Dieses Protokoll erklärt, wie einzelne Neuronen, Mikroglia und Astrozyten aus dem zentralen Kern der Amygdala mit hoher Genauigkeit und anatomischer Spezifität mit Laser-Capture-Mikrodissektion zu sammeln. Darüber hinaus erklären wir unsere Verwendung von mikrofluidischem RT-qPCR, um eine Teilmenge des Transkriptoms dieser Zellen zu messen.
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Methodenartikel
Kombination von Laser Capture Microdissection und Microfluidic qPCR zur Analyse von Transkriptionsprofilen einzelner Zellen: Ein systembiologischer Ansatz zur Opioidabhängigkeit
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die tiefgreifende transkriptionelle Heterogenität in anatomisch angrenzenden Einzelzellen legt nahe, dass eine robuste Gewebefunktionalität durch zelluläre Phänotypvielfalt erreicht werden kann. Einzelzellige Experimente, die die Netzwerkdynamik biologischer Systeme untersuchen, zeigen zelluläre und Gewebereaktionen auf verschiedene Bedingungen bei biologisch sinnvoller Auflösung. Hierin erklären wir unsere Methoden zur Sammlung einzelner Zellen an anatomisch spezifischen Stellen und zur genauen Messung einer Teilmenge ihrer Genexpressionsprofile. Wir kombinieren Lasercapture Microdissection (LCM) mit mikrofluidischen Reverse Transkriptionsquantitativepolymerase-Kettenreaktionen (RT-qPCR). Wir verwenden diese mikrofluidische RT-qPCR-Plattform, um die mikrobielle Fülle von Darminhalten zu messen.
Einleitung
Die Messung der Genexpressionsprofile einzelner Zellen hat eine umfassende phänotypische Heterogenität innerhalb eines Gewebes gezeigt. Diese Komplexität hat unser Verständnis der biologischen Netzwerke, die die Gewebefunktion steuern, erschwert. Unsere Gruppe und andere haben dieses Phänomen in vielen Geweben und Bedingungen1,2,3,4,5,6untersucht. Diese Experimente deuten nicht nur darauf hin, dass die Regulierung von Genexpressionsnetzwerken einer solchen Heterogenität zu....
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Protokoll
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Animal Care and Use Committee (IACUC) der Thomas Jefferson University und des Drexel University College of Medicine durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Thomas Jefferson University und dem Drexel University College of Medicine IACUC genehmigt.
1. Tiermodell
- Fügen Sie zwei 75 mg langsam freisetzende Morphinsulfat-Pellets oder zwei Placebo-Pellets subkutan bei erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten ein.
- Verwenden Sie ein Kleid und Handschuhe entsprechend für kleinere sterile Operationen. Rasieren Sie die Ratte dorsum mit Clippers, wenn nötig.
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Ergebnisse
Die Auswahl der einzelnen Zellen wurde sowohl visuell als auch molekular validiert. Optisch wurde die zelluläre Morphologie vor der Zellsammlung betrachtet. Die gesammelten Zellen wurden dann an der QC-Station betrachtet und der Zellkernfleck (DAPI) überlappte sich mit der einzelligen Selektionsmarkerfluoreszenz. Abbildung 2A zeigt repräsentative Bilder einer Folie mit einem halbherektierten Rattenvorhirn, das das CeA enthält. Nachfolgende Bi.......
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Diskussion
Die Einzelzellbiologie hat die Heterogenität zellulärer Phänotypen und die Robustheit der Gewebefunktion nachgewiesen. Diese Ergebnisse haben Einblicke in die Organisation biologischer Systeme sowohl auf Makro- als auch auf Mikroserskala gegeben. Hier beschreiben wir die Kombination von zwei Methoden, LCM und mikrofluidische qPCR, um einzellige Transkriptom-Maßnahmen zu erhalten, die anatomische Spezifität und Transkriptionsgenauigkeit zu relativ niedrigen Kosten bieten (Abbildung 1). Unsere.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die hier vorgestellten Arbeiten wurden durch die NIH HLB U01 HL133360 an JS und RV, NIDA R21 DA036372 an JS und EVB und T32 AA-007463 an Jan Hoek zur Unterstützung von SJO'S verliehen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 20X DNA-Bindungsfarbstoff | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagenz | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC für Genexpression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC für Genexpression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-CD11β Antikörper | Genway Biotech | CCEC48 | Mikroglia-Färbung |
| Anti-NeuN Antikörper, Klon A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronale Färbung |
| ArcturusXT Laser Capture Mikrodissektionssystem | Arcturus | NA | |
| NA Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR-Plattform |
| Rinderserum-Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Komponenten der Lysepufferlösung |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | Neu Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Probenextraktionsgerät | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Objektträger aus Normalglas |
| GeneAmp Dünnwandiges Reaktionsröhrchen | ThermoFisher | Scientific N8010611 | |
| GFAP Monoklonaler Antikörper | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrozyten-Fleck |
| Ziege Anti-Maus IgG (H+L), superklonal™ Rekombinanter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antikörper |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | |
| NA RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix mit Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox Master |
| Mix SuperScript VILO cDNA Synthese Kit | ThermoFisher Wissenschaftliches | 11754250 | enthält VILO und SuperScript |
| T4-Gen-32-Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master | Mix ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Puffer | TEKnova | T0225 | NA |
Referenzen
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
