaGenexpressionmikrofluidische RT PCRZellisolationGewebeschnitt

Verwandte Artikel